酶工程考试重点.docx

酶工程考试重点.docx

《酶工程考试重点.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《酶工程考试重点.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

酶工程考试重点

第二章微生物发酵产酶

名词解释

酶生物合成的诱导作用：

加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象

酶生物合成的反馈阻遏作用：

又称产物阻遏作用，是指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象

分解代谢物阻遏作用：

是指某些物质（主要是指葡萄糖和其他容易利用的碳源等）经过分解代谢产生的物质阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象

判断组成酶or诱导酶受什么阻遏

固定化细胞：

又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞，指采用各种方法固定在载体上，在一定的空间范围进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞

固定化原生质体：

是指固定在载体上，在一定的空间范围内进行新陈代谢的原生质体

原生质体：

是除去细胞壁后由细胞膜及包内物质组成的微球体。

原生质体由于除去细胞壁这一扩散屏障，有利于胞内物质透过细胞膜分泌到细胞外，可以用于胞内酶等胞内产物的生产。

问答题

何为细胞产酶动力学，简述其动力学模型

产酶动力学主要研究发酵过程中细胞产酶速率以及各种因素对产酶速率的影响规律，主要为宏观产酶动力学。

根据细胞产酶模式的不同，产酶速率和细胞生长速率的关系也有所不同。

1）同步合成型的酶：

其产酶与细胞生长欧联，在平衡期产酶速率为零，即非生长偶联的比产酶速率β=0方程：

dE/dt=αμX

2）中期合成型的酶：

在培养液中有阻遏物存在，α=0，无酶产生。

在此阶段的产酶动力学方程与同步合成型相同

3）滞后合成型：

其合成模式为非生长偶联行，生长偶联的比产酶系数α=0方程：

dE/dt=βX

4）延续合成型的酶：

在细胞生长期和平衡期均可以产酶，产酶速率是生长偶联与非生长偶联产酶速率之和（最理想状态）方程：

dE/dt=αμX+βX

受mRNA抑制的模型：

1）、2）

原核生物中酶生物合成的调节主要是转录水平的调节，与酶的生物合成密切相关的基因有4种：

调节基因、启动基因、操纵基因和结构基因。

结构基因与操纵基因、启动基因一起组成操纵子。

原核生物中有两种类型操纵子：

诱导性，如乳糖操纵子；阻遏型操纵子，如色氨酸操纵子。

1、发酵工艺流程（了解，考点较少）：

细胞活化→细胞扩大培养→制作培养基（碳源、氮源、无机盐、生长因素）→分离纯化→酶

2、发酵工艺条件的控制

（1）培养基的配制调控

碳源：

提供碳素化合物的营养物质；为细胞提供能量的能源

氮源：

向细胞提供氮元素的营养物质

无机盐：

提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的pH，氧化还原单位和渗透压其调节作用

生长因素：

提供繁殖所必需的微量有机化合物，主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、生物素。

氨基酸是蛋白质的组分；嘌呤、嘧啶是核酸和某些辅酶或辅基的组分，维生素主要起辅酶作用；动植物生长激素则分别对动物细胞和植物细胞的生长、分裂起调节作用

（2）pH调节控制

细菌和放线菌的生长最适pH在中性或碱性范围（pH6.5-8.0）霉菌和酵母的最适生长pH为偏酸性（pH4-6）植物细胞生长的最适pH为5-6

细胞发酵产酶的最适pH与生长最适pH往往有所不同。

细胞产酶的最适pH通常接近于该酶催化反应的最适pH。

Eg：

发酵生产碱性蛋白酶的最适pH为碱性（pH8.5-9.0）生产中性蛋白酶的pH以中性或微酸性（ph6.0-7.0）为宜，而酸性条件（pH4-6）有利于酸性蛋白酶的产生。

（3）温度的调节控制

有些细胞发酵产酶的最适温度与生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度。

这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所对应的mRNA的稳定，增加酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。

枯草杆菌最适生长温度为34-37度，黑曲霉的最适生长温度为28-32度

（4）溶解氧的调节调控

细胞的生长、繁殖和生物合成过程需要大量能量，必须获得充足的氧气，发酵过程中尽量控制溶氧速率等于或稍高于好氧速率。

3、提高酶产量的措施

（1）添加诱导物（只针对诱导酶的发酵生产），可分为：

酶的作用底物、酶的反应产物、酶作用底物的类似物（异丙基-β-硫代半乳糖苷IPTG、蔗糖甘油单棕榈酸酯）

（2）控制阻遏物的浓度是解除阻遏提高酶产量的有效措施

解除分解代谢产物阻遏方法：

①控制可利用的碳源浓度②添加一定量的环腺苷酸cAMP

解除受代谢途径末端产物阻遏的方法：

①控制末端产物的浓度的方法②对于非营养缺陷性菌株，可通过添加末端产物类似物的方法减少或者解除阻遏作用

（3）添加便面活性剂：

有离子型（对细胞有毒害作用，一般不能在酶的发酵生产中添加培养基中）和非离子型（常用）

（4）添加产酶促进剂

综合分析题：

试通过所给实验现象，分析酶生物合成调控的特点（不知道怎么答。

。

。

）

第四章

1、细胞破碎的方法：

分类

细胞破碎方法

细胞破碎原理

机械破碎法

捣碎法、研磨法、匀浆法

通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎

物理破碎法

温度差破碎法

压力差破碎法

超声波破碎法

通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎

化学破碎法

添加有机溶剂

通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎

添加表面活性剂

酶促破碎法

自溶法

外加酶自制法

通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到细胞破碎

2、酶提取的主要方法：

提取方法

使用的溶剂或者溶液

提取对象

盐溶液提取

0.02~0.5mol/L的盐溶液

用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶

酸溶液提取

pH2~6的水溶液

用于提取在稀酸溶液中溶解度大且稳定性好的酶

碱溶液提取

pH8~12的水溶液

用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶

有机溶剂提取

可与水混溶的有机溶剂

用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶

3、酶沉淀分离方法的原理与特点：

沉淀分离方法

分离原理

特点

盐析沉淀法

利用蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出从而使酶与杂质分离

应用最早、使用广泛、盐析得到的酶沉淀含有大量盐分

等电点沉淀法

利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出从而使酶与杂质分离

沉淀不完全

有机溶剂沉淀法

利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，达到目的

酶沉淀易于离心或过滤分离，不含无机盐；分辨率较高；容易引起酶变性失活

4、膜分离技术（大题）

指的是借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术。

在酶生产中的应用：

加压膜分离1）微滤在酶的分离纯化过程中，可以通过微滤除去酶液中含有的微生物细胞等。

2）超滤是借助于超滤膜将不同大小的物质颗粒或分子分离的技术，主要用于分离病毒和各种生物大分子。

不仅用于酶的分离纯化，同时还能达到酶液浓缩的目的，特别适用于液体酶制剂的生产。

3）反渗透主要用于分离各种离子和小分子物质，在无离子水的制备、海水淡化等方面也广泛应用。

5、层析分离方法

层析方法

分离原理

离子交换层析

利用离子交换剂上的活性基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的

凝胶层析（Ka=Ve--Vo/ViKa=0最先流出，Ka=1最后流出，0~1从小到大洗脱出去，不是单纯的凝胶层析时，会出现Ka大于1）

以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离

亲和层析

利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分离纯化

凝胶电泳的分类及其原理：

聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶

7、离心分离：

借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。

1）差速离心适用于大小和密度相差较大的颗粒2）密度梯度离心使沉降系数比较接近的物质得以分离3）等密度梯度离心

名词解释：

沉淀分离：

是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其他溶质分离的过程。

凝胶层析：

是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。

凝胶电泳：

是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。

双水相萃取：

利用溶质在互不相容的两相中的溶解度不同而达到分离目的。

超临界萃取：

是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。

（最常用的的超临界流体是co2）

反胶束：

将表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体。

电泳：

带点粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。

层析分离：

利用混合液中各组分的物理化学性质的不同，使各组分以不同比例分布在两项中

结晶是纯化分离的一种手段

等电点聚焦电泳的目的是，测定酶的等电点及酶和其他蛋白质的分离

第五章酶分子修饰

第五章酶分子修饰

名词解释：

1.酶分子修饰：

通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。

2.大分子结合修饰：

采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。

3.肽链有限水解修饰：

在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的催化特性的方法。

4.核苷酸剪切修饰：

将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，从而改变酶的催化特性的修饰方法。

问答题：

试述酶分子修饰的作用。

通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些合理的改变，就有可能提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的底物专一性等。

同时通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与催化特性之间的关系，所以，酶分子修饰在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。

举例说明肽链有限水解修饰和核苷酸剪切修饰。

一肽链有限水解修饰：

1用具有高度专一性的蛋白酶对某些酶原进行肽链有限水解修饰，从而显示出酶的催化活性或提高酶活力。

例如，胰蛋白酶原本来没有催化活性，当受到胰蛋白酶或肠激酶的修饰作用，从N端去一个六肽后，就显示胰蛋白酶的催化功能。

2有些酶的活性较低，通过酶分子主链修饰可以显著提高酶的催化活性。

例如，天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰，从其羧基末端切除10个氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸的催化效率提高5倍左右。

3采用适当的方法使酶分子的肽链在特定的位点断裂，其分子质量减少，就可以在基本保持酶活性的同时使酶的抗原性降低或消失。

例如，酵母的喜春化酶经肽链有限水解，除去由150个氨基酸残基组成的肽段后，酶活性仍然可以保持，抗原性却显著降低。

4酶蛋白的肽链有限水解修饰通常使用某些专一性较高的蛋白酶或肽酶作为修饰剂。

有时也可以采用其他方法使酶的主链部分水解，而达到修饰目的，例如，枯草杆菌中性蛋白酶经过EDTA处理后，再通过纯水或稀盐缓冲液透析，部分水解，得到仍然具有蛋白酶活性的小分子肽段，将其用作消炎剂使用时，不产生抗原性，表现出良好的治疗效果。

核苷酸链剪切修饰作用：

某些RNA分子原本不具有催化活性，经过适当的修饰作用，在适当位置去除一部分核苷酸残基后，可以显示酶的催化活性，称为一种核酸类酶

eg：

四膜虫26SrRNA前体经过自我剪接作用形成成熟的26SrRNA，同时生成由414个核苷酸（nt）

组成的线性间隔系列LIVS。

LIVS的5’端切除15nt后环化，开环后进行第二次环化，有失去4nt，最后开环得到一个在5’端失去19个核苷酸残基的多功能核酸类酶L-19IVS

1、酶分子修饰作用：

提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、降低或消除酶的抗原性、改变酶的专一性、研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构像的影响，可以进一步探讨其结构与催化特性之间的关系

2、金属离子置换修饰的方法：

酶的分离纯化、除去原有的金属离子、加入置换离子

作用：

①阐明金属离子对酶催化作用的影响、②提高酶的催化效率、③增强酶的稳定性、④改变酶的动力学特性

3、大分子结合修饰主要过程：

修饰剂的选择→修饰剂的活化（常用大分子修饰剂：

MPEG单氧基聚乙二醇）→修饰→分离

作用：

①提高酶的催化效率②增强酶的稳定性③降低或消除酶蛋白的抗原性（聚乙二醇）

4、侧链基团修饰方法：

氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、胍基修饰、酚基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰、分子内交联修饰

5、物理修饰：

通过各种物理方法使酶分子的空间构像发生某些改变，从而改变酶的催化特性的方法

6、氨基酸置换修饰的作用：

①通过修饰可以提高酶的催化效率

②增强酶的稳定性

③使酶的专一性发生改变

第六章酶、细胞、原生质体固定化

名词解释

1、酶的固定化：

采用各种方法，将酶固定在水不溶性载体上，制备成固定化酶的过程

2、固定化酶：

指固定在一定载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶

3、固定化细胞：

指固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动的细胞

4、酶传感器：

是由固定化酶与能量转化器密切结合而成的传感装置，是生物传感器的一种

5、原生质体：

微生物细胞和植物细胞除去细胞壁后得到的由细胞膜包裹的细胞叫原生质体

6、原生质体固定化：

通过包埋固定化等方法，将原生质体固定在载体上制备固定化原生质体的过程叫原生质体的固定化

7、固定化原生质体：

固定在载体上并在一定的空间范围内进行新陈代谢的原生质体

填空+判断

1、固定化酶的应用

答：

固定化酶在工业生产中的应用：

①氨基酰化酶，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸

②葡萄糖异构酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆

③天冬氨酰，将延胡索酸转化生产L-天冬氨酸

④青霉素酰化酶，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素

⑤β-半乳糖苷酶，水解乳中存在的乳糖，生成半乳糖和葡萄糖，用于制造低级乳糖

固定化酶在酶传感器方面的应用：

酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置

2、固定化微生物细胞特点：

①保持了细胞的完整结构和天然状态，可进行正常的生长繁殖

②保持了细胞内原有的酶系。

辅酶体系和代谢调控体系，可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢控制

③发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间

④细胞密度提高，可提高产率

⑤由于有载体保护，可以减轻剪切力，其他外界因素对细胞的影响，且可提高基因工程菌的质粒稳定性

3、原生质体固定化步骤

原生质体的制备：

①首先将对数生长期的细胞收集起来，悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗溶液中②加入适宜的细胞壁水解酶，在一定条件下作用一段时间，使细胞壁破裂③分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶，得到原生质体

原生质体固定化：

采用包埋法制成固定化原生质体（一般采用凝胶包埋法，有琼脂糖凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，光交联树脂等）

4、固定化原生质体特点

①由于没有细胞壁，细胞结构不完整，失去增殖能力，但由于细胞膜内的结构没有受其影响，保持了原有的新城代谢特性

②由于解除了细胞壁这一屏障，增加了细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率

③由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可以反复使用和连续使用较长时间，利于连续化生产，在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力

④固定化原生质体易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量

⑤在固定化原生质体发酵的培养基中，需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性

问答题

1、试述常用固定化方法的特点及其应用（删）

①吸附法：

利用各种固体吸附剂将酶或含酶材料吸附在其表面上，而使酶固定化的方法

特点：

操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，可反复使用，但由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固容易脱落，所以使用受到一定限制

应用：

制备固定化酶和固定化菌体、

②包埋法：

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔材料中，使酶固定化的方法

1’凝胶包埋法：

将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体

特点：

天然凝胶包埋时，条件温和，操作简便，对酶活性影响甚少，但强度较差；合成凝胶强度高，对温度，PH变化的耐受性强，但需要在一定条件进行聚合反应，才能把酶包埋起来

应用：

适用于各种微生物，植物，动物细胞的固定化，但不适合那些底物或产物分子很大的酶类的固定化

2’半透膜固定化：

将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固定化酶

特点：

半透膜孔径比一般酶分子小，固定化酶不会从小球中漏出来，但只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由透过半透膜（略）

2、何谓固定化酶？

固定化酶的特性与游离酶比较有那些改变？

答：

特性：

①固定化酶的稳定性比游离酶好，热稳定性，保存稳定性，对蛋白酶的抵抗性，对变性剂的耐受性等都提高

②最适温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大，但有些固定化酶的最适温度与游离酶比较会有明显变化

③最适pH往往发生变化，影响固定化酶最适pH的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质

载体性质对最适pH的影响：

用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶最适pH高；用带正电荷的载体，最适pH比游离酶低；而用不带电荷的载体，其最适pH不变

（1）产物性质对最适pH的影响：

催化反应产物为酸性时，固定化酶的最适pH要比游离酶高；催化反应产物为碱性时，最适pH低；产物为中性时，最适pH不变

④固定化酶的底物特异性与游离酶的可能有些不同，其变化与底物分子质量的大小有一定关系，对于作用于小分子底物的酶，固定前后没有变化，对于作用于大分子底物的酶，固定化后底物特异性发生变化，这些变化是由于载体的空间位阻作用引起的

⑤固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足，增加了稳定性，可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显著优点

第九章酶反应器

名词解释

1、酶反应器：

用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器

2、膜反应器：

是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器，可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应

填空+判断

1、酶反应器类型及其特点

2、在酶反应器的操作过程中要注意哪些问题？

①保持酶反应器的操作稳定性

②防止酶的变性失活

③防止微生物的污染

第十章酶的应用

1.酶在医药方面的应用：

①根据体内酶活性的变化诊断疾病

②用酶进行疾病的预防和治疗

③用酶制造各种药物

2.酶在食品保鲜方面的应用：

①食品除氧保鲜：

葡萄糖氧化酶可以催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，可以除去氧气，达到食品保鲜的目的。

②蛋类制品脱糖保鲜：

应用葡萄糖氧化酶进行蛋白质的脱糖处理。

③食品灭菌保鲜：

用溶菌酶处理食品，可以杀灭存在于食品中的细菌，已达防腐保鲜的效果。

3.酶在食品生产方面的应用：

①酶在淀粉类食品生产方面的应用：

1）α-淀粉酶用于葡萄糖的生产

2）葡萄糖异构酶用于果葡糖浆的生产

3）β-淀粉酶用于饴糖、麦芽糖的生产

②酶在果蔬类食品生产方面的应用：

1）果胶酶应用于果汁生产

实验部分

实验一

1．产蛋白酶菌株实验原理（产蛋白酶菌株-枯草杆菌）

1草杆菌是工业上常用的生产酶，可以生产胞外酶，而且能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌可先进行一定的热处理杀灭其他营养细胞，提高该菌株的相对数目。

2胞外酶能分泌到分离培养基（奶粉），将培养基蛋白质水解，从而形成单菌落分泌的酶形成的“透明水解圈”，水解圈越多证明酶活性越高。

通过水解圈直径/菌落最大直径的比值可对产酶的微生物的产酶能力进行初步估计、分离高产酶的微生物，比值越大，酶活力越高。

3菌落形态观察鉴别，菌落成灰白色，不透明，表面粗糙

实验二

2．高产蛋白酶诱变筛选步骤（步骤3.4.5具体操作）

3．取上述菌体悬液1ml到10ml的离心管,加入2mlpH4.6的醋酸缓冲液和1ml0.1M的亚硝酸钠溶液，常温下处理10—20分钟，在3500rpm离心5min，上清液顷入废液桶中，沉淀用2ml0.07M的Na2HPO4悬浮，中止诱变，在上述溶液中加入5mlLB培养基，中间培养3-4h后按实验一方法进行稀释、涂布，筛选。

4.另取菌悬液2ml，放入无菌的培养皿中，在无菌工作台上进行紫外线照射诱变，（15W,30cm,30-40s）经中间培养后同上法进行筛选。

5.按实验一方法配制8个分离筛选平板，用于诱变菌株的分离筛选。

实验五

1.淀粉的液化步骤：

100g淀粉放入烧杯，加每克2500单位的耐热α—淀粉酶200mg，先混合后再加250ml的清水，用小火烧煮，不停搅动防止糊锅。

煮开后持续5分钟即可停火，保温液化10分钟。

2.淀粉的糖化步骤：

把煮好的粥放入大烧杯中（本实验大烧杯改为不锈钢锅），当温度降到75C左有时，把事先准备好的麦芽浆加入缸中，加入麦芽浆后液体温度会继续下降，到60C时开始保温糖化。

约6-8小时后（也可等到第二天继续实验），杯上部出现澄清液，即糖化结束。

（为节省时间，本实验已加入过量麦芽汁，糖化时间可缩减到30分钟。

3．DE值测定原理：

本实验采用3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。

实验六

4．酵母细胞固定化原理和基本操作：

原理：

1）采用物理或化学的方法固定化微生物细胞，是利用酶或酶系的一条捷径。

对于固定化细胞，以微生物细胞在固定化后的生长状态可分为：

固定化死细胞、固定化活细胞和固定化增殖细胞三类。

固定化死细胞是在固定化前或固定化后对微生物细胞进行加热、冷冻、干燥、表面活性剂、化学试剂等处理，使细胞处于死亡状态；固定化活细胞是在固定化后细胞仍存活但并不增殖；固定化增殖细胞是固定化后细胞不仅存活，而且在使用过程中还能增殖。

这三类固定化细胞中最令人感兴趣的是固定化增殖细胞。

因为多数微生物代谢的产物与其生长相关。

2）完整细胞的固定化对于细胞内酶的利用有明显的优点，它保持了酶在细胞内环境中的稳定性，成本低，可以利用细胞内的复合酶系进行反应。

当反应需要辅助因子时，固定化细胞的优点更加突出，因为活细胞能再生辅助因子。

微生物细胞的固定化方法与固定化酶的方法类似，有吸附法、包埋法和不用载体法固定化细胞的活力及其它性质与游离细胞有所不同。

细胞经固定化后，一般细胞的稳定性增加。

固定化细胞的最适反应温度、最适pH值、最大反应速度大多与游离细胞相同；饱和常数与游离细胞相比有的不变，有的变化很大，这可能是由于载体底物间静电相互作用以及存在扩散效应的缘故。

3）本实验固定化的方法是把细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，滴进氯化钙溶液中，形成海藻酸钙凝胶小球。

细胞包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。

通过包埋法，对酵母活细胞进行固定。

基本操作：

1调取活化培养24h的酵母斜面菌种一环，接种于10ml麦芽汁试管中，25℃摇瓶培养48h。

2取酵母菌体悬浮液10mL，悬浮在10mL4%海藻酸钠溶液（冷却到约50度不太烫手）中混合均匀。

3用灭过菌的注射器吸取上述悬浮液，逐滴滴人到50mL氯化钙溶液中，浸泡30~120min使之形成凝胶珠。

4待凝胶珠在溶液中泡30min后，滤出凝胶珠得到固定化细胞。

实验八

5．醋酸杆菌的一