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microRNAs在肿瘤干细胞的进展和治疗潜能方面扮演的秘密角色：

一种Notch通路方法

MicroRNAs与即使不是所有的肿瘤类型也是一部分肿瘤类型的发展密切相关，并已被确定为肿瘤的预后，诊断和治疗极具吸引力的靶点。

miRNAs是一类非编码小RNA（长度为20–22个核苷酸），不完全结合调节基因表达的mRNA的3’端非编码区。

在肿瘤中异常表达的miRNA，有时被称为oncomiRNAs，已被证明在肿瘤发生、转移、耐药中起主要作用。

一方面，肿瘤发展中oncomiRNAs扩增与肿瘤抑制基因的表达沉默相关；另一方面，肿瘤与肿瘤干细胞（CSCs）中也观察到了miRNA的下调。

在这两种情况下，miRNA调控与肿瘤进展成反比。

越来越多的证据表明，miRNA也参与了转移过程中，miRNAs通过抑制或促进转移相关基因从而减少或激活癌细胞的迁移和侵袭过程。

特别是，循环miRNAs（囊泡包裹的或非包裹的）显著影响了肿瘤的发生：

膜表面的颗粒，凋亡小体，和外泌体提供细胞间通信系统将致癌miRNA从肿瘤转运到邻近细胞及远处转移灶。

据推测，miRNA以传统方式即通过调节信号途径和信号因子调控肿瘤的发展。

此外，最近研究表明非传统的肿瘤调控机制通过调控干细胞经由miRNAs和Wnt/β-catenin、Notch和Hedgehog信号通路组成的监管网络重新编程，所有这些都涉及控制肿瘤干细胞的干细胞功能。

本文中，我们重点研究miRNA在Notch信号通路中扮演的角色，以及miRNAs是如何通过直接/间接靶向的Notch通路调控肿瘤干细胞自我更新、分化和肿瘤发生的。

关键词：

Notch信号，肿瘤干细胞，miRNAs，肿瘤治疗方法，miRNAs治疗方法

背景

癌症是一种异质性疾病，分细胞层次和许多不同的表型。

有力的证据指出在大多数的实体肿瘤细胞是非致瘤起源的。

仅一小部分的祖细胞被认为要对肿瘤的起始，生长，转移，耐药性和复发负责。

这些细胞被称为肿瘤干细胞（CSCs），因其具有干细胞特性如自我更新，不对称细胞分裂、分化和耐药性（1，2）。

肿瘤干细胞通过信号通路（包括Wnt和Notch）介导自我更新而起作用。

现已广泛接受——不规则干细胞的自我更新是癌症的起始、形成、复发的关键，且肿瘤干细胞在肿瘤细胞生物学中发挥核心作用。

因此，肿瘤干细胞特异性标记的识别可能在新肿瘤治疗方法的发现和发展中起重要作用。

Notch信号通路

作者支持下述假设——癌症的起始和发展涉及不正确的信号通路。

通常这些通路通过维持细胞增殖、分化、衰老、凋亡的平衡控制组织和器官的生长。

Notch信号通路在干细胞自我更新、细胞增殖中起关键作用。

因此，它具有重要的发展功能，其异常的活化会导致许多疾病和癌症（3-5）。

Notch基因编码大的单通跨膜蛋白，该蛋白调节细胞命运决定（6）。

既往果蝇、秀丽隐杆线虫和哺乳动物细胞培养的研究表明——Notch作为DSL蛋白（Delta,Serrate,andLag-2）家族的配体的受体通过两个下游信号通路起作用。

其中一个是通过CSL家族（CBF-1，Suppressorofhairless，Lag的合称）的转录因子，另一个通过细胞质适配器蛋白Deltex。

在哺乳动物中，Notch信号通路包括四个受体（Notch1–4）和五个配体（delta-like1,3和jagged-1，2）（7）。

Notch信号通路通过两个相邻细胞间配体-受体结合启动。

激活后，Notch蛋白进行剪切、释放其胞内段NICD并转位到细胞核内以激活下游靶基因的转录（8）。

肿瘤干细胞介导肿瘤形成中的Notch通路

Notch信号通路及其相关基因的修饰可导致配体失调，从而对人类起到戏剧性的进行性的影响，如Notch信号通路在一些遗传性疾病如显性遗传性脑动脉病伴皮层下梗死和白质脑病，Alagille综合征和脊椎肋骨发育不全中的影响。

自从在T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤中发现Notch1基因的变化，Notch信号失调已与许多实体瘤的病理和不同肿瘤类型（白血病、神经母细胞瘤、皮肤癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌）联系到一起（4，9，10）。

Notch信号通路在肿瘤发生发展中扮演的角色被认为主要是致癌，虽然一些研究也发现了在少数癌症（肝细胞癌和皮肤癌）中Notch信号通路有抗增殖作用（11–13）。

Notch信号的致癌作用一方面与主要在前列腺癌和乳腺癌存在中的Jagged-1高表达有关，另一方面与在40%的乳腺癌和30%的肺癌中发现的Numb蛋白活性丧失——Notch信号通路的一种负调节有关（5，14，15）。

因此，一方面，Notch信号通路的失调与转移、复发和总生存期降低相关。

另一方面，肿瘤的侵袭性与Notch和其他致癌通路如Wnt/β-catenin、NF-kB、RAS和Akt间的联系相关。

虽然单通路不规则的激活可能导致肿瘤生成，但致癌通路很少单独工作。

信号通路间的沟通增加了疾病的复杂性且这种沟通受微环境影响大。

近年研究发现，Notch和Wnt/β-catenin信号通路间的交互作用促进肿瘤干细胞自我更新失控，从而导致了CSC相关的肿瘤治疗后复发（19，20）。

Notch信号同时调节在肿瘤进展过程中肿瘤干细胞的形成和上皮间质转化（EMT）的表型。

，在肿瘤进展过程中出现的EMT过程促进肿瘤干细胞的转移性。

事实上，Notch介导的EMT将极化的上皮细胞转化为活动的，侵袭的细胞–由于失去E-cadherin（一种参与相邻细胞黏附的膜糖蛋白）而致使β-catenin激活、肿瘤细胞和肿瘤干细胞从原发肿瘤播散（21–23）。

Notch信号通路与多种致癌途径、转录和生长因子（如Snail，Slug和TGF-b）交互作用共同调节多种肿瘤发展、进展和治疗中的生理病理过程。

然而，越来越多的证据表明，Notch的调节是通过与miRNA交互作用实现的在分子水平上的调节，提示Notch在肿瘤生物学的这些分子中起重要作用（24，25）。

MiRNA生源论

miRNA是一类小的非编码的在翻译后水平上调控mRNA的RNA（26）。

miRNA与mRNA之间的相互作用是非常复杂的；特别是每个miRNA都可以调控数百个靶基因，特别是miRNA在蛋白质表达上的非凡影响。

我们才刚刚开始了解这类新调控因子影响肿瘤进程，至少在哺乳动物中。

在通过Drosha和Dicer由较长的初级转录物加工后，miRNA通过不完全互补与3’端非编码区的种子序列（八个碱基长度）上的靶基因结合，导致靶mRNA由于脱腺苷/mRNA切割或基因翻译启动抑制而降解（27，28）。

miRNAs参与了一系列的生理性或病理性的细胞功能，包括细胞增殖、凋亡、分化和自我更新（2，29）。

因此，miRNAs失调与一系列人类疾病包括癌症相联系，且其表达与肿瘤的发生、进展和预后均相关，主要是因为其在细胞增殖和细胞凋亡中的参与（30）。

miRNA在癌症中的差异表达形成了miRNA在癌症形成的独特模式，一些miRNA具有致癌活性而另一些则具有肿瘤抑制活性（肿瘤抑制因子）。

因此，癌症中致癌miRNAs上调而抑癌miRNAs下调（31）。

至于癌症生物学，靶向癌基因的miRNAs通常位于一个脆弱的地区，其在肿瘤中表达下调导致靶基因过度表达。

一个突破性的研究表明，50%的已知的人类miRNAs定位于这些不稳定的位点且与肿瘤及肿瘤进展过程中的功能相关（32）。

肿瘤与miRNAs

组织特异性/组织富集的时常失调的miRNA在肿瘤进展中同时作为肿瘤抑制因子和癌基因起着重要的作用。

例如，miR-21上调与乳腺癌和肺癌，胶质母细胞瘤、白血病、神经母细胞瘤以及肝转移相关（33，34）。

大脑特异性神经miR-124在胶质母细胞瘤中表达下调导致CSC数量和致癌能力增加（35）。

另一方面，正常在肺中表达的let-7在肺癌中表达下调且与肺癌预后不良相关（36），肺特异性肺miR-29在非小细胞肺癌细胞中抑制致瘤性，miR-143和miR-145已被证明在乳腺、宫颈癌和结直肠癌中下调（37，38）。

此外，miR-15a和miR-16丢失通过负调控抗在免疫系统中扮演支持角色的凋亡基因BCL2从而与慢性淋巴细胞白血病相关（39，40）。

同样的，其他许多的miRNAs与Notch信号传导通路相关，通过调节Notch相关基因影响许多类型的癌症（表1）。

通过Notch信号通路调控肿瘤的重要miRNAs

MiRNA-34家族

miR-34家族由miR-34a、miR-34b和miR-34c组成，与p53和Notch信号通路的调控相关。

低表达或不表达miR-34与乳腺癌、脑癌、胰腺癌和非小细胞肺癌发生概率更高相对应，提示其抑癌作用（24,41，42）。

在一组肿瘤来源的肿瘤细胞系如胰腺，黑色素瘤，肺，乳腺和神经胶质瘤发现了miR-34a的抑制现象（43，44）。

然而，miR-34b或miR-34c则已在恶性黑色素瘤和胶质瘤病例中发现（45）。

miR-34家族的参与已被证明影响大部分的肿瘤干细胞特性。

例如，miR-34的复原通过直接下调bcl-2和Notch信号通路抑制CD44+/CD133+胰腺来源肿瘤干细胞的自我更新（46）。

此外，转染mir-34c-3p入U251和U87胶质瘤细胞系会抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，且阻碍神经胶质瘤细胞的侵袭。

因此，mir-34c-3p过表达会减少Notch2水平（图1）提示抑制细胞增殖是通过Notch信号通路（45）。

另一方面，众所周知，Notch1与肿瘤干细胞“干性”特点相关且其促进EMT表型，这是与许多类型的癌转移密切相关的。

例如在前列腺癌中，表达上调的Notch1与前列腺癌的发展、转移与进展密切相关。

miR-34a在C4-2B和CWR22Rv1前列腺癌细胞中再表达使Notch1的表达减少，降低了前列腺癌细胞的自我更新能力并抑制其生长（47）。

综上所述，miR-34家族在神经胶质瘤细胞、胰腺癌中直接调节Notch1和Notch2蛋白表达，并在前列腺癌细胞中抑制肿瘤干细胞的自我更新和分化特性。

恢复miR-34水平下调Notch家庭成员最终可以被用作癌症治疗方法。

MiRNA-200家族

miR-200家族包括五个成员：

miR-200a、miR-200b，miR-200c，mir-141和mir-429.近期研究表明，miR-200家族与涉及乳腺癌、结肠癌、前列腺癌的肿瘤干细胞的调控密切相关。

低水平的miR-200c和miR-141与ZEB-1的高表达相关，ZEB-1是一种EMT激动子，其依次靶向Notch配体Jagged-1和Notch共激动子MAML2和3激动Notch信号通路。

降低miR-141和miR-200c表达影响两类人类癌症——胰腺癌和乳腺癌的基本类型中的肿瘤干细胞特性和耐药性（48）。

此外，miR-200家族包括miR-141和miR-429的重新表达直接抑制转移前列腺癌细胞的Jagged-1，提示一种控制Notch通路的命运的新方法（49）。

同样，在另一项研究中，miR-200b转染rink-1细胞（胰腺癌细胞株）降低了Jagged-1/2及其靶基因hey-1、hey-2（图1）和Bcl-2的表达水平，致细胞生长受抑（50）。

另一重要研究联系ZEBs调控的Notch3和miR-200家族，揭示了Notch在食管癌EMT、侵袭和肿瘤形成过程中非常重要（51）。

然而，为了解miR-200家族如何调节Notch信号通路有待进一步深入研究。

MiRNA-199家族

mir-199-5p已在髓母细胞瘤中与通过Notch信号通路调节细胞生长和几个CSC基因的转录因子Hes-1相联系。

转移癌患者中，'mir-199-5p表达丢失，然而其再表达又阻断了Notch信号通路（图1）和髓母细胞瘤干细胞样细胞的数量下降（25）。

Zollo’s小组又更进一步，通他们发展了稳定的核酸和脂质颗粒（snalps）用来在不同的致瘤细胞系如结肠癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤间传递mir-199-5p。

细胞增殖和CSC相关标志物受损可以归因于snalps传递mir-199-5p的效果，然而，因细胞类型不同而功效不同不能排除，且这些载体的效率可受限于其不稳定性和体内靶向非特异性（52）。

调控Notch的单MiRNA

最近也发现了miR-146a通过调控乳腺癌中的Numb蛋白与Notch相互作用（53）并通过Notch1激发NF-kB活性[综述文献（54）]。

另一个参与Notch通路的miRNA是miR-1，据报道，miR-1通过小鼠胚胎干细胞的DLL-1蛋白直接调节Notch。

mir-1已被证实与人类肝细胞癌、肺癌、前列腺癌和头颈部癌相关；因此，Notch通过miR-1与上述所有相关联只是时间的问题[综述文献（54）]。

Furukawa（55）最近的一项研究表明了结直肠肿瘤中miR-1和抑制Notch3表达的潜能的关联，抑制Notch3表达反过来导致Asef调节癌细胞的生长、迁移和侵袭能力下降。

其他报告显示miR-143基因与Notch1-3关联；这表明恶性血管球瘤中的miR-143–Notch1-3肿瘤发生机制是通过强miR-143启动子驱动Notch致癌基因的活化（56）。

miRNAs在肿瘤治疗中的应用

治疗癌症和肿瘤干细胞的发展带动了新一代癌症疗法。

基于MiRNA的方法有望成为下一大类肿瘤治疗方法。

目前的工作是基于mRNA调节治疗性蛋白质的表达和RNA干扰的变体如siRNA和miRNA，它可以阻止癌基因或扩增抑癌基因。

RNA干扰疗法的成功在于其有效性和在肿瘤细胞和肿瘤中传递到分子靶点的安全性。

然而，靶点传递对于miRNA疗法仍然是一个重大的挑战，因为裸核糖核酸被血清中的核酸酶快速降解而miRNA不能自由扩散进入细胞。

为将这一新的靶向药物传递至靶点，数个技术包括纳米微囊、纳米载体、微/纳米颗粒、脂质体和聚乙二醇微囊正在发展中。

miRNA或miRNA抑制剂的传输需要一个灵活高效的配送系统，例如，miR-34a被封装于稳定酸脂质颗粒中已用于体外靶向DLL-1（52）。

其他给药途径涉及试剂如亚胺（pu-pei）的使用以介导miRNA传递。

pu-pei介导的miR-145配送囊已被成功应用于miR-145靶向治疗胶质母细胞瘤（60）。

另一个成功的miRNA疗法候选可能是载体介导过表达的miRNAs使用腺病毒或慢病毒靶向体内肿瘤组织。

值得注意的是，miR-26a通过腺病毒载体成功表达在正常肝和肝肿瘤细胞上，以抑制肿瘤细胞增殖、导致细胞凋亡（61）。

然而，这种方法只能用于系统性局部传递。

在该领域的早期临床试验的失败证明，RNA干扰疗法中向肿瘤细胞中的靶分子的传递是至关重要的。

作者发展了一种新的miRNA传递系统适用于局部和全身给药——通过使用骨髓间充质干细胞（MSC）衍生微粒（MPS）。

此想法基于miRNA是通过MPS、外泌体和凋亡小体这一可控的、主动的过程释放入血。

结合胞内颗粒的miRNA能抵抗核酸酶降解且能在多种细胞间转移，改变受体细胞的基因表达（62–64）。

由此一种为MPS设计的新技术将包裹并传递特异性miRNA，影响肿瘤生长、新生血管形成和转移的相关基因的活化（65）。

MPS保留膜受体，使骨髓间充质干细胞选择性归巢到肿瘤部位并靶向肿瘤细胞，从而避免靶向健康细胞。

MPS在实体肿瘤中通过特定的趋化因子受体归巢、嫁接至肿瘤细胞膜表面融合，并将miRNA直接带入目标癌细胞，从而发挥治疗效果的同时，最大限度地减少与传统治疗相关的副作用（65，66）。

MPS治疗潜力进一步增强是由于其靶向恶性细胞的多个分子，而与之相比，其他疗法靶向单基因。

MPS治疗通过抑制细胞因子信号诱导免疫抑制，这使得该方法对现有癌症有效（65，67）。

结尾评论

miRNA的表达似乎改变了许多人类疾病，包括癌症，miRNA的革命已经开始并进入“miRNA再表达治疗”的阶段。

许多基因中，miRNA可以调节的是癌基因和肿瘤抑制基因，目前临床上使用的药物靶点。

虽然一些miRNA在癌症中过表达且看起来是作为癌基因本身起作用，但是更大数量的miRNAs下调癌症且有作为肿瘤抑制基因的潜能。

miRNA再表达、下调均已被证明具有抗肿瘤作用而再表达抑癌miRNA可以下调多种癌基因。

在生理水平上，肿瘤失去组织特异性miRNAs的再表达可以诱导肿瘤去分化。

失去的细胞miRNA再表达可以提供一个戏剧性的效果，因为miRNA调节大量的基因和信号通路。

然而，类似于其他RNA相关治疗，关键的挑战是保持不充分的传递和对肿瘤灶的治疗剂的稳定性。

miRNA拮抗剂和仿剂已经可以在市场上买到但仅限于本地管理且只适用于少数靶组织。

另一方面，miRNA疗法能模仿siRNA药物类似的途径，基因治疗的基于无囊包裹系统和/或基于囊包裹的传递系统。

了解miRNA的生物学和它在肿瘤发展中如何起作用，将为新的诊断和治疗提供工具。

基于miRNA的疗法不是传统的方法，需要进一步的发展和提高组成、稳定性和传送到目标区域的方法。

然而，miRNA表达谱将提供了一个新的和改进的癌症分类系统，为癌症生物学打开一个新的时代。

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