人类卵子生成受精及早期胚胎发育异常的遗传学研究进展完整版.docx

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人类卵子生成受精及早期胚胎发育异常的遗传学研究进展完整版

2020人类卵子生成、受精及早期胚胎发育异常的遗传学研究进展（完整版）

摘要

成功的繁殖需要配子成熟、受精和早期胚胎发育。

卵母细胞成熟包括一系列形态学和分子学变化，经历生发泡期、减数分裂I中期和减数分裂II中期（MⅡ）。

而后精子与MⅡ期的卵母细胞融合，启动胚胎发育，逐步形成各种器官及组织。

因此，卵母细胞发育过程中任何一个步骤失败都会导致不孕。

然而，人类卵母细胞发育停滞的遗传学病因大多仍不甚清楚。

母源RNA和蛋白质对维持正常的胚胎早期发育至关重要。

皮质下母源复合体组分基因及其他特定基因的突变与临床上一些体外受精/卵胞质内单精子注射（IVF/ICSI）反复失败的女性不孕症相关。

本文结合近期研究就人类卵子生成、受精及早期胚胎发育异常的遗传学基础进行简要综述。

【关键词】 卵母细胞；卵母细胞发育停滞；女性不孕；遗传学

DOI：

10.3760/101441-20191112-00506.

成功的繁殖需要配子成熟、受精和早期胚胎发育。

卵母细胞成熟包括一系列形态学和分子学变化，经历生发泡期（germinalvesicle，GV）、减数分裂Ⅰ中期（metaphaseⅠ，MI）和减数分裂Ⅱ中期（metaphaseⅡ，MII）。

人类卵母细胞发育过程中共有两次生理性停滞。

卵母细胞第一次发育停滞发生在减数分裂Ⅰ前期，直至青春期在促黄体生成素的刺激下恢复减数分裂。

卵母细胞经过减数分裂Ⅰ形成纺锤体和第一极体后，停滞在MⅡ期直至受精，而后精子与MⅡ期的卵母细胞融合，启动胚胎发育，逐步形成各种器官组织。

因此，卵母细胞发育过程中任何一个步骤失败都会导致不孕。

在全球范围内，不孕症影响至少1.86亿人口［1］，8%~12%的育龄期夫妇患有不孕症［2］。

辅助生殖技术（assistedreproductivetechnology，ART）通过体外受精（invitrofertilization，IVF）和卵胞质内单精子注射（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）使成熟卵母细胞与精子受精，从而有效治疗不孕症。

自1978年第一个试管婴儿诞生以来，通过ART受孕的人数增长速度远远快于预期，目前已达到数百万人，接近世界总人口的0.1%［3］。

尽管ART的成功率很高，许多夫妇尝试IVF/ICSI还是反复失败。

在20世纪90年代初，一位患有原发性不孕的女性在尝试IVF和ICSI反复失败后被诊断为第一例卵母细胞发育停滞［4］，一些相似的病例随后被报道［5-8］。

虽然研究者已经检测到了许多导致鼠卵母细胞发育停滞的基因突变［9-13］，但是人类卵母细胞发育停滞的遗传学病因大多仍不甚清楚。

母源RNA和蛋白质对维持正常的胚胎早期发育至关重要。

受精后，随着母源RNA和蛋白质逐渐降解，胚胎合子基因激活调控胚胎发育。

皮质下母源复合体（subcorticalmaternalcomplex，SCMC）是一系列母源蛋白质组成的复合体，包括至少6种蛋白质：

TLE6、KHDC3L、PADI6、OOEP、NLRP5和NLRP7［14-17］。

SCMC组分基因及其他特定基因的突变与临床上一些IVF/ICSI反复失败的女性不孕症相关。

本文结合近期研究就人类卵子生成、受精及早期胚胎发育异常的遗传学基础进行简要综述。

一.

卵子生成、受精异常的相关基因

1.卵母细胞成熟障碍

（1）TUBB8：

微管是由α-微管蛋白和β-微管蛋白多肽组装而成的动态聚合物。

人类共有9种β-微管蛋白同型，包括TUBB1、TUBB2a、TUBB2b、TUBB3、TUBB4a、TUBB4b、TUBB5、TUBB6和TUBB8，其中TUBB1、TUBB2a、TUBB3、TUBB4a和TUBB4b突变被发现与异常神经元迁移有关。

TUBB8是一种特殊的仅存在于灵长类中的特殊β-微管蛋白同型。

有丝分裂和减数分裂的纺锤体均由微管组成。

近期研究表明TUBB8是人类卵母细胞纺锤体中主要的β-微管蛋白同型，TUBB8突变会导致人卵母细胞发育停滞［18］。

在130例由于卵母细胞或胚胎问题导致IVF/ICSI反复失败的患者中，TUBB8突变占据了35.4%［19］。

目前研究者在卵母细胞发育停滞的不孕女性病例中共发现47种TUBB8突变，包括纯合/杂合/复合杂合错义/无义突变、移码/非移码缺失以及整个基因缺失［18-25］（表1）。

TUBB8不同的突变会导致卵母细胞或胚胎不同的表型，包括MI期卵母细胞发育完全停滞、PB1卵母细胞不能受精、早期胚胎停滞和胚胎移植失败［19-20］。

进一步研究显示TUBB8突变会造成蛋白质体外折叠异常，影响α/β-微管蛋白二聚体的形成，破坏体外培养细胞的微管网络，改变酵母的微管动力学，使小鼠及人卵母细胞纺锤体组装异常，从而引起卵母细胞发育停滞［22］。

（2）PATL2：

PATL2是酿酒酵母pat1的同源物，是一种mRNA结合蛋白（mRNA-bindingprotein，mRNP），与Xp54、Xrap55、CPEB等其他mRNP相联系［26］。

在卵母细胞发育过程中，大部分合成的mRNA被立即翻译以支持卵母细胞的发育，但高达30%的mRNA被储存起来用于之后的翻译、减数分裂恢复或早期受精卵发育［27］，mRNP起到控制这些mRNA稳定性的作用。

PATL2在人和小鼠卵母细胞中表达，且在初级卵泡期就开始表达，而在GV晚期表达减少。

在PATL2基因敲除的小鼠模型中，一些与卵母细胞成熟和早期胚胎发育相关的基因表达被解除了调控，导致雌性小鼠卵母细胞和胚胎发育缺陷，生育力降低［28］。

PATL2能抑制卵母细胞mRNA翻译，在爪蟾卵母细胞中过表达PATL2会导致卵母细胞发育停滞［26］。

目前已有5项研究在IVF/ICSI反复失败的不孕女性病例中发现PATL2双等位基因突变［28-32］（表2）。

研究表明PATL2突变能在不同程度上降低PATL2的表达，导致不同的临床表型，包括卵母细胞GV期停滞，MI期停滞，受精失败和早期胚胎停滞。

在卵母细胞中减少的PATL2可能会干扰翻译抑制，并以不适时的方式激活下游合成蛋白合成物，从而导致观察到的临床表型［29］。

进一步研究表明PATL2突变会产生截短的蛋白或PATL2完全不表达。

截短的蛋白仅包含不到三分之一的完整氨基酸序列，尤其缺乏拓扑异构酶II相关蛋白pat1结构域［28］。

该结构域是所有pat1蛋白所共有的，已经被证明是其同种异型PATL1与其他伴侣相互作用所必需的结构［33］。

（3）WEE2：

WEE2又称Wee1B，属于WEE蛋白激酶家族，是一种重要的卵母细胞特异性激酶。

成熟促进因子（maturation-promotingfactor，MPF）由细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc2和调节性细胞周期蛋白cyclinB组成，发挥阻断卵母细胞离开MII期的作用。

WEE2通过介导Cdc2磷酸化抑制Cdc2，从而使MPF失活。

WEE2在GV期和MII期对小鼠卵母细胞有不同的作用。

在GV期，WEE2通过抑制Cdc2抑制MPF，维持减数分裂停滞。

在MII期，WEE2通过抑制Cdc2促进卵母细胞离开MII期和原核形成。

WEE2下调的小鼠卵母细胞具有高MPF活性，导致受精卵原核形成失败，雌性小鼠不孕［34］。

与WEE2下调小鼠相似，一些IVF/ICSI反复失败的不孕女性患者的受精卵无法形成双原核或形成双原核后降解导致受精失败。

目前已有6项研究在这些不孕女性病例中发现WEE2基因突变［35-40］（表3）。

先前的研究表明，WEE2的丝氨酸磷酸化也是小鼠卵母细胞活化所必需的，是成功受精的基础［34］。

WEE2基因突变降低了WEE2蛋白的数量，并损害了WEE2和Cdc2的磷酸化，导致受精失败。

Sang等［35］通过将WEE2-cRNA注入WEE2突变的不孕女性患者的卵母细胞，在体外成功受精，形成了囊胚，探索了一种潜在的治疗方法。

（4）PANX1：

PANX1是泛连接蛋白家族成员之一，是一种通道蛋白。

PANX1通道是一个主要的ATP释放和核苷酸渗透通道。

它可以被细胞外K+、细胞内Ca2+、ATP、电压变化或机械刺激激活或抑制。

PANX1有许多糖基化位点，并有三种糖基化状态：

非糖基化蛋白（GYL0）、高甘露糖糖蛋白（GLY1）和完全成熟糖蛋白（GYL2）。

因为PANX1在绝大多数人类细胞中都有表达，所以PANX1通道与许多疾病密切相关。

然而PANX1基因敲除小鼠能够存活和繁衍，并没有明显的表型［41-44］。

研究显示PANX1纯合突变（c.G650A：

p.R217H）与多系统功能障碍有关，但是突变与临床表现之间的因果关系无法确定［45］。

最近，Sang等［46］在四个独立家系的不孕女性病例中检测到一种以卵母细胞在受精前后死亡为表现的特殊表型，将其命名为卵母细胞死亡，并通过全外显子测序发现了四种不同类型的PANX1突变，包括杂合突变c.C1174T：

p.Q392*、c.A1036G：

p.K346E、c.G1040C：

p.C347S和c.61-69delACGGAGCCC：

p.21_23delTEP。

进一步研究表明PANX1突变会改变PANX1糖基化模式，导致GLY2缺乏，而异常糖基化的GLY1保留。

突变激活了PANX1通道，导致异常的ATP释放，从而造成卵母细胞死亡［46］。

与先前的研究一致［41-44］，四种点突变的小鼠模型均是可育的，研究者猜测PANX1在人卵与鼠卵表达差异可能是小鼠模型无不孕表型的原因，并通过制作相应卵子特异高表达突变鼠模型再现了卵子死亡，展示出PANX1表达水平在人卵与鼠卵中存在差异，是点突变鼠无表型的原因［46］。

（5）透明带糖蛋白1，2，3（zonapellucidaglycoprotein1，2，3，ZP1，2，3）：

ZP是一层平均厚度为17μm的包围卵母细胞的糖蛋白基质［47］。

ZP对卵母细胞的早期发育、受精（配子识别和防止多精受精）和早期胚胎着床前的保护至关重要。

小鼠ZP由ZP1、ZP2和ZP3组成，ZP1交叉连接ZP2-ZP3二聚体。

与小鼠ZP结构类似，人类ZP由四种糖蛋白组成：

ZP1、ZP2、ZP3和ZP4。

ZP1基因敲除小鼠卵母细胞ZP松散且肿胀，雌性小鼠繁殖力下降［48］。

ZP2或ZP3基因敲除小鼠卵母细胞无ZP，雌性小鼠不孕［49-50］。

研究显示，人ZP1纯合移码突变会导致卵母细胞无ZP或完全无卵母细胞，女性不孕［51-54］（表4）。

突变会产生截短的缺乏C-末端结构域的ZP1蛋白，可能导致ZP1与其他ZP蛋白在细胞内螯合，阻碍了它们向细胞外运输，从而无法形成ZP［51］。

异常ZP可能导致颗粒细胞异位定位，卵母细胞与颗粒细胞之间产生更加紧密的缝隙连接［53］。

ZP2纯合突变会导致卵母细胞产生一个薄的ZP，精子结合、穿透发生障碍，女性患者IVF反复失败［52，55-56］。

ZP2突变蛋白不会分泌到卵母细胞表面，导致ZP仅由另外三种ZP蛋白组成，从而形成一个薄而有缺陷的ZP［55］。

ZP3杂合错义突变会导致卵母细胞降解和空卵泡综合征［52，56-57］。

ZP3突变蛋白可能与野生型ZP3蛋白竞争，与其他ZP蛋白结合，阻碍正常ZP1-ZP3、ZP2-ZP3、ZP3-ZP4异二聚体的组装，导致正常异二聚体数量不足，因此无法构建围绕患者卵母细胞的有序稳定的ZP［52］。

2.卵巢发育不全（OD）与早发型卵巢功能不全（POI）

OD患者的卵巢由纤维组织构成，表现为原发性闭经，第二性征发育不良，女性不孕。

研究显示OD患者存在FSHR、BMP15、NR5A1、PSMC3IP［58］、MCM9［59］等基因突变。

POI患者表现为在40岁之前持续性闭经，血浆促性腺激素水平升高，女性不孕。

POI患者在许多影响卵巢功能的关键基因中存在杂合突变，包括BMP15、GDF［60］、NR5A1［61］、FMR1［62］、NOBOX［63］、STAG3、HFM1、SYCE1、MCM8、MCM9、FIGLA、SOHLH1、SCM1β、REC8、LHX8、FOXL2、GALT［64］等。

二.

早期胚胎发育异常的相关基因

1.早期胚胎发育停滞

（1）断裂转导蛋白样增强子6（transducin-likeenhancerofsplit6，TLE6）：

TLE6属于GeCHO/TLE转录共抑制因子家族，最初作为E2A肝白血病因子的靶标被发现，在小鼠胚胎和成年小鼠组织中广泛表达［65］。

在神经祖细胞中，TLE6通过与TLE1竞争性结合脑因子-1（brainfactor-1，BF-1）抑制TLE1的功能［66］。

TLE6在新生小鼠的卵巢中高度表达。

近期研究表明TLE6和OOEP、NLRP5、KHDC3L是构成小鼠卵母细胞和早期胚胎SCMC最重要的4个蛋白组分。

TLE6与OOEP、NLRP5相互作用，而KHDC3L则独立与NLRP5连接。

虽然TLE6基因敲除的小鼠模型可以排卵和受精，但是TLE6缺失会导致胚胎在卵裂期发育停滞，雌性小鼠不孕。

其机制可能是TLE6缺失干扰SCMC形成，不利于F-肌动蛋白细胞骨架的生成，导致细胞不对称分裂和卵裂期胚胎死亡［67］。

TLE6磷酸化受cAMP依赖蛋白激酶A（proteinkinaseA，PKA）调控。

抑制PKA会导致卵母细胞被阻断在减数分裂II期，卵母细胞成熟失败，且在此过程中TLE6是PKA的主要底物［68］。

TLE6突变是最早发现的导致胚胎致死表型的人类SCMC基因突变。

TLE6突变是导致女性不孕的罕见原因之一。

Alazami等［69］最早发现TLE6纯合突变（c.C1529A：

p.S510Y）存在于女性反复IVF/ICSI失败的病例中。

Wang等［70］随后在1例乌克兰的不孕女性病例中发现TLE6纯合突变（c.1133delC：

p.A378Efs*75）。

这些患者的表型与基因敲除小鼠相似。

患者的排卵正常，但是胚胎在卵裂期发育终止，导致不孕。

胚胎在经历第一次卵裂的过程中有一个持久的延迟，即便经过第一次卵裂的胚胎最终也会破裂，无法形成桑椹胚。

进一步研究表明TLE6突变会影响PKA磷酸化TLE6，还会降低其与其他SCMC组分蛋白如OOEP、KHDC3L的相互作用，从而导致胚胎在卵裂期发生严重延迟［69］。

（2）肽酰基精氨酸脱亚胺酶6（peptidylargininedeiminase6，PADI6）：

PADI家族包括参与瓜氨酸化过程的钙依赖性酶，由PADI1、PADI2、PADI3、PADI4和PADI6等5个成员组成，其中PADI1、PADI2、PADI4和PADI6主要分布于女性生殖器官，PADI6特殊地分布于卵母细胞和早期胚胎。

PADI6编码组成SCMC的蛋白质，对促进小鼠2-细胞期胚胎发育进展尤为重要。

PADI6基因敲除小鼠胚胎在2-细胞期发育停滞，导致雌性小鼠不孕。

研究表明PADI6-/-小鼠早期胚胎停滞受到合子期基因激活（zygoticgeneactivation，ZGA）的影响。

在PADI6-/-小鼠的2-细胞胚胎中，ZGA的标志物RNA聚合酶II的磷酸化水平显著降低，提示在这些小鼠中ZGA存在缺陷［71］。

ZGA是母源基因向合子期基因调控胚胎过渡的过程，对建立全能性和维持正常胚胎发育至关重要。

在动物实验中，ZGA抑制会导致胚胎形态学缺陷，早期发育停滞，最终导致不孕或减产［72］。

进一步研究表明PADI6-/-小鼠的卵母细胞缺乏一种称为细胞质晶格（cytoplasmiclattices，CPL）的特殊细胞骨架结构，因此具有异常的细胞器定位和再分配，核糖体和mRNA的数量减少，从而影响蛋白质合成和胚胎基因组激活［71］。

Xu等［73］最早在IVF/ICSI周期中反复出现早期胚胎发育停滞的不孕女性病例中发现PADI6纯合突变（c.C1141T：

p.Q381*）和复合杂合突变（c.2009_2010del：

p.E670Gfs*48；c.T633A：

p.H211Q；c.G1618A：

p.G540R；c.C970T：

p.Q324*）。

随后研究者们在相似病例中发现更多PADI6突变类型，包括PADI6纯合突变（c.1369C>T：

p.R457*［74］；c.1124dupT：

p.L375Ffs*13［70］）和复合杂合突变（c.C866T：

p.P289L；c.C1895T：

p.P632L［70］）。

在目前的研究中，PADI6突变患者的大多数胚胎与基因敲除小鼠相似，在2~5-细胞期停止发育，磷酸化RNA聚合酶II的数量和少数参与转录激活的基因的表达水平显著降低，提示胚胎中的ZGA受损［73］。

研究显示PADI6等位基因不同突变亦会导致复发性葡萄胎［75］。

（3）核苷酸结合寡聚化结构域样受体（NOD-likereceptor，NLR）蛋白2，5（NLRfamilypyrindomaincontaining2，5，NLRP2，NLRP5）：

NLR是一类在细胞质中表达的模式识别受体，在先天性免疫系统中起着关键作用。

NLRP蛋白家族是NLR蛋白家族的一个亚群，由14个成员组成。

NLRP蛋白在卵巢和卵母细胞中高水平表达，对生殖和早期胚胎发育具有重要作用。

NLRP2和NLRP5都是SCMC的成员。

NLRP2控制与年龄相关的母源性生育力，NLRP2的缺失会导致雌性小鼠繁殖力下降，胚胎在2-细胞期停止发育，4-细胞期和桑椹期胚胎的数量显著减少［76］。

NLRP5对母猪的早期胚胎发育尤为重要［77］。

NLRP5基因敲除的雌性小鼠不孕［16］。

Mu等［78］在早期胚胎发育停滞导致的IVF/ICSI反复失败的不孕女性病例中检测到NLRP2或NLRP5存在双等位基因突变（表5）。

突变导致NLRP2、NLRP5蛋白量下降，产生不稳定的蛋白，可能进一步影响SCMC的稳定性和功能，从而导致早期胚胎发育停滞［78］。

先前的研究发现母亲NLRP2、NLRP5突变与子代BWS、MLID相关［79-80］，但是在Mu等［78］的研究病例和NLRP2突变的可育对照中也有子女健康，未患有MLID的例子，因此NLRP2、NLRP5突变与BWS、MLID的相关性还有待进一步研究。

2.葡萄胎与复发性流产

（1）葡萄胎：

葡萄胎是另一种早期胚胎发育停滞的形式。

NLRP7属于NLRP蛋白家族，也是SCMC的成员。

NLRP7突变最初发现于有复发性葡萄胎病史的女性病例［81］。

患者胚胎发育停滞，滋养细胞过度增生。

随后的研究表明大多数的复发性葡萄胎由NLRP7突变引起。

NLRP7与KHDC3L具有相似的生物学特性。

因此，NLRP7可能和KHDC3L在人类卵子生成和早期胚胎发生过程中作为卵母细胞复合体的组成部分相互作用，决定卵母细胞基因组的表观遗传状态［82］。

KHDC3L也称ECAT1或C6orf221，属于一个真兽类哺乳动物特有的快速进化的基因家族，主要在卵母细胞或早期胚胎特异性表达。

该家族的其他成员还有含KHRNA结合结构域分子1（KHdomaincontaining1，KHDC1），多潜能性维持因子5（developmentalpluripotencyassociated5，DPPA5）和卵母细胞表达蛋白（oocyteexpressedprotein，OOEP）。

它们的结构特征是都有一个可以与RNA结合的N末端的KH结构域。

KHDC3L是SCMC的一员。

KHDC3L缺失的雌性小鼠由于有丝分裂纺锤体功能障碍和染色体非整倍体而导致胚胎存活率降低［17］。

在猴胚胎，KHDC3L表达持续保持在较高水平直至E14原肠胚形成，提示KHDC3L可能在移植后胚胎发育中起作用［83］。

KHDC3L基因突变导致女性葡萄胎及反复流产［82，84］。

Wang等［70］在1例早期胚胎发育停滞导致IVF/ICSI反复失败的不孕女性病例中发现了KHDC3L纯合移码突变c.44delA：

p.Q15Rfs*25。

患者ICSI后形成的胚胎正常受精，但在桑椹胚期停止。

进一步研究表明KHDC3L保护早期胚胎细胞的基因组稳定性和生存能力。

KHDC3L基因突变会导致严重的基因组异常和早期胚胎细胞凋亡［82］。

（2）复发性流产：

研究表明有相当比例的复发性流产可能与单基因异常有关。

与RPL相关的基因突变涉及许多方面，包括凝血（F2、F5［85］、ANXA5［86］、THBD、FGA［87］）、纺锤体检查点（SYCP3［88］、AURKB［89］）、细胞黏附（TRO、CDH11、CDH1）、细胞外基质重塑（MMP10、MMP9、COL6A3、ADAMTS1、TNC）、血管生成（FLT1、EPAS1）、细胞增殖、分化、迁移、凋亡（LIFR、FGFR2、BMP7）、代谢（AMN）、免疫功能调节（IDO2、CR1、TLR3、TRAF3IP1）和类固醇核受体激活（NCOA1）［87］等。

三.

总结与展望

目前研究显示TUBB8、PATL2、WEE2、PANX1、ZP1、ZP2、ZP3、TLE6、PADI6、NLRP2、NLRP5、KHDC3L等基因突变导致人类卵子生成、受精及早期胚胎发育异常，女性不孕，尝试IVF/ICSI反复失败。

对人类卵子生成、受精及早期胚胎发育异常的遗传学研究有助于理解控制人类早期发育的基本生物学过程，通过发现致病基因揭示了导致不孕症的遗传因素及其致病机制，为未来疾病的靶向治疗奠定基础。

上述基因的突变筛查不仅可以作为卵母细胞及早期胚胎发育停滞的遗传学诊断标志，还可以用来评估患者卵母细胞的质量，预测IVF/ICSI结局。

突变筛查可以使患者及其家庭免于IVF/ICSI反复失败所带来的经济和情感上的压力。

对于有生育需求的夫妇，使用捐赠的卵子可能是另一种选择。

然而，目前的研究在发现突变基因的基础上，确切的分子机理仍有待进一步研究。

可用于筛查的样本量及可用于实验的人类卵母细胞的缺乏也一定程度上限制了研究。