届高中生物一轮复习人教版 基因工程 学案.docx

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届高中生物一轮复习人教版基因工程学案

2020届一轮复习人教版基因工程学案　

　1.基因工程的诞生（Ⅰ）。

　2.基因工程的原理及技术（含PCR技术）（Ⅱ）。

　3.基因工程的应用（Ⅱ）。

　4.蛋白质工程（Ⅰ）。

考点一　基因工程的基本工具

1．基因工程的概念

（1）供体：

提供目的基因。

（2）操作环境：

体外。

（3）操作水平：

分子水平。

（4）原理：

基因重组。

（5）受体：

表达目的基因。

（6）本质：

性状在受体体内的表达。

（7）优点：

克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。

2．基因工程的操作工具

（1）限制酶

（2）DNA连接酶

①作用：

将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。

②类型

常用类型

E·coliDNA连接酶

T4DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4噬菌体

功能

只缝合黏性末端

缝合黏性末端和平末端

结果

恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键

③DNA连接酶和限制酶的关系

（3）载体

①

②其他载体：

λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。

③载体的作用：

携带外源DNA片段进入受体细胞。

[归纳整合]

1．限制酶的特点与使用

（1）限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。

（2）在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶，以获得相同的黏性末端。

但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。

（3）为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理含目的基因的DNA和载体，使目的基因两侧及载体上各自具有两个不同的黏性末端。

2．与DNA相关的五种酶的比较

名称

作用部位

作用结果

限制酶

磷酸二酯键

将DNA切成两个片段

DNA连接酶

磷酸二酯键

将两个DNA片段连接为一个DNA分子

DNA聚合酶

磷酸二酯键

将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端

DNA（水解）酶

磷酸二酯键

将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸

解旋酶

碱基对之间

的氢键

将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链

3．全面理解基因工程中的载体

（1）应具备的条件：

①能在受体细胞中复制并稳定保存，可使目的基因稳定存在且数量可扩大。

②具有一个至多个限制酶切点，可供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，可供重组DNA的鉴定和选择。

（2）与膜载体的区别：

基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内，并利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。

[思维探究]

据两种限制酶的作用图示思考相关问题：

（1）已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为G↓AATTC和CCC↓GGG，在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端并写出末端的种类。

提示：

（2）图①和②产出的末端类型有什么不同？

提示：

①产生的是黏性末端；②产生的是平末端。

（3）EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列不同，切割位点不同，说明限制酶具有怎样的特性？

提示：

专一性。

[教材深挖]

教材选修3P4“寻根问底”：

根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？

提示：

限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。

所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。

命题点一　限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用

1.（2016·全国卷Ⅲ，T40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体的示意图（载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的）。

图（a）

图（b）

根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是________________________________________

________________________________________。

（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。

这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是_________________________________________________。

图（c）

（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________和________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是________。

解析　　

（1）由题图可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制性内切酶的共同识别序列是

，二者切割可以形成相同的黏性末端，因此经BamHⅠ酶切得到的目的基因可以与图（b）所示表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。

（2）在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样基因才能顺利地转录，再完成翻译过程，即顺利表达。

图中甲所示的目的基因插入在启动子的上游，丙所示目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录，因此目的基因不能表达。

（3）常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。

答案　　

（1）Sau3AⅠ　两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端　

（2）甲和丙　甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录（其他合理答案也可）

（3）E.coliDNA连接酶　T4DNA连接酶　T4DNA连接酶（其他合理答案也可）

2．（2019·四川乐山一模）为了解基因结构，通常选取一特定长度的线性DNA分子，先用一种限制酶切割，通过电泳技术将单酶水解片段分离，计算相对大小；然后再用另一种酶对单酶水解片段进行降解，分析片段大小。

下表是某小组进行的相关实验。

已知第一线性DNA序列共有5000bp

（bp为碱基对）

第一步水解

产物（单位bp）

第二步水解

产物（单位bp）

A酶切割

3500

将第一步水解产物分离后，分别用B酶切割

15002000

1000

1000

500

500

B酶切割

2000

将第一步水

解产物分离

后，分别用

A酶切割

5001500

3000

20001000

经A酶和

B酶同时切割

200015001000500

（1）该实验中体现出限制酶的作用特点是______________________。

（2）由实验可知，在这段已知序列上，A酶与B酶的识别序列分别为______个和_____个。

（3）根据表中数据，请在下图中用箭头标出相应限制酶的酶切位点。

（4）已知BamHI与BglⅡ的识别序列及切割位点如下图所示，用这两种酶和DNA连接酶对一段含有数个BamHI和BglⅡ识别序列的DNA分子进行反复的切割、连接操作，若干次循环后

和___________序列明显增多，该过程中DNA连接酶催化____________键的形成。

解析　

（1）该实验中体现出限制酶的作用特点是酶的专一性。

（2）A酶切割后形成3段，所以有2个识别位点，B酶切割后形成2段，所以有1个切割位点。

（3）由于酶B只有一个限制酶切位点，即在2000和3000之间，可以先标注出；又由于酶A又可以将2000的这段切成500和1500的，结合酶A单独切割又可以标注其切割位点，同理标出另一个切割位点，答案如下图：

（4）巳知BamHⅠ与BglⅡ的识别序列及切割位点如图2所示。

用这两种酶和DNA连接酶对一段含有数个BamHⅠ和BglⅡ识别序列的DNA分子进行反复的切割、连接操作，若干循环后

和

序列明显增多。

DNA连接酶催化形成的是磷酸二酯键。

答案　

（1）一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，且在特定的位点切割

（2）2　1

（3）

（4）

　磷酸二酯键

限制酶的选择方法

根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类。

（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

（2）不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

（3）为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。

命题点二　载体的应用分析

3．（2016·全国卷Ⅰ，T40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。

有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。

结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。

被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

回答下列问题：

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可），而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。

（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_________________；并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________。

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________的固体培养基。

（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。

解析　

（1）质粒作为载体，应具备的基本条件有：

有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等等。

（2）在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。

含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。

若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。

（3）某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。

答案　

（1）能自我复制、具有标记基因（答出两点即可）

（2）二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长　含有质粒载体　含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）　二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长　四环素　（3）受体细胞

4．（2019·福建三明市段考）基因工程中最常用的运载体是质粒，作为运载体，需有标记基因，如抗青霉素基因、抗四环素基因等。

现欲鉴别某种细菌质粒抗药性基因的类别，设计如下实验：

材料用具：

青霉素、四环素的10万单位溶液，菌种试管，已经灭菌的含细菌培养基的培养皿，酒精灯，接种环，一次性注射器，蒸馏水，恒温箱。

方法步骤：

第一步：

取3个含细菌培养基的培养皿并分别标上1、2、3号，在酒精灯旁，用3只注射器分别注入1mL蒸馏水、青霉素溶液、四环素溶液，并使之分布在整个培养基表面；

第二步：

将接种环放在酒精灯的火焰_____（填“上”或“旁”）灼烧，并在酒精灯的火焰_____（填“上”或“旁”）取菌种，对3个培养皿分别接种；

第三步：

将接种后的3个培养皿放入37℃恒温箱中培养24h。

请对结果进行预测：

①若_______________号培养基中细菌存活，说明该细菌质粒上有两种抗性基因；

②若1号培养基中细菌存活，2、3号培养基中没有细菌存活，说明______________；

③________________________________________

________________________________________；

④________________________________________

________________________________________。

解析　根据题意可知，本实验的目的是鉴别某种细菌质粒抗药性基因的类别，即检测转基因细菌在何种培养基中能正常生长、繁殖；根据已有的步骤安排，按照无菌操作的要求，第二步中应将接种环放在酒精灯的火焰上灼烧，并在酒精灯的火焰旁（无菌区）取菌种，对3个培养皿分别接种。

若基因工程中构建完成的目的细菌中含有某种抗生素抗性基因（标记基因），该基因正常表达，则会赋予该工程菌抵抗此抗生素的能力，这样该工程菌就可以在含有该种抗生素的培养基中正常生长、繁殖，否则工程菌不能在含有该抗生素的培养基生存；因此①若该工程菌质粒上有两种抗性基因，则细菌可在1、2、3号培养基中细菌存活；②若该工程菌质粒上两种抗性基因都没有，则细菌可在1号培养基中细菌存活，而2、3号培养基中没有细菌存活；③若该工程菌质粒上仅含有青霉素抗性基因，则细菌能在1、2号培养基中细菌存活，而在3号培养基中没有细菌存活；④若该工程菌质粒上仅含有四环素抗性基因，则细菌可在1、3号培养基中细菌存活，而2号培养基中没有细菌存活。

答案　上　旁　①1、2、3　②该细菌质粒上两种抗性基因都没有　③1、2号培养基中细菌存活，3号培养基中没有细菌存活，说明该细菌质粒上有青霉素抗性基因　④1、3号培养基中细菌存活，2号培养基中没有细菌存活，说明该细菌质粒上有四环素抗性基因

考点二　基因工程的操作过程与应用

1．基本操作程序

2．基因工程的应用

（1）动物基因工程：

用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。

（2）植物基因工程：

培育抗虫转基因植物、抗病转基因植物和抗逆转基因植物；利用转基因改良植物的品质。

（3）比较基因治疗与基因诊断

原理

操作过程

进展

基因治疗

基因表达

利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗（疾病）

临床实验

基因诊断

碱基互补

配对

制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况

临床应用

[归纳整合]

1．几种获取目的基因方法的比较

方法

从基因文库中获取

人工合成

从基因组文

库中获取

从部分基因

文库，如cDNA

文库中获取

化学合成法

逆转录法

过程

供体细胞

中的DNA

↓限制酶

许多DNA片段

↓插入

载体

↓导入

受体菌群

（基因组文库）

↓分离

目的基因

目的基因

的mRNA

↓逆转录

单链DNA

↓合成

双链DNA

↓插入

载体

↓导入

受体菌群

（cDNA文库）

↓分离

目的基因

蛋白质

的氨基

酸序列

↓推测

mRNA

的核苷

酸序列

↓推测

结构基

因的核

苷酸序列

↓化学合成

目的基因

目的基因

的mRNA

↓逆转录

单链DNA

↓合成

双链DNA

即目的

基因

2．基因工程操作程序中的“三、三、二、一”

（1）目的基因“三种获取方法”：

①从基因文库中获取（基因组文库、cDNA文库）；

②利用PCR技术扩增：

其实质是在体外对目的基因进行大量复制。

用PCR仪控制温度：

变性（90～95℃）→复性（55～60℃）→延伸（70～75℃）；

③通过DNA合成仪用化学方法人工合成（用于核苷酸序列已知，且核苷酸数目较少的基因）、利用mRNA反转录法合成。

（2）将目的基因导入受体细胞的“三种类型”：

①导入植物细胞——农杆菌转化法（花粉管通道法、基因枪法）；

②导入动物细胞——显微注射法（导入受精卵）；

③导入微生物细胞——转化法。

（3）目的基因检测与鉴定的“两个水平”：

（4）基因工程操作的“一个核心”——基因表达载体的构建。

[思维探究]

据图分析抗虫棉的培育过程

（1）该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？

一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？

提示：

目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。

用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。

（2）该实例中，采用何种方法导入目的基因？

为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？

提示：

采用的方法是农杆菌转化法，由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。

（3）该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？

提示：

抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。

[教材深挖]

教材选修3P8“求异思维”：

你能推测出mRNA反转录形成cRNA的过程大致分为哪些步骤吗？

提示：

第1步：

mRNA在反转录酶的作用下形成RNA－DNA杂交分子，第2步：

在核酸酶的作用下将RNA－DNA杂交分子中的RNA水解掉，形成RNA单链，第3步：

以RNA单链为模板，在DNA聚合酶的作用下形成双链的DNA。

命题点一　基因工程操作程序的分析

1．（2017·全国卷Ⅰ，T38，节选）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。

已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。

回答下列问题：

（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是______________________________________________。

（2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是________________________________________。

（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。

因为与家蚕相比，大肠杆菌具有________（答出两点即可）等优点。

（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。

（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________________________。

解析　

（1）人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。

（2）噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。

家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。

（3）与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。

（4）检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原－抗体杂交法。

（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。

也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。

答案　

（1）基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A

（2）噬菌体　噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕

（3）繁殖快、容易培养　（4）蛋白A的抗体　（5）DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体

2．（2019·福建三明市段考）绞股蓝细胞中含有抗烟草花叶病毒（TMV）基因，可以合成一种抗TMV蛋白，叶片对TMV具有抗感染性。

烟草是重要的经济作物，由于TMV的感染会导致大幅度减产。

科技人员利用基因工程技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图所示。

（1）科技人员从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的mRNA时，提取液中需添加________，防止RNA的降解。

（2）在构建重组Ti质粒时，除添加目的基因外，为了使目的基因能表达，还应该添加__________和__________。

（3）过程⑤需应用__________技术，其原理是__________。

此过程中培养基中加入卡那霉素的目的__________。

（4）过程⑥可采取__________的方法，检测植株是否合成了抗TMV蛋白。

在个体水平的鉴定过程中，可通过__________的方法来确定植株是否具有抗性。

解析　

（1）科技人员从绞股蓝细胞中提取抗TMV基因转录的mRNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，防止RNA的降解。

（2）在植物基因工程中，构建重组Ti质粒时，通常要用（同种）限制酶分别切割含目的基因的DNA分子和Ti质粒，使它们产生相同的黏性末端，然后再用DNA连接酶进行连接。

为了使目的基因能表达，重组质粒在组成上还应添加启动子、终止子。

（3）⑤是把受体细胞培养成再生植株的过程，此过程要用到植物组织培养技术，其原理是植物细胞的全能性。

此过程中培养基中加入卡那霉素的目的是筛选含有目的基因的再生植株（或“受体细胞”）。

（4）检测植株是否合成了抗TMV蛋白，过程⑥可采取抗原—抗体杂交的方法，在个体水平的鉴定过程中，可通过接种烟草花叶病毒的方法来确定植株是否具有抗性，接种烟草花叶病毒后，如果烟草植株不被感染，说明其具有抗性。

答案　

（1）RNA酶抑制剂　

（2）启动子　终止子　（3）植物组织培养　植物细胞的全能性　筛选含有目的基因的再生植株（或“受体细胞”）　（4）抗原—抗体杂交　接种烟草花叶病毒

命题点二　基因工程的应用

3．（2018·全国卷Ⅰ，T38）回答下列问题：

（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Cohen）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。

该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了_________________________（答出两点即可）。

（2）体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞；而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。

在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。

为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。

解析　

（1）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中，该过程利用的技术是基因工程。

该研究除了证明质粒可作为载体外，还