红细胞血型血清学试验.docx

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红细胞血型血清学试验

红细胞血型血清学试验

安徽省合肥市第一人民医院输血科

林正民江建锋陈玲梁晓浏

IgG抗A（B）测定

【原理】

血清以巯基乙醇（2-mercaptoethanol,简称2-me）处理后，IgM抗体分子裂解为6-7S

亚单位。

此种亚单位虽然仍保持与抗原结合的能力，但已失去与相应红细胞凝集的作用。

IgG抗体分子则不被2-me灭活，保持与相应红细胞致敏的血清学特性。

IgA抗体分子可部分被灭活（7S亚单体不受影响，9S及11S多聚体被灭活）。

【试剂】

1、0.2mol/L2-巯基乙醇应用液

取巯基乙醇1.6ml以pH7.4PBS（KH2PO41.73g,Na2HPO4·12H2O19.35g,NaCl8g加蒸馏水至100ml）稀释到100ml，分装安瓿，每支1ml或2ml,冰箱保存备用。

2、受检者血清。

3、5%A型和B型红细胞PBS（或生理盐水）悬液。

4、抗人球蛋白血清。

【操作】

1、吸取受检者血清0.4ml，加2-me应用液0.4ml，混合，将试管口塞紧，置37℃水浴中2h。

2、排列小试管（10mm×60mm）两排，每排10支，第一排每管各加pH7.4的PBS0.4ml。

3、第1排第1管加2-me处理血清0.4ml，混合，吸出0.6ml，移0.2ml至第2排第1管内，其余0.4ml移入第1排第2管内，混合。

以此类推，作倍量稀释至第10管，每管内留有1:

2,1:

4,…1:

1024不同稀释度的血清各0.2ml。

4、第1排每管各加5%A型红细胞悬液0.2ml，第2排每管各加5%B型红细胞悬液0.2ml，置37℃水浴温育1h。

5、结果观察

如在前几管内发现有红细胞凝集者，是由于高效价IgG抗A（B）或IgA抗A（B）所引起，称为“盐水效价”。

6、其余红细胞未见凝集的试管，再以pH7.4PBS洗涤3次，除去洗涤液，留取压实红细胞。

7、每管各加pH7.4的PBS2滴，混合。

8、每管各取1滴，分别移至另一排小试管中，再各加最适稀释度抗人球蛋白血清1滴，混合。

9、1000r/min离心1min。

10、轻轻摇动试管，观察结果，红细胞凝集的最高稀释度的倒数即为IgG抗A或抗B效价。

【附注】

1、本法常用于ABO血型IgG抗A或抗B效价的测定，如ABO新生儿溶血病母亲血清中IgG抗A（B）的测定。

2、二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）也可用于灭活IgM抗体，以测定IgG抗体。

方法：

0.01mol/LDDT（0.77gDTT溶于500ml等渗盐水）与等量受检者血清混合，置37℃水浴30min，再以此处理血清进行试验。

DTT的优点为无恶臭味，反应快速，但对强抗体灭活效果较差。

抗球蛋白试验

抗球蛋白试验（antiglobulintest,AGT）又称Coombs试验，是检查不完全抗体的一种很好的方法。

将抗球蛋白血清（antiglobulinserum，AGS）加入已致敏的红细胞盐水悬液中，红细胞表面的抗体球蛋白（使其致敏的不完全抗体）与抗球蛋白血清中的抗体发生特异性反应，使红细胞发生凝集。

抗球蛋白血清除了可以测定红细胞上的IgG抗体外，还可以测定IgM和IgA，也可以测补体组分（C3、C4）。

所谓广谱AGS即包括抗IgG和抗C3。

（一）直接抗球蛋白试验

【原理】利用抗球蛋白血清可与体内已被不完全抗体或补体致敏红细胞产生凝集反应，用于检查红细胞是否已被不完全抗体所致敏，如新生儿溶血病（胎儿红细胞被母亲血型抗体致敏）溶血性输血反应（输入的不相合红细胞被受血者不完全抗体致敏）自身免疫性溶血性贫血（患者红细胞被自身抗体致敏）以及药物诱导产生的自身抗体（由甲基多巴类药物、青霉素等所致）。

【试剂】

1、抗球蛋白血清（广谱及单价），市售合格产品。

2、用不完全抗D致敏的5%Rh（D）阳性红细胞盐水悬液供阳性对照用。

取3人O型红细胞，混合，经盐水洗涤后取压紧的红细胞，加等量抗D血清，置37℃水浴致敏30min,取出后离心去除上清液，以生理盐水洗涤3次，最后再用盐水配成5%红细胞悬液。

3、正常人5%D阳性红细胞悬液（未致敏），供阴性对照用，除不用抗D血清外，按上法配制。

【操作】

1、取受检查红细胞，以生理盐水洗涤3次，末次洗涤后，将上层盐水倒尽，再以滤纸将管口附着的盐水吸去，配成5%红细胞盐水悬液。

2、取上述5%受检者红细胞盐水悬液1滴，移入1小试管（10mm×60mm）内，加抗球蛋白血清1滴，混匀。

3、阳性对照：

用不完全抗D血清致敏的5%D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清1滴，混匀。

4、阴性对照：

正常人5%D阳性红细胞悬液1滴加抗球蛋白血清1滴，混匀。

5、受检者以及阳性、阴性对照管同时以1000r/min离心1min，轻轻侧动，观察结果。

6、结果判定如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，则受检者红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。

【附注】

1、标本采集后立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞上丢失。

2、抗球蛋白血清应按照说明书使用最适稀释度，否则可产生前带和后带反应，而误为阴性结果。

3、也有将浓的抗人球蛋白血清在白瓷板上做倍量系列稀释，再各加受检者10%洗涤红细胞悬液1滴，不断转动瓷板，肉眼观察凝集反应。

凡出现凝集的最高稀释倍数的倒数即为直接抗球蛋白试验效价。

这种效价并不表示受检者红细胞被不完全抗体致敏的强度。

4、受检红细胞一定要用盐水洗涤3次，除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，以防止假阴性结果。

5、最好对阴性结果进行核实：

即在试管中再加1滴IgG致敏红细胞，如果为阳性则表示试管内的抗球蛋白血清确未被消耗。

6、如需了解在体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，则可分别以抗IgG、抗IgM或抗C3单价抗球蛋白血清进行试验。

7、红细胞上吸附抗体太少，或Coombs阴性自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。

8、全凝集或冷凝集血液标本及脐带血标本含有Wharton胶且洗涤不充分，血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集，出现假阳性。

（二）间接抗球蛋白试验

【原理】本试验是一种检测血清中不完全血型抗体或补体的方法。

即用已知抗原的红细胞测定受检者血清中相应的不完全抗体，或用已知的抗血清测定受检红细胞上相应抗原。

常用血型鉴定、抗体的检出和鉴定、输血前交叉配血试验以及其他的特殊研究。

【试剂】

1、抗球蛋白血清（广谱及单价）。

2、受检血清，或已知抗体的血清。

3、5%已知抗原的红细胞悬液，或5%受检红细胞悬液。

4、IgG抗D血清。

5、AB型血清。

6、5%D阳性红细胞悬液。

【操作】

1、取试管3支，标明受检管，阳性对照及阴性对照。

2、按表1将各反应物加入相应试管内。

3、混匀，置37℃水浴1h，用生理盐水洗涤3次。

末次洗涤后，将上清液除尽，并用滤纸将附着于管口的盐水吸去。

每管再各加生理盐水1滴，混匀。

4、每管各加适当浓度抗球蛋白血清1滴，混匀，1000r/min,离心1min，观察结果。

表1间接抗球蛋白试验操作步骤

反应物

受检管

阳性对照

阴性对照

血清（已知或受检）

2滴

-

-

5%红细胞悬液（受检或已知）

1滴

-

-

IgG抗D血清

-

2滴

-

AB型血清

-

-

2滴

5%阳性红细胞悬液

-

1滴

1滴

5、结果判定阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝集者为阳性，表示受检血清中有不完全抗体，或受检红细胞上有相应抗原。

如阳性或阴性对照出现不规则结果应分析原因，重做。

6、效价滴定：

如果受检者血清中检出不完全抗体，可将受检者血清以盐水做倍量稀释后，按上法进行测定。

【附注】

1、经研究发现：

血清与相应红细胞在37℃水浴中致敏的时间，如致敏1h，75%的抗体吸附于红细胞上，如致敏时间延长达2h，则抗体吸附达90%，如以低强度离子盐水溶液（LISS）代替生理盐水配制5%红细胞悬液，则致敏时间可缩短，大多数抗体经致敏15-30min即可，但康Fy和抗Jk抗体需较长孵育时间。

2、红细胞洗涤应迅速，一开始洗涤就不应中途停止。

洗涤用盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松解。

切勿用手指堵住管口，颠倒混匀，以防污染来自皮肤的蛋白。

据研究，其量即使只有1：

4000稀释，即可中和抗球蛋白血清1滴。

3、离心速度和时间十分重要，应按规定进行，原则上应以最小的离心力和最短的离心时间能使阳性对照管出现阳性反应为宜。

4、如果检查的抗体为补体依赖抗体，则必需加入新鲜AB型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗C3。

放散实验

【原理】

红细胞上的抗原和血清中的抗体在适合的条件下发生凝集或致敏，这种结合是可逆的。

如改变某些物理条件，抗体又可以从结合的细胞上放散，再以相应的红细胞鉴定放散液内抗体的种类并测定其强度，用以判定原来红细胞上抗原的类型。

这种方法常用于ABO亚型的鉴定，全凝集或多凝集红细胞的定型，类B的放散实验以及新生儿溶血病的诊断等。

放散实验的方法很多，ABO血型IgM抗体以热放散法为常用。

Rh血型IgG抗体以乙醚放散法为常用。

一、加热放散法

【试剂】

1抗A和抗B分型血清

22%A型和B型试剂红细胞盐水悬液

3受检红细胞

【操作】

1、将受检红细胞以大量生理盐水洗涤3次，末次洗涤后，将盐水除尽，取压实红细胞1份，分别与2份抗A和抗B分型血清混合。

置4°C1小时，每隔10分钟将试管振摇1次，使充分混合。

2、离心去掉上清液，以4°C冷盐水洗涤红细胞3-4次，倾去洗涤液，留取压实红细胞。

用1/2容积的生理盐水（如放散液不立刻进行检查，应以AB型血清代替生理盐水）,置56°C水浴10分钟，每隔15秒振摇1次，使吸附在红细胞上的抗体充分放散。

3、立刻以3000转/分钟离心，离心式套管内放温水，使温度尽量保持在56°C，分离得到的上清液即为放散液。

4、将放散液用2%A型和B型试剂红细胞鉴定抗体，即可检出受检红细胞的血型。

如试验的目的是鉴定A亚型，则可用已知A亚型红细胞同时作放散实验，

按放散液抗体的强度A1＜A2＜A3＜AX＜AM，判定受检红细胞亚型的型别。

B亚型的放散液鉴定方法相似。

【附注】

1为了使放散液内含有最多的抗体，吸收血清应加大。

2放散时，应严格注意温度和时间。

温度过高红细胞易溶解；温度过低，抗体从红细胞上放散不完全。

3直接抗人球蛋白试验阳性的红细胞，如新生儿溶血病患儿或自身免疫性溶血性贫血患者，经洗涤后即可作抗体放散试验。

4放散液中抗体易变性，故应立即进行鉴定。

若需保存，应将抗体放散于AB血清或牛白蛋白液中。

（二）乙醚放散法

【试剂】

1、受检者血清。

2、相应抗原的红细胞（抗凝血）。

3、乙醚（分析试剂）。

4、AB型血清。

【操作】

1、取具有相应抗原的抗凝血，离心后吸取血浆，加大量生理盐水洗涤1次，离心后取压实红细胞备用。

2、取受检者血清5ml，加压实红细胞1ml，混匀后放在适当温度中1h，期间摇匀1—2次，离心。

3、离心后取出，将上清液吸出另放1管，鉴定上清液中抗体。

将红细胞用盐水洗涤3次，离心压实红细胞。

4、取1体积压实红细胞，加1体积AB型血清或生理盐水和2体积乙醚，颠倒混匀10min，然后以3000r/min离心5min。

5、离心后即分成三层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是具有抗体的放散液，其色深红。

6、用清洁的吸管吸出放散液。

若有混浊，可再离心1次。

7、将放散液放置37℃水浴30min，除尽乙醚，然后鉴定抗体。

【附注】

本试验适用于鉴定Rh抗体。

最大优点用于检测获得性溶血性贫血，此种患者的红细胞未直接抗球蛋白试验阳性，说明在体内已有自身抗体吸附在红细胞上。

这种抗体常有Rh特异性。

吸收试验

【原理】

当受检细胞加入已知效价的抗A及抗B血清后，若红细胞上有相应的抗原，便吸收血清中的抗体，再以已知抗原的红细胞来滴定，比较吸收前后抗血清中抗体效价，便可证明受检红细胞上有无相应抗原以及强度，间接判定受检红细胞的血型及亚型的种类。

【试剂】

1、抗A及抗B分型血清。

2、2％A型及B型试剂红细胞。

3、受检红细胞。

【操作】

1、将受检红细胞用盐水洗涤3次，末次洗涤后将盐水倒尽。

取压实红细胞1份，与等量抗A血清混合；另取1份与等量抗B血清混合。

放置4℃冰箱至少1小时，每10min将试管摇动1次，使红细胞充分吸收抗体，然后离心，上层血清即吸收液。

2、排列10mm×60mm小试管4排，每排5支，每管各加生理盐水0.2ml。

第1、3两排第1管分别加己吸收抗A及抗B血清0.2ml；第2、4两排第1管分别加未吸收抗A及抗B血清0.2ml；分别作2—32的倍量稀释。

3、第1、2两排每管各加2%A型红细胞盐水悬液0.2ml，第3、4两排每管各加2%B型红细胞盐水悬液0.2ml。

4、将试管振摇使红细胞充分混匀，置室温1小时（或1000r/min离心1min），观察凝集反应。

5、吸收后，抗A效价较未吸收抗A效价显著降低或消失者为A型（B型判定同理），若吸收后抗A和抗B都显著下降为AB型，若吸收后抗A和抗B效价都无显著差异者为O型。

若试验目的是鉴定A亚型，则按受检红细胞的吸收强度，A1>A2>A3>Ax>Am规律来判定。

B亚型鉴定与此类似。

【附注】

1、本试验用以间接证明红细胞上血型抗原及其强度，常用于ABO亚型鉴定、全凝集或多凝集红细胞定型以及某种原因引起红细胞血型抗原减弱时的定型等。

2、试验所用抗A及抗B血清效价不宜过高，应先将抗血清效价稀释到32倍为宜。

若抗血清效价太高，抗血清被A亚型红细胞吸收后效价下降不明显，难以判断结果。

3、红细胞经洗涤压实，盐水应尽量去尽，以免抗血清被稀释。

4、吸收试验的温度应根据抗原抗体反应的最适温度来确定。

ABO系统以4℃为宜，Rh系统以37℃为宜。

红细胞血型抗体筛查

红细胞血型抗体检查适用于下列情况：

1、ABO血型鉴定发现受检者血清中有ABO血型以外的抗体时；2、供血者血清抗体筛检；3、输血前受血者血清抗体检查；4、输血后溶血性输血反应疑为由同种抗体引起时；5、孕妇血清的抗体检查；6、新生儿溶血病婴儿血液中抗体检查；7、直接抗球蛋白试验阳性红细胞上抗体的检查。

【试剂】

1、试剂红细胞。

2、血清标本或红细胞放散液。

【操作】

1、盐水介质法

（1）取受检者血清2滴于标好的试管中。

（2）取2％试剂（筛查）红细胞悬液1滴于每个试管中混合。

（3）1000r/min离心1min（离心速度和时间按质控规定）。

（4）观察溶血和凝集反应，记录结果。

（5）按需要置于室温（22～24℃）温育15～30min。

（6）离心，观察溶血和凝集并记录结果。

溶血或凝集均为阳性结果。

2、酶法

（1）取受检者血清2滴，置于试管中。

（2）加2％试剂（筛查）红细胞悬液1滴。

（3）加1％菠萝酶（或木瓜酶）pH5.5PBS溶液1滴，混合。

（4）置于37℃温育30min。

（5）离心，将试管轻轻侧动并观察有无凝集，记录结果。

3、抗人球蛋白试验

（1）取受检者血清2滴，置于标记好的小试管中，加2％～5％试剂红细胞盐水悬液1滴，37℃温育30～60min。

（2）离心，观察溶血和凝集，并记录结果。

（3）再彻底悬浮细胞，用盐水洗涤3次。

（4）最后一次洗涤后，弃掉全部盐水，将试管边缘盐水用滤纸吸干。

（5）按试剂说明加抗人球蛋白血清1滴，充分混合。

（6）离心，轻轻悬浮细胞，观察凝集反应，记录结果。

（7）如结果为阴性者，应加IgG包被的细胞1滴，离心并观察结果，如果也不凝集，表示试验无效，必须重做。

4、低离子强度盐溶液（LISS）法

（1）将适当容量的试剂红细胞用盐水洗涤3次，将盐水全部倾去。

（2）用LISS溶液将红细胞配制成2％混悬液。

（3）加受检者血清2滴于标记的试管中。

（4）加2％红细胞LISS悬液2滴。

（5）混合，置于37℃温育15min（延长温育时间可引起某些抗原变质）。

（6）离心，检查溶血及凝集，并记录结果。

（7）用盐水洗涤3次，除尽洗液，加抗人球蛋白血清1滴。

（8）离心，观察结果。

【附注】

1、上述各种抗体筛查方法对证实具有特别的血清学特性的抗体是有利的。

各实验室根据条件可制订抗体检查的常规方法。

2、对患者血清的抗体筛查要包括能证明在37℃下有抗体活性的方法，盐水介质、LISS可任意选择，但抗人球蛋白试验是必需的。

对有妊娠史和输血史的供血者，血清均要做抗体筛查。

所用方法不需要像用于检查血样那样敏感，因为在输入的血液中弱反应抗体实际上是没有临床意义的。

摘自《全国临床检验操作规程（第3版）》

《中国输血技术操作规程（血站部分）》

《输血技术学》第二版王培华