水中大肠菌群的测定.docx
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水中大肠菌群的测定
水肠菌群的测定
报告题目
水肠菌群的测定
作者
班级
生科1104班
指导教师
完成时间
2013年6月
生物学实验教学中心
水肠菌群的测定
〔指导教师：
〕
〔师学院生命科学学院生物技术1104班435002〕
摘要：
测定青山湖水中的大肠菌群的含量。
将待测水分别稀释10倍、100倍、1000倍3种梯度在三倍浓缩培养基37℃培养24h后挑选出产酸或产气的菌画线接种到伊红美蓝平板中37℃培养24h，将培养基中表现为阳性的菌落做革兰氏染色镜检为阴性的菌种接种到乳糖蛋白胨培养基中37℃培养24h,挑选大肠杆菌阳性菌。
结果稀释10倍的水有3管大肠杆菌阳性菌，稀释100倍的水有3管，稀释1000倍的有2管，即青山湖水肠杆菌的含量为MPN=11000.
关键词：
大肠杆菌、多管发酵法青山湖水
水肠菌群的测定
〔指导教师：
〕
〔师学院生命科学学院生物技术1104班435002〕
引言
水对我们的生命起着重要的作用，它是生命的源泉，是人类赖以生存与开展的不可缺少的最重要的物质资源之一。
人的生命一刻也离不开水，水是人生命需要最主要的物质。
水也是大肠菌群的天然环境，一般地面水比地下水含菌数量多，并易被病原菌污染。
人饮用后引发疾病。
水质细菌学检验是培水与污水水质分析工作中的一项重要指标。
水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水平安和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
国家饮用水标准规定，饮用水肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每毫升不超过100个。
1实验材料
药品：
蛋白胨，牛肉膏，乳糖，蒸馏水，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液，2%伊红〔曙红〕水溶液，0.5%美蓝〔亚甲蓝〕水溶液，氢氧化钠水溶液。
工业酒精、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液，番红复染液，香柏油，二甲苯。
仪器（生产厂家）：
显微镜，天平，培养箱，水浴锅，平皿，德氏管，刻度吸管，洗耳球，无菌涂布棒，量筒，灭菌锅，酒精灯，接种环，棉花，棉线，报纸。
菌种：
青山湖水肠杆菌
2实验步骤〔参照实验书〕：
2.1配制培养基与灭菌
1.乳糖蛋白胨培养基的配制〔供多管发酵法的复发酵用〕
〔1〕
蛋白胨
1g
牛肉膏
0.5g
乳糖
0.5g
氯化钠
0.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
0.1mL
蒸馏水
100mL
2、三倍浓缩乳糖培养基
〔1〕
蛋白胨
3g
牛肉膏
1.5g
乳糖
1.5g
氯化钠
1.5g
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
0.3mL
蒸馏水
100mL
3.灭菌
●移液管的包装：
将移液管的尖端，放在4-5cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管尖端，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下的纸折叠打结。
多支包装，待灭菌。
●培养皿的包装：
培养皿由一底一盖组成一套，用报纸将10套培养皿〔皿底朝里，皿盖朝外，5套、5套相对而放〕包好。
●棉塞的制作：
按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中间厚、周围逐渐变薄的近正方形，折一个角后〔成五角形〕卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口，棉塞不宜过紧或过松用手提棉塞，以管、瓶不掉下为宜。
棉塞四周应紧贴管壁或瓶壁不能有褶皱，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。
棉塞的直径和长度视试管和锥形瓶的大小而定，一般约3/5塞入管。
必须做到松紧适宜，紧贴管壁，拔出时不松散、不变形。
●将所有准备待灭菌物品，包扎好后置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
●将上述灭菌物品贮存于冷暗处备用。
1.2初发酵实验。
配制350ml三倍的乳糖蛋白胨培养液〔每组取45ml〕，分装到9支试管中，每支试管参加一个倒放的布氏小管，保证小管无气泡。
取水样并作梯度稀释，分别稀释出10倍，
0倍，1000倍，在培养基中参加3中浓度的菌液10ml，每个稀释浓度各重复3个，混匀37度培养24h。
2.3平板别离。
培养后产酸，产气或仅产酸的发酵管为阳性反响，否那么为阴性。
配制伊红美蓝培养液1200ml〔每组取200ml〕，然后倒12个平板，分别将9支试管中的菌用画线法接种到培养基上，。
再随机从3种浓度的菌液中随机取一管进展接种。
37度培养24h。
将培养基中的菌种挑取少许进展革兰氏染色，再做镜检。
革兰氏染色：
将带有上述典型特征的菌落〔在伊红美蓝平板上大肠杆菌群的典型菌落为深紫黑色，具有金属光泽；或者为紫黑色，不带或略带金属光泽；或者为紫红色、中心较深的菌落〕做革兰氏镜检：
将大肠杆菌菌落涂片，枯燥，固定。
然后加草酸铵结晶紫一滴，染色1分钟后倾去染液，水洗至流出水为无色。
用卢戈氏碘液覆盖1分钟，倾去碘液，水洗至流出水为无色。
再用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，并衬以白纸背景，用95%乙醇滴洗至刚刚无紫色为止，25S，然后立即用水冲去乙醇。
将玻片上残留的水用吸水纸吸去，用番红复染液染色2分钟，水洗，吸去残水，晾干。
枯燥后，油镜观察。
以分开的细菌颜色为准，革兰氏阳性菌呈紫色。
阴性菌呈红色。
2.4复发酵。
配制100ml乳糖蛋白胨培养基，分装10管〔每管均参加布氏小管〕，高温灭菌。
将镜检结果为阴性的菌种对应的培养基上的菌种接种到乳糖蛋白胨培养基上，37度培养24h，仍产酸，产气的是大肠菌群阳性。
2.5结果计算。
根据三个稀释度中的阳性管数组成的一个数量指标，查表计算结果。
3结果与分析
1.大肠杆菌初发酵后的实验现象：
稀释度
0.1
0.01
0.001
管号
1
2
3
1
2
3
1
2
3
现象
气泡较多，溶液变黄
有气泡，溶液变黄
有气泡，溶液变黄
有气泡，溶液变黄
气泡较少，溶液变黄
2.伊红美蓝培养基的筛选后的实验现象：
稀释度
0.1
0.01
0.001
管号
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
镜检现象
阴
阴
阴
阴
阴
阴
阴
阴
阳
4阴
阴
阴
3.大肠杆菌复发酵的实验现象：
稀释度
0.1
0.01
0.001
阳性管数
3
3
2
大肠杆菌MPN
11000
实验分析：
大肠杆菌是一大类群的总称并不是哪一种的种名，这一类群中包括好多种，这些种中有的仅产酸有的既产酸又产气。
大肠杆菌在伊红美蓝中菌落具有典型的特征，依据菌落的特征可以进展筛选再由革兰氏染色进展确认。
本次实验中初发酵中现象均为阳性，在进展筛选中有6个培养皿中镜检为阴性，但镜检中发现大肠杆菌的密度很低。
在复发酵的实验结果中培养一天各管并未产气且仅有一管产酸，可能是复发酵挑选的菌局部不是大肠杆菌，也有可能是菌浓度过低，还有可能是在挑菌是挑的太少或是在操作时不规如在灼烧接种环时未待冷却使菌受到损伤或直接烧死了，这些均会是结果不理想。
总结
释10倍的水有3管大肠杆菌阳性菌，稀释100倍的水有3管，稀释1000倍的有2管即青山湖水肠杆菌的含量为MPN=11000.
实验容与安排的建议、实验感受、实验改良想法等
操作分析
1、培养基的配制灭菌
1〕在培养基分装过程中注意乳糖培养基与三倍乳糖培养基的量，其中三倍乳糖培养基是每管10ml,乳糖培养基每管5ml。
2〕杜氏小管在倾斜的放入装有培养基的试管出现了气泡，将试管倒立使气泡排空后再正放即可排除气泡。
3〕在整理所需灭菌物品时，由于训练缺乏整体上还是有点混乱，不过能与时解决。
4〕培养基的配制仪器的包扎与包装比拟熟练，未出现问题。
2、水样采集与稀释，初发酵实验
1〕用移液管移取菌液时，单手操作能力还是欠缺，总习惯性的把试管塞放到桌面上。
在微生物实验过程中，最重要的就是要时刻保持无菌条件，因此一些试管塞应该放到手上而不是桌上。
在翻开每一个试管塞时应该将试管口在火焰上灼烧，操作时尽量距离酒精灯近一些。
2〕移液管依然是用吸耳球吸取液体，由于无菌操作台的玻璃门开启幅度不能过高，以不超过下巴为宜，因此双手在操作台里操作很僵硬，受到限制，移取液体很不方便；多熟悉在无菌操作台条件下进展实验的环境并且要培养自己单手操作的能力，在无菌操作台里尽量防止用吸耳球辅助移液管移取液体，而是训练用口操作。
3〕还是准备的不充足，在无菌操作台里需要提前把实验过程中需要用到的一些仪器与试剂等放到里面提前灭菌消毒二十分钟，考虑不全面总会时不时突然想到还有什么东西没拿进来灭菌消毒，于是在这个地方耽误了很长时间。
因此每次用无菌操作台之前，应该在实验室里将所需物品准备齐全，最好能考虑周到，可以小组互相讨论，将遗漏的物品补齐。
4〕初发酵将稀释好的样液倒入试管中应注意将样液缓缓地倒入以免倒入过猛而导致气泡进入杜氏小管，或导致培养基的飞溅。
5〕在参加样液前未做好标记，增添了实验的复杂度，应注意实验前应贴好标签以使实验过程更清晰。
3、平板别离
1〕倒平板时培养基的量倒的过多，导致培养皿的培养基层过厚；倒平板时，右手持装有培养基的三角瓶，左手将瓶入培养基约15ml，量不能过多，然后盖上盖子，轻轻晃动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，最后平置于桌面上，冷却凝固。
2〕划线别离时划线的方式有误，如接种环在酒精灯灼烧后未完全冷却就立即划线，可能会引起某些菌由于局部过热而丧失生命活性；划线太过密集，稀释次数少，可能无法形成单菌落。
平板划线别离：
a.接种环蘸取菌液的度是菌液在接种环上形成一个可见的水液面
b.划线时,培养皿在左手,接种环在右手,皿盖翻开的围足够接种环伸进去划线
c.划线时先将接种环在酒精灯上灼烧,然后放在培养皿中间的培养基上轻轻划动冷却接种环,然后蘸取少量菌液在培养基上划线
d.划线的力度要控制好,第一次三条线将接种环倾斜一点平划,是环上菌液落入培养基外表,再转动培养皿,用同样的方法划线,重复此类操作三至四次.
4、革兰氏染色、复发酵实验
1〕革兰氏染色，五个装片做了两次才成功，可能原因是：
a.涂片时菌液过少,在显微镜下观察时,一个视野类的菌太少,很难判定革兰氏染色的结果是阴性菌还是阳性菌
b脱色时间不够,紫色未完全褪去
c.番红复染时间不够,视野里的菌大局部未被上色,对判断是阴性菌还是阳性菌有干扰;d.菌液在载玻片上分布不均匀。
解决的方案：
（1）可以重复涂片几次,但防止涂片过厚,导致视野里菌过多；
（2）用乙醇脱色的标准是乙醇滴洗至刚刚无紫色为止,为了便于分辨颜色可以在玻片下垫一白纸；
（3）番红染色的时间最终是控制在4min左右,尽量控制染色时间适宜；
（4）虽然复发酵实验在操作上没有什么问题,但我们根据实际情况对书上的一些操作进展了调整,在将革兰氏染色镜检为阴性无芽孢杆菌的菌落按无菌操作接种到装有乳糖蛋白胨培养基的试管中时,由于一次挑取的菌种比拟少,因此每个试管都各自接种了三次,保证每个试管里都有足够的大肠杆菌进展复发酵实验。
实验感受：
经过我们小组各成员的积极配合、共同努力，我们的实验得到了圆满完毕。
在实验过程中，我们也遇到了不少困难，但大家齐心协力，一起讨论问题的解决方法，才使的这两个实验都顺利地完成。
这两个实验，让我们更好地水中细菌与大肠菌在我们的生产、生活中的作用，明确饮用水的符合标准，更好地应用到我们的实践中去。
同时，也学到了水中微生物在保证平安用水和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。
通过此实验，让我们懂得只有大家团结合作，不怕困难才能更好地克制各种困难，同时，还了解了用平板菌落计数的方法和多管发酵法，为我们今后的工作打下根底。
在以后的实验中，我们会从本实验中吸取教训与经历，争取得更大的进步、掌握更多的技术。
参考文献
1萍，向东，微生物学实验[M].4版：
高等教育，2007
4.斌，何绍江.微生物学实验[M].：
科学，2002.
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