常见化学发光免疫分析技术比较.docx

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常见化学发光免疫分析技术比较

常见化学发光免疫分析技术比较

1、化学发光免疫分析

化学发光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA），

英音：

[,kemi,lju:

mi'nes?

ns][,imju:

n?

u?

'sei]

是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。

是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。

1.1、化学发光免疫分析原理

化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统。

化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体回到稳定的基态时,同时发射出光子（hv）,利用发光信号测量仪器测量光量子产额。

免疫反应系统是将发光物质（在反应剂激发下生成激发态中间体）直接标记在抗原（化学发光免疫分析）或抗体（免疫化学发光分析）上,或酶作用于发光底物。

1.2、化学发光免疫分析类型

化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:

（1）化学发光标记免疫分析法;

（2）酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法

1.2.1　化学发光标记免疫分析

化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CLIA）,是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。

常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester（AE）,是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂（NaOH-H2O2）作用而发光,强烈的直接发光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光。

吖啶酯作为标记物用于免疫分析,其化学反应简单、快速、无须催化剂;检测小分子抗原采用竞争法,大分子抗原则采用夹心法,非特异性结合少,本底低;与大分子的结合不会减小所产生的光量,从而增加灵敏度。

1.2.2　化学发光酶免疫分析

从标记免疫分析角度,化学发光酶免疫分析（chemiluminescentenzymeimmunoassay，CLEIA）,应属酶免疫分析,只是酶反应的底物是发光剂,操作步骤与酶免分析完全相同:

以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定。

目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）,它们有各自的发光底物。

12.2.1　HRP标记的CLEIA

常用的底物为鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼,luminol）,或其衍生物如异鲁米诺（4-氨基邻苯二甲酰肼）,是一类重要的发光试剂。

其结构如图4所示。

鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,在过氧化物酶及活性氧[过氧化阴离子（O2-）,单线态氧（1O2）,羟自由基（OH·）,过氧化氢（H2O2）]存在下,生成激发态中间体,当其回到基态时发光,其波长为425nm。

早期用鲁米诺直接标记抗原（或抗体）,但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。

近来用过氧化物酶标记抗体,进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物,在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH-H2O2）作用下,鲁米诺发光,发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。

KodakAmerliteTM半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的。

1.2.2.2　增强发光酶免疫分析（enhancedluminescenceenzymeimmunoassay,ELEIA）

在发光系统中加入增强发光剂,如对2碘苯酚等,以增强发光信号,并在较长时间内保持稳定,便于重复测量,从而提高分析灵敏度和准确性。

在全自动分析仪上,还可通过计算机严密控制,进行自动操作,如加试剂,混合,温育,洗涤,加发光试剂,发光计数,数据处理,绘制标准曲线,直至完成病人血清样品的分析并打印出结果。

AmerliteTM发光增强酶免分析系统用荧光素、噻唑等增强剂,其发光时间可持续长达20min,试剂盒有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素,与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮,以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。

1.2.2.3　ALP标记的CLEIA

所用发光底物为环1,2-二氧乙烷衍生物,,用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的金刚烷基,其分子中发光基团为芳香基团和酶作用的基团,在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。

最常使用的底物AMPPD3-[2-spiroadamatane]-4-methoxy-4-[3-phosphoryloxy]-phenyl-1,2-dioxetane）Dioxetane中文名为:

3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-4-（3-磷氧酰）-苯基-1,2-二氧环乙烷。

在碱性磷酸酶（ALP）作用下,磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基,得到一个中等稳定的中间体AMPD（半寿期为2-30min）,此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子,当其回到基态时产生470nm的光,可持续几十分钟（如图5）。

AMPPD为磷酸酯酶的直接化学发光底物,可用来检测碱性磷酸酯酶或酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。

可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10-15mol/L。

美国DPC公司的Immulite全自动酶放大发光免疫分析仪,以碱性磷酸酶为标记物,以金刚烷作发光底物,测定灵敏度相当于10-21mol/mL的酶,采用聚苯乙烯珠作载体,其检测水平已能达到10-12g/mL。

AMPPD是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点：

反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。

在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。

在通常情况下，这种化合物很稳定。

但是当有碱性磷酸酶存在时，DioxetanePhosphate作为酶的底物会在酶的催化一脱去磷酸根基团，形成一个不稳定的中间体。

这个中间体随即自行分解（二氧四节环断裂），同时发射光子。

该试剂采用微粒子化学发光技术，采用最新磁性微粒，用以包被抗体。

用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原（抗体）。

经过普通抗原抗体反应，碱性磷酸酶结合在微粒子上，碱性磷酸酶的结合量同病人血清中的待测物质成比例。

经过洗涤（反应管两边有磁场，磁性微粒包被的抗原抗体结合物被吸附在管子两边，其余游离部分被抽吸掉），最后加入发光底物DioxetanePhosphate，5分钟后，仪器通过光电倍增管检测反应的发光强度。

AMPPD是碱性磷酸酶的化学发光底物，在适宜的缓冲液中，随着酶的催化水解作用，AMPPD分解成AMP-D，后者发出强度很高的光信号，其发光的速度取决于碱磷酶的浓度。

当碱磷酶偶合到杂交的探针时，便可以通过此系统检测到杂交分子的存在量。

2微粒体发光免疫分析

微粒体发光免疫分析（microparticleluminescenceenzymeimmunoassay,MLEIA）,该免疫分析技术有两种方法：

一种是小分子抗原物质的测定采用竞争法。

另一种是大分子的抗原物质测定采用双抗体夹心法。

该仪器所用固相磁粉颗粒极微小，其直径仅1.0μm，这样大大增加了包被表面积，增加抗原或抗体的吸附量，使反应速度加快，也使清洗和分离更简便，从而减少污染，降低交叉污染概率。

反应中使用碱性磷酸酶（ALP）标记抗原或抗体，作用于其底物二氧乙烷磷酸酯，由其在激发态与基态的动力学变化中发生发光反应。

2.1、竞争反应

其原理是：

用过量包被磁颗粒的抗体，与待测的抗原和定量的标记吖啶酯抗原同时加入反应杯温育，其免疫反应的结合形式有两种，一是标记抗原与抗体结合成复合物；二是测定抗原与抗体的结合形式。

如受检标本中含有待测抗原，则与标记抗原以同样的机会与磁颗粒包被的抗体结合，竞争性地占去了吖啶酯标记抗原与磁颗粒包被的抗体结合的机会，使吖啶酯标记抗原与磁颗粒包被的抗体的结合量减少。

由于磁颗粒包被的抗体是过量的，足以与待测抗原结合。

2.2、双抗体夹心法：

其原理是：

标记抗体与被测抗原同时与包被抗体结合成一种反应形式，即包被抗体-测定抗原-发光抗体的复合物。

具体讲是以顺磁性微珠作为载体包被抗体，利用磁性微珠能被磁场吸引，在磁场的作用下发生力学移动的特性，迅速捕捉到被测抗原，当加入标本后，标本中的抗原与磁性抗体形成复合物，在磁力的作用下，协助该复合物快速地与其他非特异性物质分离，使抗原-抗体结合反应的时间缩短，测定时间减少，降低了交叉污染的几率，此时再加入碱性磷酸酶标记的第二抗体，形成磁珠包被抗体-抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤去掉未结合的抗体后，加入ALP的发光底物环1，2-二氧乙烷衍生物AMPPD。

AMPPD被复合物上ALP催化，迅速地去磷酸基团，生成不稳定的中间体AMPD。

AMPD的快速分解，从高能激发态回到低能量的稳定态时，持续稳定地发射出光子（hv），发射光所释放的光子能量被光量子阅读系统记录，通过计算机处理系统将光能量强度在标准曲线上转换为待测抗原的浓度，并报告结果。

其检测水平可达pg/ml水平，重复性好。

3、电化学发光免疫分析（Electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLIA）

ECLIA是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术，是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合的产物。

它的标记物的发光原理与一般的化学发光（CLA）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。

ECL与CLA的差异在于ECLA是电启动发光反应，而CLA是通过化合物混合启动发光反应。

ECLA不仅可以应用于所有的免疫测定，而且还可用于DNA／RNA探针检测。

其检测原理（以TSH检测为例）：

第一步：

结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru（bpy）3]2++N羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。

第二步：

将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。

下一步，蠕动泵将形成的[Ru（bpy）3]2+-抗体-抗原-抗体-磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。

同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru（bpy）3]2+结合的抗体）也被吸出测量室。

紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。

发光剂[Ru（bpy）3]2+和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的[Ru（bpy）3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA●，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的[Ru（bpy）3]3+，使其形成激发态的[Ru（bpy）3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。

激发态的[Ru（bpy）3]2+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru（bpy）3]2+。

该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru（bpy）3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。

最后，终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。

4、时间分辨荧光免疫分析（timeresolvedfluoroimmunoassay，TRFIA）

TRFIA以镧系元素作为标记物所建立的免疫测定技术。

因镧系元素（如Eu3+）所发射的荧光寿命长，在测定特异性荧光时，可通过延迟检测时间而将标本或环境中的非特异荧光扣除，使其具有良好信噪比。

时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。

大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。

荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。

但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。

因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。

解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。

但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。

不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。

平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

4.1、时间分辨信号原理

普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stokes位移的大小。

如果Stokes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。

镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移，最大可达290nm，激发光谱和发射光谱间不会相互重叠，加上其发射的光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕的荧光寿命可达730us，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。

TRFIA的测量仪器是时间分辨荧光计，由三大部分组成：

光源：

脉冲光源：

氙灯（每秒闪烁1000次）；小型N2激光器；输出脉冲波长：

337nm荧光信号获取系统；数据处理系统医学教|育网搜集整理。

4.2、解离增强原理

解离增强镧系元素荧光免疫分析（DELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。

它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。

由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu从复合物上解离下来，自由Eu同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。

因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。

这是目前在时间分辨荧光免疫分析中应用最多的一种分析系统。