间歇性低氧对肝细胞脂代谢的影响及其可能机制的.docx
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间歇性低氧对肝细胞脂代谢的影响及其可能机制的
间歇性低氧对肝细胞脂代谢的影响及其可能机制的探索
摘要：
目的探讨间歇性低氧对肝细胞脂质代谢的影响及其可能机制方法肝细胞L02HepG2分别于三气培养箱中（2%025%C0293%N2）处理8小时/天，5天。
建立肝细胞间歇性低氧模型，以21%02培养的L02HepG2作为对照组。
MTT检测细胞存活率，甘油三酯（TG）测定肝细胞脂肪性变程度，荧光显微镜观察细胞内活性氧的变化，Westernblot检测HIF-1α、HIF-2α、ADFP、SREBP-1c、FAS蛋白表达量。
结果实验组较对照组肝细胞内出现脂质异常沉积，低氧组L02HepG2肝细胞TG含量较对照组明显增多分别为（78.7±2.73）vs（25.11±5.86）t=16.58p<0.05;（96.4±3.67）vs（21.4±3.9）t=28.01,p<0.05;表明肝细胞间歇性低氧肝细胞脂变模型构建成功。
ROS在对照组有基础表达，随着间歇性低氧处理时间延长L02HepG2细胞内ROS的含量增多绿色荧光琢渐增强。
Westernblot结果显示实验组较对照组HIF-1α、ADFP、SREBP-1c、FAS表达增加并且随时间的延长表达量增多（p<0.05），HIF-2α的蛋白表达水平实验组第1天较对照组增高（p<0.05）但是第2、3、4、5天的HIF-2α较实验组第1天的表达减少（p<0.05）。
结论：
间歇性低氧诱导产生ROS通过调节低氧诱导因子和脂肪分化相关蛋白的表达，影响HIF-1α-SREBP-1c-FAS和ADFP途径导致肝细胞脂代谢异常。
关键词间歇性低氧活性氧肝细胞脂变低氧诱导因子
【Abstract】objectivetoexploretheeffectofinternmententhypoxiaonlipidmetabolisminhumanhepaticcelllinesandpossiblepathwaysoflipidmechanism.methodstoestablishintermententhypoxiacellmodel,L02andHepG2cellswereexposedtoForma3131incubator（Thermo,USA）with2%025%C0293%N2for8hoursperday,5daysneeded.controlgroupswereculturedin21%02incubater.lipiddropletsandTGinhypatocytewereobservedbybiochemicalassays.ThechangeofintracellularreactiveoxygenspeciesisobservedbyInvertedFlurescenceMicroscopy.theexpressionofproteinlevelshypoxia-induced-1α（HIF-1α）、HIF-2α、SREBP-1c、FAS、ADFPweredetectedbywestern-blot.ResultstheaccumulationoflipiddropletsandthecontentofTGintheexperimentgroups（2%02）weresignificantlyhigherthanthecontrolgroupsinL02、hepG2cellsrepectively（78.7±2.73）vs（25.11±5.86），t=16.58p<0.05;96.4±3.67）vs（21.4±3.9）t=28.01,p<0.05;theysuggestedthattheintermententhypoxiacellmodelissuccessfullyestablished。
ROSisexpressedbasicallyinthecontrolgroup，aftercontinuouslyinfluencedbyintermittenthypoxiaintracellularROScontentisgraduallyincreasedandgreenfluorescentisenhanced.comparedwiththecontrolgroups,theespressionoftheinterestpproteinsHIF-1ADFPSREBPFASwereupregulatedremarkly（p<0.05）.Instrikingcontrast,HIF-2αlevelmarkedlydecreasedincellsexposedtoIHexceptthefirstday,s.conclusionInIntermententhypoxiacondition，ROScouldregulatetheexpressionofhypoxiainduciblefactors、adiposedifferentiation-relatedprotein，EffectthefattyacidmetabolismviaHIF-1α-SREBP-1c-FASandupregulatetheproteinofADFP.
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）是一类除酒精和其他明确因素影响，以肝细胞内脂质过度沉积为主要特征的临床病理综合征【1】。
近来有文献报道，阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructivesleepuapnea-hypopneasyndrome，OSAHS）患者肝细胞内有异常的脂质沉积，认为慢性睡眠呼吸暂停综合征所致的间歇性低氧（intermenthypoxia，IH）可以诱发肝细胞脂质异常代谢，目前有关间歇性低氧与肝细胞脂代谢之间的关系鲜见研究报道【2-3】。
本实验利用三气培养箱和人正常肝细胞（L02）和肝癌细胞（hePG2）建立间歇性低氧细胞模型，探讨间歇性低氧对肝细胞脂代谢相关分子的影响，为治疗和预防NAFLD提供新的理论依据。
1材料和方法
1.1材料：
正常人肝细胞株L02和人肝癌细胞株hepG2（重庆医科大学附二院消化实验室），胎牛血清（杭州四季青生物），RPMI1640、DMEM培养基（hyclone美国），活性氧检测试剂盒（凯基生物南京），甘油三酯试剂盒（长春汇力），SREBP-1c（sc-13551）、FAS（sc20140）抗体（Santacruz美国）；HIF-1α（EP1215YEPITOMICS美国），HIF-2α、ADFP（北京博奥森），三气培养箱（Forma3131Thermo美国）。
1.2细胞培养和实验分组：
L02、hepG2细胞分别用含10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培养基培养，实验设为对照组（常氧组：
21%02，实验组（低氧组:
2%02，细胞低氧处理8h/d，分别处理5天分为5个组）。
1.4检测细胞内甘油三酯（TG）的变化：
将1.0×104/mlL02、hepG2细胞接种于1㎡的培养皿，置三气培养箱（2%02）8小时/天，处理1-5天后收集细胞，按照甘油三酯试剂盒的说明进行操作，BCA法检测蛋白含量，计算每毫克蛋白所对应的TG含量（μg/mg）.
1.5检测细胞内活性氧（ROS）的变化：
将1.0×104/mlL02、hepG2细胞接种于1㎡的培养皿，置三气培养箱（2%02）8小时/天，处理2、4天后，按照活性氧检测试剂盒的说明操作，荧光显微镜下观察细胞内活性氧的变化。
1.5Westernblot检测HIF-1αHIF-2αADFPSREBP-1cFAS蛋白的表达:
按蛋白提取试剂盒说明提取目的蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，加入兔抗多克隆抗体HIF-1α（1：
1000稀释）、HIF-2α（1:
200稀释）、FAS（1:
1000稀释）、ADFP（1:
10000稀释），鼠抗多克隆抗体SREBP-1c（1:
200稀释）4℃缓摇过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或鼠IgG（1:
10000稀释），ECL显影，以β-actin为内参照，Quntityone4.52软件数据分析。
1.6统计学分析：
用SPSS19.0软件分析，计量资料以
表示,两样本均数间比较采用成组设计资料的t检验，多个样本均数的比较采用单因素方差分析,多个样本间的两两比较用q检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1体外间歇性低氧诱导成功建立肝细胞脂变模型。
2.1.2实验组肝细胞内的TG含量较对照组增加
实验组第1天肝细胞内TG含量与对照组比较L02t=0.827,P=0.439>0.05,HepG2t=1.8591,P=0.1124>0.05，差异无统计学意义;第2、3、4、5天TG含量明显增加与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），表明间歇性低氧可以诱导肝细胞脂肪变性，NAFLD细胞模型构建成功。
表格1.各时间点肝细胞内甘油三酯的含量（
）ug/mg
组别（n=3）
对照组
间歇性低氧组
1d
2d
3d
4d
5d
LO2
2%O2
25.11±5.86
28.16±4.48
41.81±5.57a
54.9±5.96a
69±2.43a
78.7±2.73a
HepG2
2%O2
21.4±3.9
25.5±2.06
41.94±4.9a
61±5.79a
82.78±6.7a
96.4±3.67a
注：
n实验重复次数；a与对应的对照组比较，P＜0.05；
2.2.实验组肝细胞内ROS含量较对照组增多
ROS在对照组有少量表达可见较弱的绿色荧光，实验组第2天、第4天绿色荧光逐渐增强表明ROS含量增多（见图1）。
图1间歇性低氧处理后ROS在肝细胞内含量的变化×200
2.3.1低氧诱导因子HIF-1α、HIF-2α的蛋白表达分析。
HIF-1α对照组表达量很少，第1天低氧处理8h后，HIF-1α的表达量显著增加，随着时间的延长第2、3、4、5天HIF-1α的表达量琢渐升高，L02细胞组间F值为535.52，p<0.01，q检验p值均<0.01;HEPG2细胞组间F值200.11，p<0.05，q检验P值均<0.01。
HIF-2α在对照组也有少量表达，但在实验组随着处理时间的延长表达量逐渐减少（见表2），L02细胞组间F=192.53,p<0.01；HepG2组间F=27.98，P<0.05.实验组第5天较对照组L02t=8.69，p=0.0001<0.01,HepG2t=3.65,P=0.01<0.05,差异有统计学意义，（图3表2），
表格2.2%O2处理各组细胞不同时间点HIF-1α、HIF-2α蛋白的表达（
）
组别（n=3）
指标
protein
常氧组
间歇性低氧组
1d
2d
3d
4d
5d
LO2cell
HIF-1α
0.129±0.011
0.294±0.018b
0.351±0.036b
0.476±0.018b
0.757±0.028b
0.875±0.0283b
HIF-2α
0.073±0.005
0.189±0.01b
0.156±0.01b
0.101±0.012b
0.058±0.008b
0.036±0.008b
HepG2cell
HIF-1α
0.117±0.034
0.246±0.02b
0.338±0.055b
0.565±0.058b
0.793±0.066b
0.967±0.028b
HIF-2αc
0.065±0.016
0.12±0.013b
0.092±0.01b
0.055±0.012
0.035±0.014b
0.025±0.015b
注：
n实验重复次数；HIF-1α:
低氧诱导因子-1α，HIF-2α：
低氧诱导因子-2α，b：
与对照组比较p<0.05.
图2westernblot检测各组细胞内HIF-1α的表达
图3westernblot检测各组细胞内HIF-2α的表达。
2.3.2脂肪分化相关蛋白ADFP、固醇调节元件SREBP-1c和脂肪酸合成蛋白FAS均随低氧时间的延长表达增多。
实验组ADFP的表达量成时间依赖性增多，较实验组差异有统计学意义P<0.05）,SREBP-1c在对照组的蛋白表达量较实验组第1天差异无统计学意义P>0.05。
但是在第2、3、4、5天的表达量增多，较对照组差异有统计学意义p<0.05（图4）.FAS对照组的蛋白表达量较实验组第1天差异无统计学意义p>0.05；但是在第2、3、4、5的表达增加，较对照组差异有统计学意义p<0.05（图5表3）。
图4westernblot检测各组细胞内ADFP的表达。
图3westernblot检测各组细胞内SREBP-1c的表达。
图5westernblot检测各组细胞FAS的表达。
表格3.2%O2处理各组细胞不同时间点ADFPSREBP-1c及FAS蛋白的表达（
）
组别（n=3）
指标
常氧组
间歇性低氧组
1d
2d
3d
4d
5d
LO2cell
ADFP
0.405±0.019
0.592±0.041a
0.735±0.027a
0.819±0.016a
1.006±0.062a
1.246±0.06a
SREBP-1c
0.123±0.011
0.126±0.003
0.161±0.007a
0.181±0.006a
0.213±0.007a
0.26±0.008a
FAS
0.124±0.014
0.155±0.028
0.218±0.013a
0.299±0.054a
0.356±0.032
0.394±0.025a
HepG2cell
ADFP
0.167±0.024
0.232±0.015a
0.318±0.049a
0.374±0.027
0.557±0.043a
0.769±0.054a
SREBP-12c
0.113±0.003
0.123±0.009
0.145±0.007a
0.169±0.009a
0.223±0.012
0.255±0.012a
FAS
0.201±0.005
0.219±0.027
0.265±0.013a
0.387±0.018a
0.439±0.005a
0.562±0.007a
注：
n实验重复次数；a各细胞株目的蛋白表达的分析采用单因素方差分析，多个样本间的两两比较用q检验，P＜0.05；
三．讨论
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructiveusleepu
apnea-hypopneasyndrome，OSAHS）以反复发生的、部分或完全性上气道阻塞事件为特点，表现为在睡眠期间出现呼吸暂停或低通气反复发作，常伴有间歇性低氧血症【1】。
近年来研究发现，OSAS与NAFLD的发生与转归密切相关，慢性间歇缺氧（chronicuintermittentuhypoxia，CIH）是导致肝脏损伤的重要原因之一，但与NAFLD发病机制的关系研究尚不清晰。
前期我们建立的持续性低氧细胞模型发现并推测HIF-2α－ADFP途径是低氧诱导肝细胞脂变的重要机制，SREBP-1c-FAS没参与脂变过程【3】，该结果与rankin【4】等的结论一致。
持续性低氧并不符合OSAS患者的病理生理特点，本实验通过间歇性低氧处理肝细胞，结果发现实验组TG含量较对照组增加，这表明间歇低氧也是体外诱导肝细胞脂肪性变的独立因素。
有研究用小鼠构建OSAS模型，发现暴露于间歇性低氧环境中的C57BL/6J瘦型小鼠发生高脂血症，血脂含量与低氧的严重度正相关【56】，这同我们的模型吻合，但间歇性低氧诱发肝细胞脂肪性变的机制尚不清楚。
活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）是细胞内线粒体氧化代谢的产物，包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（HO·）、一氧化氮（NO）等，低氧诱导因子（hypoxiainduciblefactors,HIFs）是调控哺乳动物适应低氧反应的一类重要转录因子,主要由α功能亚基和β结构亚基组成，在肝细胞中较常见的是HIF-1、HIF-2【4】。
当受到IH干扰时ROS的产生可以调节低氧诱导因子的表达，yuan【7】等通过检测细胞内对氧化还原敏感的顺乌头酸酶活性来评估ROS变化，发现受IH影响ROS的产生大幅度降低顺乌头酸酶的活性，细胞内HIF-1α的含量同时升高4-5倍【8,17】，HIF-2α的蛋白表达却和ROS成负相关,这一改变被O2-清除剂MnTMPyP阻止。
本实验利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，发现受间歇性低氧的影响肝细胞内绿色荧光随时间延长而增强，这表明ROS的含量增多，HIF-1α的表达量与ROS正相关,HIF-2α蛋白受ROS的影响,表达降低，因此在IH中ROS的产生上调HIF-1α同时下调HIF-2α的表达。
脂肪分化相关蛋白（adiposedifferentiation-relatedprotein，adipophilinADFP）分布于脂滴的表面，可促进脂滴的形成和脂质聚集，对肝细胞内TG合成及代谢起关键作用【1112】。
在间歇性低氧环境中ROS可以调节ADFP的表达，有研究发现ROS通过调控影响adipophilin表达的核转录因子增加细胞对脂质的蓄积【13-14】,在低氧环境中，HIFs可以联合多种共激活因子结合到目的基因ADFP的低氧反应元件（hypoxiaresponsiveelementHRE）上，上调ADFP【3，4】，本实验研究发现，在IH环境中，ADFP的蛋白表达同ROS及HIF-1α正相关，细胞内TG沉积也相应增多，因此我们推测在IH中ROS的产生也促进ADFP的表达。
固醇调节元件结合蛋白（Sterolregulatoryelementbindingproteins,SREBP）可调节体内脂质代谢，SREBP-1c是其中的一个亚型，主要参与脂肪合成基因的转录，调节TG合成相关酶基因的表达，其中包括脂肪酸合成酶（FAS），但新合成的SREBPS需要SREBP裂解激活蛋白（SREBPcleavage-activatingprotein,SCAP）的协助才能发挥作用【910】。
SCAP含有HIF-1的连接位点5`-ACGTG-3`，HIF-1有可能通过SCAP来调节SREBP-1的表达，IH上调HIF-1α增加SCAP对SREBP的转录，促进FAS的转录表达，增加脂肪酸的合成【815】。
本结果发现SREBP-1c、FAS的蛋白表达同HIF-1α呈正相关，细胞内脂肪酸合成增多，推测IH中肝细胞很可能通过HIF-1-SREBP-1c-FAS途径诱发脂质异常沉积。
综上所述，本研究利用体外实验初步发现间歇性低氧可以诱发肝细胞脂质异常沉积。
受间歇性低氧的影响，肝细胞内增多的ROS可以调节低氧诱导因子、脂肪分化相关蛋白的表达，影响HIF-1α-SREBP-1c-FAS途径增加肝细胞对脂肪酸的合成，上调ADFP促进脂肪酸在肝细胞的转运和蓄积，活性氧和低氧诱导因子有可能成为我们研究非酒精性脂肪性肝病的新靶点。
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