水飞蓟宾对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用及其机制.docx

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水飞蓟宾对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用及其机制

水飞蓟宾对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用及其机制

【摘要】　　目的研究水飞蓟宾（Silibinin,SB）在体外对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用及其相关机制。

方法采用MTT法观察不同浓度SB对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用；倒置显微镜下观察细胞形态变化；RTPCR检测凋亡抑制因子Survivin的mRNA表达变化。

结果MTT检测发现：

随着SB浓度增加和作用时间延长，对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用增强，且各组间比较均有显着性差异（），并呈时间剂量依赖关系；倒置显微镜发现应用SB干预后，5637细胞体积缩小，变形，胞浆浓缩，核固缩深染；人膀胱癌细胞株5637中Survivin的mRNA表达随着SB浓度增加和时间延长相应下降。

结论SB可抑制人膀胱癌细胞株5637的增殖；并下调凋亡抑制因子Survivin的mRNA表达。

【关键词】水飞蓟宾；癌；膀胱癌；增殖；survivin；人膀胱癌细胞株5637

　　Effectofsilibininonproliferationofhumanbladdercancercell　5637invitroandrelatedmechanism

　　ABSTRACT:

ObjectiveTodeterminetheeffectsofsilibininoninhibitingtheproliferationof5637cellinvitroandtoinvestigatetherelatedmechanism.MethodsThecellgrowthactivitywasevaluatedbyMTTassay.Morphologicalchangeswerestudiedthroughtheinvertedphasecontrastmicroscope.Theexpressionofsurvivin（inhibitorofapoptosisprotein）mRNAwasdeterminedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction（RTPCR）.ResultsSilibinintreatmentof5637cellsresultedinamoderatetostronggrowthinhibitioninbothadoseandatimedependentmanner.Thereweresignificantdifferencesbetweenthesegroups（）.Thesemorphologicalchangesof5637whichweretreatedwithsilibinin:

cellsshrankandturnedround,condensedcytoplasmaandpycnosisednucleuswereobservedthroughtheinvertedphasecontrastmicroscope.TherewasalsosignificantdifferenceinthepositiveexpressionofsurvivinmRNAbetweenthe5637celltreatedbydifferentiatedsilibinin.ConclusionSilibinincouldinhibitthegrowthofhumanbladdercancer5637cellsanddownregulatetheexpressionofsurvivin.

　　KEYWORDS:

silibinin;carcinoma;bladdercancer;proliferation;survivin;5637cellline

　　水飞蓟素（SM）是从菊科植物水飞蓟中提取的黄酮类化合物，其组份中水飞蓟宾（silibinin,SB）含量最多，生物活性也最强。

已知SB具有抗自由基活性、抗脂质过氧化、抑制5脂氧合酶等多种作用。

近几年来研究还发现SB对各种上皮源性的肿瘤如前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌等均具有良好抑制作用，并且已进入治疗前列腺癌的I期临床试验，但关于SB对膀胱癌的作用，国内外研究甚少。

本文将研究SB在体外对人膀胱癌细胞株5637的抗增殖作用及其相关机制。

　　1材料与方法

　　细胞株人膀胱癌细胞株5637购自美国ATCC细胞库。

　　主要试剂水飞蓟宾SB（C25H22O10·H2O）为美国Sigma公司产品，相对分子质量；RPMI1640培养液为GIBCO公司产品；胎牛血清为杭州四季清生物制品公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）为美国Sigma公司产品；脱氧核苷三磷酸（dNTP）、RNA酶、聚合酶链反应（PCR）的相对分子质量标记（Marker）为日本TaKaRa公司产品；PCR引物由上海生工公司合成。

　　SB的配制：

SB由二甲基亚砜（DMSO）助溶，过滤除菌，试验时用RPMI1640培养液稀释。

　　细胞培养细胞株培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液（内含1g/L青霉素+链霉素），并置于37℃，50mL/LCO2培养箱内备用。

　　MTT法检测SB对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用取对数生长期的人膀胱癌细胞株5637细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，取200μL接种于96孔培养板中。

实验组SB的终浓度分别为0、25、50、100、200、400μmol/L。

每种浓度设6个平行孔，于37℃，50mL/LCO2培养箱内分别培养24、48、72、96h后倾去培养液，每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL继续孵4h，每孔加入150μLDMSO，振荡10min。

最后于酶标仪490nm处测定各孔吸光度（A）值，重复6次，求平均值。

设空白组作为测吸光度调零用。

　　细胞增殖抑制率=[对照组A值实验组A值]/对照组A值×100%

　　分组及浓度、时间选择设控制组（DMSO）、SB组。

根据MTT结果，SB组选择0、50、100、200μmol/L。

作用时间选择24、48、72h。

　　SB作用后5637细胞形态的改变细胞分组、处理同，倒置显微镜下观察培养细胞形态。

　　RTPCR检测Survivin的mRNA表达变化Trizol一步法提取细胞总RNA，调整RNA为1mg/L。

取2μg总RNA用MMLV逆转录酶逆转录，PCR扩增survivin，同时扩增βactin作为内参照。

Survivin基因引物序列上游引物（5′CTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAA3′），下游引物（5′AATAAACCCTGGAAGTGGTGCA3′），产物长度为453bp。

循环条件：

预变性95℃5min，变性94℃1min，退火56℃1min，延伸72℃45s，循环35次，终延伸10min。

PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。

　　统计学处理应用统计软件进行统计学分析。

数据以（±s）表示，采用单因素方差分析。

以为有显着性差异。

　　2结果

　　SB对人膀胱癌细胞5637生长曲线的影响处于对数生长期的人膀胱癌细胞株5637按照各组要求给予相应处理后，控制组（DMSO）和SB组中0μmol/L组的细胞分裂增殖旺盛，形态正常，生长状态良好，两组细胞生长无明显差异；SB干预各组均产生抑制作用，细胞分裂增殖在干预后24h开始出现差异，第48h100、200、400μmol/L三组细胞增殖抑制作用明显，细胞数目减少（图1）。

　　图15637细胞在SB作用下5637细胞的生长曲线

　　Growthcurvesin5637celllineafterexposuretosilibinin

　　SB对人膀胱癌细胞5637的生长抑制作用不同浓度的SB对5637细胞均有抑制作用，药物浓度越大，抑制作用越强；作用时间越长，SB的抑制作用越明显，呈现时间剂量依赖关系（表1）。

　　SB作用后5637细胞形态的改变倒置显微镜下可见DMSO组和SB0μmol/L组细胞贴壁生长良好，细胞间连接紧密，轮廓清晰，胞体饱满透亮。

SB组细胞不同程度连接松散，细胞变形扭曲，部分细胞发生皱缩、崩解，胞体折光性减弱，胞浆中有较多颗粒。

随作用时间和SB浓度加大，细胞变形越严重（图2），漂浮细胞增多。

　　表1MTT法检测SB对5637细胞增殖的抑制作用

　　Table1Theinhibitoryeffectofsilibinintreatmenton5637cellasassessedbyMTTtest

　　Atthesametimepoint,*;**vs.thecontrolgroup

　　图2不同浓度SB与5637细胞作用24、48、72h后形态学改变

　　Themorphologicalchangesof5637treatedwithsilibinin（×100）

　　A:

50μmol/L（24h）;B:

100μmol/L（24h）;C:

200μmol/L（24h）;D:

50μmol/L（48h）;E:

100μmol/L（48h）;F:

200μmol/L（48h）;

G:

50μmol/L（72h）;H:

100μmol/L（72h）;I:

200μmol/L（72h）

　　RTPCR检测Survivin的mRNA表达变化应用200μmol/LSB组5637细胞中Survivin基因的表达在药物作用24h后较其他组明显下降，在作用48h和72h后未检测到；应用100μmol/LSB组5637细胞中Survivin基因的表达在药物作用48h后较24h组明显下降，在72h后未检测到；应用50μmol/LSB组5637细胞中Survivin基因的表达在作用72h后较24h和48h组明显下降（图3）。

　　图3逆转录聚合酶链反应检测5637细胞中Survivin的表达

　　TheexpressionofSurvivinin5637cellsdetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction（RTPCR）

　　M:

50bpDNAladdermarker;B:

βactin;O:

negativecontrol;1:

5637cellstreatedwithDMSOfor24h;2、3、4、5:

SB0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L（24h）;6:

DMSO（48h）;7、8、9、10:

SB0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L（48h）;11:

DMSO（72h）;12、13、14、15:

SB0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L（72h）

　　3讨论

　　膀胱癌作为我国泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤[1]，其中70%-80%为浅表性膀胱癌。

治疗浅表性膀胱癌主要采取膀胱部分切除和经尿道膀胱肿瘤电切术。

但术后3-5年内复发率高达60%-90%，且绝大多数于术后1年内复发。

所以浅表性膀胱肿瘤手术后一般都采用膀胱灌注疗法来预防肿瘤的复发和抑制肿瘤向恶性发展。