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技术路线

拟采取的研究方案及可行性分析。

（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

3.1研究方案（本项目涉及的所有研究方法在扬州大学相关国家重点学科实验室均可以实施）

1）分离、纯化、培养、鉴定

a）Ficoll密度梯度离心法分离MSCs，心肌内注射氯胺酮（20mg/kg或1000mgIM）和乙酰普吗嗪（0.2mg/kg）进行全麻。

一）聚蔗糖密度梯度离心法分离MSCs，心肌内注射氯胺酮（20毫克／公斤或1000毫克IM）和乙酰普吗嗪（0.2毫克／公斤）进行全麻。

thiopental硫喷妥钠（10mLof5%IV）.从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，腹侧卧位后足挤进身体下面，髂嵴部位消毒。

戊硫代巴比妥硫喷妥钠（10毫升5%4）.从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，腹侧卧位后足挤进身体下面，髂嵴部位消毒。

抽吸约14mL骨髓进含有6000单位肝素的灌注器，肌肉注射0.3的吗啡镇痛。

抽吸约14毫升骨髓进含有6000单位肝素的灌注器，肌肉注射0.3的吗啡镇痛。

。

通过梯度离心的方法先对骨髓进行分离，去除大部分红细胞、脂肪细胞和血小板，获得纯度较高的单个核细胞。

提取单个核细胞层细胞培养24h待大量细胞贴壁后，再提前进行换液结合使用贴壁筛选，经过多次换液与传代去除培养瓶内悬浮未贴壁的造血细胞，MSCs逐渐得到进一步纯化。

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4h待大量细胞贴壁后，再提前进行换液结合使用贴壁筛选，经过多次换液与传代去除培养瓶内悬浮未贴壁的造血细胞，MSCs逐渐得到进一步纯化。

采用流式细胞仪检测表面抗原、免疫组化染色等进行鉴定，标记后加入地塞米松、维生素C、细胞因子等诱导培养液，倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态，调整细胞浓度，精确计数待回输。

采用流式细胞仪检测表面抗原、免疫组化染色等进行鉴定，标记后加入地塞米松、维生素C，细胞因子等诱导培养液，倒置相差显微镜和他染色观察细胞形态，调整细胞浓度，精确计数待回输。

b）采用免疫荧光激活细胞分选（FACS）方法分离VSEL-SCs，从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，从GFP标记的猪髂骨或胸骨中提取骨髓，红色的血细胞在0.9%的NH4Cl溶液中溶解掉。

b）采用免疫荧光激活细胞分选（FACS）方法分离VSEL－SCs，从猪髂骨或胸骨中提取骨髓，从GFP标记的猪髂骨或胸骨中提取骨髓，红色的血细胞在0.9%的NH4Cl溶液中溶解掉。

分离的骨髓细胞再次悬浮在包含1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（FBS;HyClone,Logan,UT,）中。

分离的骨髓细胞再次悬浮在包含1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（FBS；HyClone、摇石、UT，）中。

以下主要的抗体同时加入:

biotin-conjugatedmonoclonalratantimouseLy-6A/E（Sca-1）（cloneE13-161.7）,APC-Cy7-conjugatedmonoclonalratantimouseCD45（clone30-F11）andphycoery-thrin（PE）conjugatedmonoclonalratantimouselineagemarkers[anti-CD45R/B220（PE;cloneRA3-6B2）,anti-Gr-1（PE;cloneRB6-8C5）,anti-TCR__（PE;cloneH57-597）,anti-TCR_（PE;cloneGL3）,anti-CD11b（PE;cloneM1/70）,anti-Ter119（PE;cloneTER-119）].第二次用PE-Cy5-conjugatedstreptavidin染色。

以下主要的抗体同时加入：

生物素－结合的单细胞繁殖的鼠antimouseLy-6A／E（Sca-1）（同本生物E13-161.7）,APC－Cy7-结合的单细胞繁殖的鼠antimouseCD45（同本生物30-F11）和phycoery－thrin（PE）结合的单细胞繁殖的鼠antimouse谱系标记［反CD45R／B220（PE；同本生物RA3-6B2）、反Gr-1（PE；同本生物RB6-8C5）,反TCR（PE；同本生物H57-597）,反TCR,（PE；同本生物GL3）反激光唱碟11b（PE；同本生物M1/70）,反Ter119（PE；复制TER-119）].第二次用PE－Cy5-结合的streptavidin染色。

所有的试剂购买于BDPharmingen（SanJose,CA,

所有的试剂购买于BDPharmingen（桑河Jose、加州，4°C环境中染色20分钟。

染色后在包含1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中冲洗。

根据下图的线路图流式细胞仪分离细胞。

_大部分分离的细胞收集在2ml的含10％胎牛血清的Dulbecco’smodifiedEagle’smedium（DMEM：

改进的eagle培养基）中。

_大部分分离的细胞收集在2毫升的含10％胎牛血清的Dulbecco已经修正伊格尔培养基（DMEM：

改进的鹰培养基）中。

分离细胞后立即分析细胞的纯度。

分选的细胞生存力超过90%。

分选的细胞通过离心沉淀压片在1000克10分钟，再次悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，且容积更小的等比例的细胞数量。

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000克10分钟，再次悬浮在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，且容积更?

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细胞分装在50微升容积内用于心内注射。

在包含低浓缩胎牛血清的DMEM培养基中，EGFP标记的VSEL-SCs平铺在未标记的C2C12细胞滋养层上。

在包含低浓缩胎牛血清的DMEM培养基中，EGFP标记的VSEL－SCs的平铺在未标记的C2C12细胞滋养层上。

VSEL-SCs扩增持续9天，每3-4天更换培养基。

VSEL－SCs的扩增持续9天，每3-4天更换培养基。

扩增后，所有细胞受胰蛋白酶作用，流式细胞仪将EGFP–标记的扩增的VSEL-SCs和C2C12细胞分离开。

扩增后，所有细胞受胰蛋白酶作用，流式细胞仪将EGFP－标记的扩增VSEL－SCs的和C2C12细胞分离开。

100,000cells的50微升体积（鼠）在类似的培养基中培养5天，以供注射入心肌。

100,000细胞的50微升体积（鼠）在类似的培养基中培养5天，以供注射入心肌。

因为有报道称：

梗死心肌中的趋化物表达在再灌注后的48小时达最大化，所以我们选择这个时间点进行移植。

因为有报道称：

梗死心肌中的趋化物表达在再灌注后的48小时达最大化，所以我们选择这个时间点进行移植。

经红细胞裂解液冲洗，经FACS分选VSEL-SCs，用流式细胞仪检测VSEL-SCs的表面标记物，RT-PCR、透射电子显微镜、倒置相差显微镜等鉴定。

经红细胞裂解液冲洗，经FACS分选VSEL－SCs，用流式细胞仪检测VSEL－SCs的表面标记物，RT－PCR、透射电子显微镜，倒置相差显微镜等鉴定。

标记后加入地塞米松、维生素C、细胞因子等诱导培养液，台盼兰染色检测细胞活力，调整细胞浓度，精确计数待回输。

标记后加入地塞米松、维生素C，细胞因子等诱导培养液，台盼兰染色检测细胞活力，调整细胞浓度，精确计数待回输。

2）MSCs和VSEL-SCs的标记首次移植的NHSCs采用Brdu标记，将经胰酶消化的细胞，离心后接种于培养液中，加入Brdu标记物。

2）MSCs和VSEL－SCs的标记首次移植的NHSCs采用Brdu标记，将经胰酶消化的细胞，离心后接种于培养液中，加入Brdu标记物。

再次移植的NHSCs采用RFP标记。

3）建立猪AMI模型及NHSCs移植

a）首先予初步吸入麻醉，将实验猪固定于心脏导管室手术台上，胸部备皮；气管插管，连接呼吸机；b）开放耳缘静脉，以5%葡萄糖水静滴维持通道，心肌内注射氯胺酮（20mg/kg或1000mg肌注）和乙酰普吗嗪（0.2mg/kg）进行全麻。

一）首先予初步吸入麻醉，将实验猪固定于心脏导管室手术台上，胸部备皮；气管插管，连接呼吸机；b）开放耳缘静脉，以5%葡萄糖水静滴维持通道，心肌内注射氯胺酮（20毫克／公斤或1000毫克肌注）和乙酰普吗嗪（0.2毫克／公斤）进行全麻。

1℅戊巴比妥钠溶液以2ml/kg（30mg/kgIV）耳缘静脉麻醉，碘伏消毒铺巾，心电监护；c）一根2.0*10mm的球囊通过8F的鞘从左颈动脉进入左前降支刚好在第二最大的对角线支的远端。

2毫升／公斤（30毫克／公斤4）1℅戊巴比妥钠溶液以耳缘静脉麻醉，碘伏消毒铺巾，心电监护；c）一根2.0*10毫米的球囊通过8F的鞘从左颈动脉进入左前降支刚好在第二最大的对角线支的远端。

球囊在最低大气压下膨胀完全封堵约60分钟。

球囊放气后，血管造影证明封堵成功。

在球囊封堵前静脉注射50mg利多卡因，注射25mg在放气前，另外在发现有严重室速时可注射25mg利多卡因。

在球囊封堵前静脉注射50毫克利多卡因，注射25毫克在放气前，另外在发现有严重室速时可注射25毫克利多卡因。

按照标准方法sedingler法穿刺猪股动脉，予肝素8000（300IU/千克）单位后进行冠状动脉造影，插入球囊导管封堵猪冠状动脉左前降支第一对角支分叉处制备大面积前壁心肌梗死模型，封堵时间压力均相同以确保梗死面积同质化；d）当心电图示胸前至少相邻4个导联ST段明显持续上抬，提示AMI造模成功。

按照标准方法sedingler法穿刺猪股动脉，予肝素8000（300IU／千克）单位后进行冠状动脉造影，插入球囊导管封堵猪冠状动脉左前降支第一对角支分叉处制备大面积前壁心肌梗死模型，封堵时间压力均相同以确保梗死面积同质化；d）当心电图示胸前至少相邻4个导联圣段明显持续上抬，提示AMI造模成功。

经历过MI后存活一周且一般情况稳定，LVEF较术前下降5%以上的猪，采用随机表法，分配到以下八组（n=8,每组）：

单次VSEL-SCs、MSCs（2mL,1.0×108cells）移植组分别在LAD中远端注入VSEL-SCs、MSCs悬液15ml，重复VSEL-SCs、MSCs移植组分别共注入30ml等浓度的VSEL-SCs、MSCs悬液；单次VSEL-SCs、MSCs移植2倍量组一次分别注入30ml等浓度VSEL-SCs、MSCs悬液；单次移植对照组则以同法注入1倍量的培养基；重复移植对照组共注入2倍量的培养基。

经历过MI后存活一周且一般情况稳定，LVEF较术前下降5%以上的猪，采用随机表法，分配到以下八组（n=8,每组）：

另设非梗死模型阴性对照组；f）术后继续监护24小时，待猪各方面情况恢复后送回动物房，青霉素肌注3天预防感染。

4）SDF-1、FGF、HGF、IGF-1、VEGF等因子检测a）RT-PCR检测：

分别检测血浆和心肌中SDF-1、FGF、HGF、IGF-1、VEGFmRNA的表达。

4）SDF-1、FGF、HGF、IGF-1,VEGF等因子检测一）RT－PCR的检测：

分别检测血浆和心肌中SDF-1、FGF、HGF、IGF-1,VEGFmRNA的表达。

取各组标本制成匀浆，提取总RNA，逆转录cDNA。

然后进行PCR扩增。

b）Westernblotting检测：

分别检测血浆和心肌中SDF-1、FGF、HGF、IGF-1、VEGF蛋白的表达。

b）西方污点检测：

分别检测血浆和心肌中SDF-1、FGF、HGF、IGF-1,VEGF蛋白的表达。

取各组标本加入100μL组织裂解液和3μL蛋白酶抑制剂制成匀浆，提取蛋白并检测蛋白浓度。

取各组标本加入100μL组织裂解液和3μL蛋白酶抑制剂制成匀浆，提?

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采用对骨髓核细胞趋化法检测SDF-1梯度。

5）超声心动图评估心功能分别于造模前后、VSEL-SCs、MSCs移植后3及6个月，以VIVID7心脏彩色多普勒超声仪在左室长轴切面和M超下检测猪心功能变化，包括LVEF，左室缩短分数，左室舒张末期内径以及左心室室壁运动。

6）血浆心房利钠肽（BNP）检测评估心功能BNP水平于造模前后、移植后3及6个月经耳缘静脉抽血，采用双抗夹心ELISA法测定。

7）磁共振评估心肌灌注和心功能：

分别于造模前后、移植后3及6个月，采用3T磁共振成像装置，体部相共振表面线圈及胸前导联心电门控技术测定左心室舒张末期容积、左心室收缩末期容积和LVEF等左室整体功能指标,先从一个心电门控快速小角度激发电影脉冲序列中获得两个长轴位和5－7个短轴位图像。

7）磁共振评估心肌灌注和心功能：

电影成像完成后静脉推注0.20mmol/kg的钆双胺，10分钟后从反转恢复快速小角度激发序列中获取钆增强图像。

左心室容积、质量、和射血分数的评估使用电影MRI和自动化边界检测算法。

8）99mTc-SPECT评估心肌灌注和心肌梗死面积：

分别于造模前后、移植后3及6个月，评估心肌灌注,心肌活力及心肌梗死面积。

8）99mTc－SPECT的评估心肌灌注和心肌梗死面积：

分别于造模前后，移植后3及6个月，评估心肌灌注，心肌活力及心肌梗死面积。

9）免疫组化检测：

心脏标本采集及心肌组织固定、切片

9）免疫组化检测：

心脏标本采集及心肌组织固定、切片

（1）心功能测定完成后，经右颈总动脉给予10%高钾溶液使心脏停搏于舒张期。

（2）迅速取出心脏，去除心脏表面脂肪组织及大血管，生理盐水冲洗干净，置

于4%中性甲醛溶液固定24h。

（3）取出标本，从心尖部至心底部垂直于心脏长轴每隔0.5cm取一厚约0.2cm

的心肌组织，共取5块，依次标号为A、B、C、D、E。

的心肌组织，共取5块，依次标号为A、B、C、D，E。

（4）经全自动组织脱水机脱水处理后石蜡包埋。

（5）切取厚约3～5μm左心室短轴面切片若干张。

部分切片行HE染色、Masson

部分切片行他染色，Masson

三色染色、网状纤维染色，其他序列切片进行免疫组织化学染色。

9.2心肌切片HE染色步骤

9.2心肌切片他染色步骤

（1）切片入二甲苯Ⅰ脱蜡5min。

（1）切片入二甲苯Ⅰ脱蜡5分钟。

（2）二甲苯Ⅱ脱蜡5min。

（2）二甲苯Ⅱ脱蜡5分钟。

（3）100%酒精Ⅰ脱水5min。

（3）100%酒精Ⅰ脱水5分钟。

（4）100%酒精Ⅱ脱水5min。

（4）100%酒精Ⅱ脱水5分钟。

（5）95%酒精Ⅰ脱水5min。

（5）95%酒精Ⅰ脱水5分钟。

（6）95%酒精Ⅱ脱水5min。

（6）95%酒精Ⅱ脱水5分钟。

（7）80%酒精脱水5min。

（7）80%酒精脱水5分钟。

（8）70%酒精脱水5min。

（8）70%酒精脱水5分钟。

（9）自来水冲洗5min。

（9）自来水冲洗5分钟。

（10）苏木素染色3min。

（10）苏木素染色3分钟。

（11）自来水洗去浮色。

（12）1%盐酸酒精分色10s。

（12）1%盐酸酒精分色10多岁。

（13）自来水返蓝20min。

（13）自来水返蓝20分钟。

（14）切片入1%伊红染色3min。

（14）切片入1%伊红染色3分钟。

（15）自来水洗去浮色。

（16）入90%酒精30s。

（16）入90%酒精30多岁。

（17）95%酒精Ⅰ5min。

（17）95%酒精Ⅰ5分钟。

（18）95%酒精Ⅱ5min。

（18）95%酒精Ⅱ5分钟。

（19）100%酒精Ⅰ5min。

（19）100%酒精Ⅰ5分钟。

（20）100%酒精Ⅱ5min。

（20）100%酒精Ⅱ5分钟。

（21）二甲苯Ⅰ透明5min。

（21）二甲苯Ⅰ透明5分钟。

（22）二甲苯Ⅱ透明5min。

（22）二甲苯Ⅱ透明5分钟。

（23）中性树胶封片。

a）心肌中VSEL-SCs和MSCs存在和分化的鉴定以鼠抗猪Brdu单克隆抗体作为第一抗体，以荧光标记鼠抗猪IgG为第二抗体；根据荧光分布，以荧光显微镜观察Brdu及RFP标记的细胞在心肌中的分布及重复移植组前后两次移植的干细胞之间有无融合、趋化等现象。

b）心肌纤维化的判断采用masson三色染色、网状纤维染色判定MI后心肌纤维化及程度。

心肌切片Masson三色染色步骤

（1）切片脱蜡处理至水。

（2）滴入试剂A（Masson复合染色液）染色5min，蒸馏水冲掉染液。

（2）滴入试剂一（Masson复合染色液）染色5分钟，蒸馏水冲掉染液。

（3）滴入试剂B（分化液）分化30～60s（1次）。

（3）滴入试剂B（分化液）分化30～60多岁（1次）。

（4）滴入试剂C（磷钨酸）染色5～10min，蒸馏水冲掉染液。

（4）滴入试剂C（磷钨酸）染色5～10分钟，蒸馏水冲掉染液。

（5）滴入试剂B分化30～60s（2次）。

（5）滴入试剂B分化30～60多岁（2次）。

（6）滴加试剂D（苯胺蓝）染色5min，蒸馏水冲掉染液。

（6）滴加试剂D（苯胺蓝）染色5分钟，蒸馏水冲掉染液。

（7）滴加试剂B分化30～60s（2次）。

（7）滴加试剂B分化30～60多岁（2次）。

（8）95%酒精、无水酒精脱水，透明，中性树胶封固。

心肌切片网状纤维染色步骤

（1）切片脱蜡处理至水。

（2）将试剂A（氧化液）滴于切片上孵育5min，流水冲洗1min。

（2）将试剂一（氧化液）滴于切片上孵育5分钟，流水冲洗1分钟。

（3）将试剂B（漂白液）滴于切片上，漂白至切片无色，流水冲洗。

（4）将试剂C（媒染液）滴于切片上孵育2min，流水冲洗后再用蒸馏水洗2

（4）将试剂C（媒染液）滴于切片上孵育2分钟，流水冲洗后再用蒸馏水洗2

次。

（5）将试剂D（银氨液）和试剂E（稀释液）以1:

3的比例混合均匀后，滴加

（5）将试剂D（银氨液）和试剂E（稀释液）以1:

3的比例混合均匀后，滴加

于切片上孵育5min，后用蒸馏水速洗一次。

于切片上孵育5分钟，后用蒸馏水速洗一次。

（6）滴加试剂F（还原液）孵育3min至组织变成棕黑色，流水冲洗数分钟。

（6）滴加试剂F（还原液）孵育3分钟至组织变成棕黑色，流水冲洗数分钟。

（7）水洗，脱水，中性树胶封固。

c）梗死区微血管密度检测

anti-CD31（SantaCruzBiotechnology）primary抗体免疫组织化学染色followedby

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