5湖南省度人感染高致病性禽流感监测实施方案范文.docx

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5湖南省度人感染高致病性禽流感监测实施方案范文

5湖南省2022年度人感染高致病性禽流感监测实施方案范文

2022年我省流感监测网络已扩大到全省14个市州，各市州疾病预防控制中心流感实验室检测能力显著提高。

按照上级要求，为进一步做好我省人禽流感监测工作，根据形势变化及时调整工作部署，特制订本方案。

一、监测目的

1、加强不明原因肺炎病例的发现、追踪、排查和疫情处理等工作，完善人禽流感监测系统，提高全省监测水平，及时发现人禽流感疫情。

2、了解我省职业暴露人群高致病性禽流感病毒（H5N1）的感染状况。

3、了解我省高致病性禽流感病毒在环境中的分布情况。

二、监测点的设置

全省14个市州疾病预防控制中心均开展本项监测工作。

职业暴露人群人禽流感监测点按照监测场所分为四类，即：

城乡活禽市场类、规模家禽（含水禽）养殖场类、农村家禽散养户集中地区类、野生候鸟栖息地类。

每个市州监测其中两类，两类监测点可设在同一个县（市、区）范围内。

为保证监测场所的覆盖，省疾病预防控制中心统一规划监测点设置，见表1。

表1各市州职业暴露人群高致病性禽流感监测点分类设置要求

市州长沙市株洲市湘潭市衡阳市邵阳市岳阳市常德市张家界市益阳市郴州市永州市怀化市娄底市湘西自治州

监测点分类

城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地规模家禽（含水禽）养殖场、野生候鸟栖息地农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地城乡活禽市场、农村家禽散养户集中地区城乡活禽市场、野生候鸟栖息地

城乡活禽市场、规模家禽（含水禽）养殖场农村家禽散养户集中地区、野生候鸟栖息地规模家禽（含水禽）养殖场、野生候鸟栖息地农村家禽散养户集中地区、规模家禽（含水禽）养殖场城乡活禽市场、农村家禽散养户集中地区

发生过动物和/或人禽流感疫情的市州，优先在疫情发生地或其周边县（市、区）设立监测点。

选定后，应记录监测点的基本信息，包括：

整体环境特点，从业人员总体情况，禽类养殖、贩卖和屠宰等情况（规模、数量等），近期禽类免疫情况,近期禽类发病情况，日常环境清洁和安全措施等。

三、监测内容和方法

（一）不明原因肺炎病例监测

1、按照《全国不明原因肺炎病例监测、排查和管理方案》，现场参与或指导县（区、市）疾病预防控制中心对所辖区域内报告的不明原因肺炎病例的调查、采样，筛查可能的SARS病例和人禽流感病例及其它传染性呼吸道疾病。

2、落实对聚集性不明原因肺炎病例的密切接触者登记、追踪和医学观察等防控措施。

3、病例相关标本应根据要求和需要送至具备相关检测条件的实验室开展检

测。

14个市州疾病预防控制中心均应开展检测。

标本采集后分装为一式三份，一份市州疾病预防控制中心检测，二份送省疾病预防控制中心供复核和上送国家流感中心。

4、全年开展不明原因肺炎病例监测工作。

各市州分别于2022年4月、7月、10月中旬提交阶段小结（季度总结），2022年1月底前提交年度监测工作总结。

（二）职业暴露人群血清流行病学监测1、监测对象

在设置的监测点内按照监测类型选择下列适当人群，每类监测点至少各监测100人,每个市（州）全年共计监测至少200名适宜对象：

（1）城乡活禽市场类：

活禽批发市场、城乡农贸市场或菜市场中直接与禽类接触的人员。

（2）规模家禽（含水禽）养殖场类：

家禽规模养殖场（户）中直接与禽类接触的人员。

（3）农村家禽散养户集中地区类：

家禽散养户的家庭成员。

（4）野生候鸟栖息地类：

野生候鸟栖息地中与候鸟或其排泄物有接触的人员。

2、监测时间

各监测点在每年冬春季开展监测工作。

2022年3月底前完成监测对象的流行病学调查、标本采集等现场工作。

标本采集后1个月内完成检测工作。

3、监测内容与方法

（1）流行病学调查

收集调查对象的基本情况、禽类接触史等内容，填写“职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷”（见附表1），在实验室检测完成后1周内将血清标本及登记表、调查问卷（包括纸质表格和EpiData格式数据库）送省疾病预防控制中心流行病防治科、微生物检验科。

。

（2）标本采集、运送

各市（州）疾病预防控制中心每年按照规定的监测类型至少采集200名适宜对象的血清标本（每个市州每个规定的监测类型至少100份）标本。

采集监测对象的空腹静脉血5ml，填写“职业暴露人群血清标本登记表”（见附表2）。

分离血清，无菌条件下分装为3份，其中1份由市（州）疾病预防控制中心在标本采集

完成后1个月内完成抗体检测，另外2份随同登记表送省疾病预防控制中心，由省中心复核并上送国家流感中心。

血清标本应置－20℃或以下冻存，避免反复冻融。

标本运输时遵守国家生物安全的有关规定。

（3）实验室检测

各网络实验室应用单放射免疫扩散溶血实验（SRH）和/或马血球血凝抑制实验（HI）进行H5N1抗体检测（见附件2）。

标本采集后要求1个月内完成检测工作，填写“职业暴露人群血清流行病学检测结果表”（见附表3），检测结束后1周内将检测结果和需上送的标本一起提交省疾病预防控制中心流行病防治科、微生物检验科，由省疾病预防控制中心汇总后统一上报国家流感中心。

国家流感中心应用微量中和实验（MN）对全部阳性标本和随机抽取的5%阴性标本进行复核，并向各网络实验室及时反馈复核结果。

（三）职业暴露人群病原学监测

（四）环境标本高致病性禽流感病原学监测1、监测对象

职业暴露人群血清流行病学监测点的水、禽类（含候鸟）粪便及笼具表面等环境标本。

2、监测时间

全年监测，每年的1、4、7、10月各采集标本1次。

2022年1月标本到2022年1月补采。

避免在监测点消毒后2日内开展标本采集。

3、监测方法

（1）标本采集

各市州疾病预防控制中心每个季度采集标本1次，每个监测县每次共采集各

类标本至少10份（应分布在不同场所）,每个市州每季度完成至少20份，同时填写“环境标本采样登记表”（附表4）。

标本采集种类及方法见附录1。

（2）标本运输、处理

标本采集后应在4℃条件下48小时内运送至市（州）疾病预防控制中心实验室。

实验室收到标本后应立即进行标本处理（见附录1），并将标本分为3份，1份由市（州）疾病预防控制中心进行核酸检测，另外2份标本每个季度随同“环境标本采样登记表”（附表4）和“环境标本病原学检测结果表”（附表5）送省疾病预防控制中心，由省中心复核并上送国家疾病预防控制中心。

。

留样标本要求在－70℃或以下冻存。

标本运输时遵守国家生物安全的有关规定。

（3）实验室检测

各市（州）疾病预防控制中心实验室收到标本后1周内对标本进行A型流感病毒核酸检测，A型流感病毒核酸阳性标本进一步进行H5N1亚型检测，填写“环境标本病原学检测结果表”。

对于所有A型流感病毒核酸阳性的标本，各监测网络实验室在完成检测后24小时内将检测结果报告省疾控中心，并及时将标本送省疾病预防控制中心进行复核。

国家流感中心将对全部阳性标本进行复核，并在标本收到后48小时及时向省疾控中心及网络实验室进行反馈。

四、数据收集及结果报送

五、职责分工及组织实施

（一）省疾病预防控制中心

1、制定本省的实施方案，负责监测工作的实施，包括监测点的选择、监测人员的技术培训和指导，以及数据收集整理和统计分析。

2、对各市州、各监测点工作情况定期或不定期进行督导、考核及评估。

每个监测年度结束后，向中国疾病预防控制中心提交全省的监测工作报告。

3、及时向各市州反馈国家流感中心对相关标本的复核检测结果。

（二）各市州疾病预防控制中心

1、负责监测工作的实施，包括监测场所的选择、人员的技术培训和指导、标本的采集以及数据收集、整理、录入、上报和分析。

2、对采集标本进行实验室检测，并及时提交检测结果。

按监测方案的要求及时上送各类标本进行复核。

3、5月底前将监测点基本信息、职业暴露人群血清流行病学监测结果及工作总结报省疾病预防控制中心流行病防治科、微生物检验科，省疾病预防控制中心汇总后报国家流感中心。

4、2022年1月底前向省疾病预防控制中心提交2022年度监测项目工作总结。

（三）监测点所在县（市、区）疾病预防控制中心

在市州疾病预防控制中心的指导下，积极配合、参与监测项目有关工作。

所承担具体工作任务由各市州疾病预防控制中心确定。

六、考核和评估

卫生部、中国疾病预防控制中心将对各省、各监测网络实验室监测工作进行年度考核、评估。

在省卫生厅的组织领导下，由省疾病预防控制中心制定方案并具体实施对各市州的考核、评估。

各地工作开展情况和考核评估结果在《湖南疾病监测质量月报》上公布。

七、附表和附录

附表1、职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷附表2、职业暴露人群血清标本登记表附表3、职业暴露人群血清学检测结果表附表4、环境标本采样登记表附表5、环境标本病原学检测结果表附录1、标本的采集、处理、保存与运输附录2、实验室操作方法简介

附表1、职业暴露人群血清流行病学监测调查问卷

4、现住址：

5、职业：

①幼托儿童②散居儿童③学生（大中小学）④教师⑤保育

10民工○11农民○12牧员及保姆⑥餐饮食品业⑦商业服务⑧医务人员⑨工人○

13渔14干部职员○15离退人员○16家务及待业○17其他○18不详民○（船）民○

二、暴露情况（可多选）

6、职业暴露人群种类：

①散养户②规模化养殖场从业人员③活禽批发市场人员④农贸市场或菜市场活禽交易人员⑤家禽屠宰加工厂人员⑥野生候鸟栖息地接触鸟类人员⑦其他7、暴露方式：

①喂养②清扫禽舍③加工（宰杀、拔毛、洗切、腌制、烹饪）④食用⑤捕杀⑥运输⑦捕捉⑧销售⑨其他8、如为养殖人员，禽类养殖方式：

①鸡羽1）散养2）圈养

②鸭羽1）散养2）圈养③鹅羽1）散养2）圈养④鸽子羽1）散养2）圈养

⑤其他羽1）散养2）圈养9、近一个月来，接触禽种类：

①鸡②鸭③鹅④鸽子⑤野禽⑥其他

10、所接触的禽类是否接种过禽流感疫苗？

①是②否③不详11、近一个月以来，是否接触过病死禽？

①是②否③不详

（1）病死禽种类：

①鸡羽②鸭羽③鹅羽

④鸽子羽⑤其他羽

（2）接触方式为：

（可多选）

①喂养②清扫禽舍③加工（宰杀、拔毛、洗切、腌制、烹饪）④食用⑤捕杀⑥运输⑦捕捉⑧其他（3）接触病死禽时是否有防护措施？

①是②否③不详如果有，采取的措施有：

（可多选）

①戴口罩（N95口罩、过滤口罩、棉纱口罩、一次性外科口罩）②戴面罩③穿防护服（规范、不规范）④防护眼镜⑤手套⑥帽子⑦白大衣⑧其它

（4）接触病死禽的持续时间：

天（月日到月日）

累计暴露：

小时

12、近1个月是否出现过发热？

①是②否③不详

（1）发热起始时间月日，共持续天，最高体温℃

（2）发热时是否伴有其它不适症状？

①是②否③不详出现症状起始时间月日，共持续天，主要症状有：

①头痛②咽痛③鼻塞④肌肉酸痛⑤腹痛⑥腹泻⑦其它13、近1年是否接种过流感疫苗？

①是②否③不详

调查人员单位：

调查人员：

调查日期：

审核人员：

审核日期：

附表2、职业暴露人群血清标本登记表

注：

1.采集地点：

填写标本采集地的禽类场所名称

例如：

长沙市疾病预防控制中心标本B1055001

岳阳市疾病预防控制中心标本B104306001

采集人：

采集单位：

送检日期：

附表3、职业暴露人群血清流行病学检测结果表

检测单位：

1.检测方法：

马血球HI（）、SRH（）

2.使用抗原：

参考血清名称：

3实验结果

检测者：

检测日期：

复核者：

附表4、环境标本采样登记表

采集地点：

县（市、区）乡（镇）村（居委会）

例如：

长沙市疾病预防控制中心标本C1055001

岳阳市疾病预防控制中心标本C104306001

采集人：

采样单位：

送检日期：

附表5、环境标本病原学检测结果表

检测单位：

附录1、标本的采集、处理、保存与运输

一、标本采集与处理1.血清标本

取真空负压采血管，做好标记，采集监测对象空腹静脉血5mL。

然后置于室温数小时待血完全凝固。

1500rpm～2000rpm离心10min，收集血清分装于3支带外螺旋盖的冻存管中，做好标记。

2.环境标本

环境标本采样液可使用Hank'或Eagle'等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA：

氨苄青霉素（2某106IU/L）、链霉素（200mg/L）、多粘菌素B（2某106IU/L）、庆大霉素（250mg/L）、制霉菌素（0.5某106IU/L）、盐酸氧氟沙星（60mg/L）、磺胺甲基异恶唑（0.2g/L）。

标本采集后应在4℃条件下48小时内运送至流感监测网络实验室。

实验室收到标本后应立即进行标本处理。

每份原始标本分装成三份，1份用于本实验室的核酸检测，1份送省疾控中心复核，1份备送国家流感中心复核。

要保证送国家流感中心的标本足量：

水标本不少于3ml，拭子标本不少于2ml。

各网络实验室收到标本后1周内完成对标本的核酸检测，首先进行A型流感病毒核酸检测，对于A型阳性标本需进一步进行H5N1亚型检测。

（1）水标本

在禽类活动或笼具旁的水沟或水池的不同部位共收集水标本15-20ml置于50ml外螺旋盖的管内。

水样标本到实验室后应在采样管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再进行分装。

呼吸道和环境标本要在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液和固体，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上液分装。

分装好留1份进行核酸检测。

（2）笼具表面标本

用沾有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面3-5个不同部位，然后将擦拭过的拭子放入含5ml采样液的采样管中，尾部弃去。

分装前务必充分震荡。

二、标本保存和运输1．标本保存

血清标本可置4℃存放3天，存放超过3天需置-20℃或以下保存。

环境原始标本可置4℃存放2天，存放超过3天需置-70℃或以下保存。

环境阳性标本至少保存1年，阴性标本至少保存6个月。

2.标本运输

各网络实验室在完成检测后1周内将原始样本送省疾病预防控制中心微生物检验科复核。

运输中，标本应放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。

同时寄送标本登记表。

运输要求符合国家生物安全有关规定。

病原学标本按B类感染性物质进行运输，航空采用UN3373包装。

附录2、实验室操作方法简介

一、马红细胞血凝抑制试验检测禽流感抗体

（一）生物安全要求

禽流感H5N1亚型检测抗原的灭活需要在BSL-3级实验室进行。

其余操作均在BSL-2级实验室进行。

（二）材料

1．抗原：

灭活的H5N1流感病毒。

2．血清：

（1）阳性对照血清；阴性对照血清

（2）待检血清3．其他主要试剂：

（1）马红细胞（1:

1的比例保存于阿氏液中，建议采血后72小时内使用）

（2）磷酸盐缓冲液（PH7.2PBS）：

0.01M；（3）牛血清白蛋白（BSA）；（4）霍乱滤液（RDE）

4．其他：

（1）“V”型96孔微量板

（2）37℃及56℃水浴锅（3）台式离心机（4）多道可调加样器（5）离心管（三）质量控制1、对照血清

每块96孔板上均需要设立阳性对照和阴性对照，同批次的阳性对照结果滴度应保持2倍以内。

2、红细胞对照

实验可根据红细胞对照来判断反应时间，尽可能在每块96孔板上设计一孔红细胞对照（PBS+1%红细胞悬液）。

3、病毒回滴

一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。

进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位（指25μL体积中含有4个红细

胞凝集单位）的病毒量。

（四）实验步骤1、血清处理

（1）用单道加样器吸出1体积血清置于无菌Eppendorf管内，换滴头加入4体积RDE，吹打混匀。

（2）置37℃水浴16～18h。

（3）从37℃水浴取出后置56℃水浴30min灭活。

（4）马红细胞吸附：

瞬时离心，待冷却后加入清洗后的浓红细胞达20%（每100μLRDE处理过的血清加入20μL清洗后的浓红细胞）。

混匀后室温吸附1h。

（5）2000rpm离心5min。

（6）小心吸取上清液至干净离心管中备用。

如不需立即检测可放4℃保存。

2．马红细胞的采集及1%马红细胞悬液的配备

（1）在注射器里放入一定体积的阿氏液，从颈静脉处采集马血后放入容器中，轻柔混匀，如阿氏液不足则需补足（阿氏液和红细胞的比例为1:

1）。

（2）采集的马红细胞应放入冰箱4℃保存，越新鲜越好，建议在采集后72小时内使用。

（3）在配置1%马红细胞悬液前需清洗红细胞液。

首先加入5mL红细胞（沉积在容器底部的红细胞）至50mL离心管。

加入45mLPBS-0.5%BSA使总体积达到50mL，轻柔混匀。

（4）2000rpm（600某g）离心5min。

（5）吸掉上清液后，连续重复步骤（3）-（4）两次。

（6）为了精准马血球的浓度，取浓缩后的马血球1ml于1.5ml离心管中，3600g（8000rpm）离心10min，吸取压缩后血球的上清并统计出吸取上清的体积，计算实际的血球百分比（一般达到未压缩前体积的60-75%）。

将完全压缩后的马血球弃去。

（7）计算最终的血球量使浓度达到完全压缩后的1%，取所需洗好马血球的体积加入PBS-0.5%BSA中，每次用前轻轻混匀后使用。

3．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原

（1）将微量板横向放置：

垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行

方向称行，如A1～A12称为A行。

标记好标准诊断抗原及加样顺序。

1）吸取50μLPBS加入微量板的第二列至最后一列，于第一列加入100μL标准诊断病毒。

2）从第一列取50μL病毒液，依次从第二列至第八列做2倍系列稀释。

最后一列每孔弃去50μL稀释后的病毒液。

3）每孔加入50μL1%的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。

4）室温孵育45～60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。

5）结果判定：

红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。

红细胞完全凝集以“+”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。

（2）制备4个红细胞凝集抗原时：

首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。

如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25μL抗原，那么测定一份血清需0.2mL抗原。

根据参比血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原。

（3）计算出病毒稀释度。

用病毒红细胞凝集滴度（HA滴度）除以8，得到的商即为4个红细胞凝集单位的稀释度。

如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8。

按1:

8（1mL病毒液加7mLPBS）稀释该病毒即可得到4个凝集单位/25μL的抗原病毒量。

（4）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个凝集单位抗原须复核滴定：

取50μL稀释好的抗原，用等量PBS做倍比稀

释（同病毒滴定）后加入50μL红细胞悬液，至室温孵育45～60min后观察凝集结果。

如只有前4孔出现凝集，表明每50μL病毒含有8个凝集单位（即25μL中含有4个红细胞凝集），该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。

如第5孔也出现凝集，说明每50μL病毒含有16个凝集单位，该抗原必须等量稀释。

如只有前3孔凝集，表明每50μL病毒仅含有4个凝集单位，病毒量需要加倍。

此外，4个凝集单位抗原必须每次用前新配制。

4．红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体

（1）每孔加入25μLPBS。

（2）A1加入25μL标准诊断血清作为阳性对照；A2加入25μLH5N1阴性血清作为阴性对照。

（3）自A3孔开始分别加入25μL待检血清；

（4）用多道加样器吸取25μL血清（A1-A12），由A行至H行做2倍系列稀释血清，至H行后弃去25μL。

系列稀释时需注意每一次稀释都应混合均匀。

（5）加入25μL含4个凝集单位的抗原。

（6）混匀后室温孵育30min。

（7）每孔加入50μL1%马红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。

（8）室温孵育45-60min，观察红细胞凝集抑制试验结果。

（9）结果判定

当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。

红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。

如1:

80稀释的血清孔不出现凝剂（红细胞凝集完全抑制），1:

160稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。

人血清对H5N1抗原的抑制效价≥1:

160可判定为阳性（参考WHO推荐标准），但还需要用另一种血清学方法验证。

二、流感/禽流感单放射免疫扩散溶血技术抗体检测

（一）生物安全要求

抗原的制备和血清灭活根据所从事病毒的种类在相应的生物安全级别实验室进行，SRH检测在生物安全二级（BSL-2）实验室进行操作。

（二）材料1．Alever’液2．pH7.2PBS缓冲液

3．10%叠氮钠（odiumazide，NaN3）溶液4．5某10-4mol/LKIO4（过碘酸钾）溶液

11.5mgKIO4加入pH7.2PBS溶液至100mL，完全溶解后置4℃保存。

5．1%琼脂糖6．1%鸡红细胞悬液

7．浓鸡红细胞（洗涤后去掉上清的鸡红细胞）8．补体的制备

至少6只健康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午从心脏采血，每只可采5～10mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混匀后使用，当天分离血清，分装，置-70℃冰箱中保存。

由于补体耐热性差，因此，操作时尽量在4℃条件下进行。

9．抗原

一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，甲醛灭活的病毒需在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。

10．参比血清

抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒参比兔血清。

11．测定血清

血清检测前56℃30min灭活去除血清中不耐热的非特异性抑制素和补体；血清从56℃水浴箱中取出，置室温冷却，每管加终浓度为20%的浓鸡红细胞，混匀，置室温1h或4℃过夜，1500rpm离心10min，弃沉淀物，留上清。

红细胞吸附的目的是去除人血清中可能含有对鸡红细胞的嗜异性抗体（Forman’antibody）。

12．免疫扩散板

13．打孔器，孔径为2mm和3mm的打孔器。

14．小烧杯，带盖的可装扩散板的塑料盒。

15．测量放大镜（带有每个刻度0.1mm的刻度尺）或一般透明并带刻度的尺子。

根据测量的溶血圈直径，可按下列公式计算出溶血圈面积（S）：

S1=πR12S2=πR22S=S1-S2

如用3mm孔径，测量的溶血圈直径为8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面积：

S1=πR12=π某42=3.1416某16=50.27（mm2）

S2=πR22=π某1.52=3.1416某2.25=7.07（mm2）S=S1-S2=50.27-7.07=43.20（mm2）（三）实验步骤

1．病毒抗原红细胞凝集滴度的测定及1000个红细胞凝集单位计算

（1）病毒抗原红细胞凝集滴度的测定

采用鸡血球，按常规流感病毒96孔微孔板进行病毒滴度测定。

（2）1000个红细胞凝集单位计算

根据红细胞凝集滴度算出1000个红细胞凝集单位所需测定病毒的量。

如病毒滴定时红细胞凝集滴度为64，则按下列公式计算：

0.05:

64=某:

1000,某=（0.05某1000）/64=50/64=0.78（mL）

也就是说，每0.1mL浓的鸡红细胞中需要加入0.78mL测定的病毒溶液。

按这个比例算出实验所需的病毒量。

2．溶解1%琼脂糖并恒温于60℃水浴箱中。

使用PH7.2的PBS同时加入1‰NaN3以防止细菌生长。

煮沸或者用微波炉使1%琼脂糖完全溶解，速置60℃水浴箱中，分装于小烧杯中，2.9mL/杯，置60℃水浴箱中。

根据工作量计算出所需烧杯的数量。

3．红细胞处理

按每块扩散板需50μl浓的鸡红细胞，计算出工作中所需的浓红细胞容量，将所需的浓鸡红细胞放入带尖底的15mL离心管中，加入等容量的5某10-4mol/LKIO4，混匀，置室温15min。

KIO4处理的目的是使病毒吸附到红细胞表面后不会游离下