平板菌落的辨别计数和细菌染色供参习.docx

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平板菌落的辨别计数和细菌染色供参习

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环工综合实验

平板菌落的辨别计数和细菌染色

实验报告

环境科学与工程学院实验中心

实验题目

平板菌落的辨别计数和细菌染色

实验类别

综合

实验室

实验时间

实验环境

温度:

湿度:

同组人数

一、实验目的

1.学习平板菌落计数的基本原理和方法2.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；3.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。

4.学习并掌握微生物涂片、革兰氏染色的基本技术和无菌操作技术

二、实验仪器及设备

活材料：

培养的菌落染色液和试剂：

结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、蒸馏水器材：

废液缸、洗瓶、载玻片、盖玻片、接种环、煤气灯、擦镜纸、显微镜

三、实验原理

实验原理问答题：

1.如何对微生物菌落进行鉴别？

答：

细菌：

湿润，粘稠，易挑起，一般形成较小的圆形菌落，颜色有白色、黄色等，表面光滑或不光滑

放线菌：

干燥，多皱，难挑起，菌落较小，多有色素，菌落背面有同心圆形纹路。

这点可以和细菌菌落区分。

酵母菌：

湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚，菌落为淡黄色，光滑，半透明，比细菌菌落大。

霉菌：

菌丝细长，菌落疏松，成绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，菌落大型，肉眼可见许多毛状物，棕色、青色等，可见黑色的分生孢子群。

2.如何通过对平板微生物菌落进行计数知道湖水、自来水和空气中细菌的数量？

答：

选择平均菌落数在30～300间的平板

⑴若只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告

⑵若有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：

若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告；若2≤比值或比值≤0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。

⑶所有菌落数均不在30～300间以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数:

若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告;若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

空气中细菌含量的测定:

X=100×100×N／（πr2）

X—每m3空气中的细菌数；N：

平板暴露5min，置37℃培养24h后生长的菌落数；r：

平皿底半径（cm）

3.微生物的染色机理是什么？

（单染和革兰氏染色）

答：

⑴简单染色法：

所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。

碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。

例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：

带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。

常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫、碱性复红、番红（又称沙黄）等。

细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

⑵革兰氏染色法：

是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

革兰氏染色需用四种不同的溶液：

碱性染料（初染液）；媒染剂；脱色剂和复染液。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是沙黄。

四、实验步骤

1.对培养的平板菌落（湖水、自来水、空气）进行计数并辨别菌落形态。

2.革兰氏染色：

（1）涂片：

取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法挑取菌落，调匀并涂成薄膜，涂片必须均匀。

（2）晾干：

让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

（3）固定：

手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。

但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏（4）结晶紫染色：

将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟；水洗：

倾去染色液，用水小心地冲洗。

（5）媒染：

碘液，媒染1min，用水洗去碘液。

（6）脱色：

将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。

（7）复染：

滴加沙黄复染3-5min，用水洗去涂片上的沙黄染色液。

（8）晾干：

将染好的涂片用吸水纸吸干。

（9）镜检：

镜检时先用低倍，再用高倍观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

五、实验注意事项

1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。

如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。

2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。

六、实验数据及观察结果

菌落计数：

湖水：

选择稀释度为10-5的平板，数出菌落数约为280个，培养时所滴加溶液为0.2mL，由此计算得原溶液中细菌浓度为280×0.2×105=5.6×106cfu/mL

空气：

N=36r=9cm

X=100×100×N／（πr2）=100×100×36/（3.14×4.52）≈5600cfu/mL

自来水所培养的菌落培养基有明显的污染现象，无法计数。

从培养基中任取两个菌落进行革兰氏染色,经观测可知，所取的两个菌落均为同一种细菌产生，故在此报告中只附一张较为清晰的图片以供说明。

革兰氏染色镜检结果：

七、思考题

1.革兰氏染色为什么经常出现假阴性或假阳性？

请问，应该如何操作来保证革兰氏染色实验结果的正确性？

答：

⑴主要是由于酒精脱色步骤的影响。

如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。

脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响。

除此之外，在革兰氏染色中，细菌若局部浓度过大导致过于密集也常呈现假阳性反应，由于细胞过于紧密影响了酒精的脱色，导致脱色不完全残留结晶紫，因此表现出假阳性。

而若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶导致细胞壁的通透性改变，结晶紫染液可以脱色透出，常使革兰氏阳性菌呈阴性反应。

⑵关键在于染液，尤其是结晶紫的浓度和脱色的时间，另外冲洗水流需要控制，否则固定不良的样本会脱落，对结果造成影响。

一般结晶紫染一分钟，碘液一分钟，用酒精脱色一分钟，不过要求是到没有颜色脱落为止，复染一分钟。

这些时间需根据所配制的染液的浓度、室内温度、标本厚度等因素自己掌握，没有一定标准。

2.某研究人员希望能筛选出能高效降解羽毛的细菌，以增加氨基酸、多肽的来源。

请问如何筛选出该羽毛降解高效菌种？

该菌种可采用什么方法进行鉴定？

如果筛选出的菌种依然达不到降解要求，为高效生物降解羽毛你会采用什么手段？

答：

⑴从长期堆积羽毛的土壤等特殊环境中采集土壤样品。

称取采集的样品1g加10ml无菌生理盐水混匀，离心取上清1ml于富集培养基中，37℃，180r/min培养24h。

吸取富集的菌液接种到筛选培养基中，待羽毛粉完全降解时吸取培养液倍比稀释到合适的倍数涂布于筛培养基平板上，选取水解角蛋白圈最大的，划线分离纯化，得到单个菌落。

在以羽毛为唯一碳源和氮源的培养基上，得到6株可以在筛选平板上生长的微生物，经过多次传代，分离到纯的菌株，观察不同菌株对羽毛的降解情况，筛选出降解效果最好的菌株。

⑵通常把鉴定微生物的技术分成四个不同水平：

①细胞的形态和习性水平，例如用经典的研究方法，观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。

②细胞组分水平，包括细胞组成成分例如细胞壁成分，细胞氨基酸库，脂类，醌类，光合色素等的分析，所用的技术除常规实验室技术外，还使用红外光谱、气相色谱和质谱分析等新技术。

③蛋白质水平，包括氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应等若干现代技术。

④基因或DNA水平，包括核酸分子杂交（DNA与DNA或DNA与RNA），G＋Cmol%值的测定，遗传信息的转化和转导，16SrRNA（核糖体RNA）寡核苷酸组分分析，以及DNA或RNA的核苷酸顺序分析等。

⑶采用诱变育种。

①使用物理诱变，应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。

②使用化学诱变，化学诱变剂主要有：

烷化剂、核酸碱基类似物、抗生素等。

诱变完成后进行筛选。

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