膜片钳前期调研综述.docx

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膜片钳前期调研综述

膜片钳前期调研综述

膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一的（或多个）离子通道分子活动的技术。

作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。

应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机制等进行深入的研究。

1．膜片钳技术原理

膜片钳技术（patch-clamptechnique）是在电压钳技术的基础上发展起来的，采用记录流过离子通道的离子电流，来反映细胞膜上单一的（或多个的）离子通道分子活动的技术。

该技术将一尖端经加热抛光的玻璃微电极管吸附在只有几平方微米的细胞膜上，通过在玻璃电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接，使与微电极尖开口处相连的细胞膜的小区域（膜片）与其周围的细胞膜在电学上完全分隔。

将膜片内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个膜片钳放大器测量此电流强度，就得到单一离子通道电流。

原理（见图1）

2.膜片钳技术发展历史

膜片钳技术是在电压钳（voltageclamp）技术的基础上发展起来的，电压钳技术由Cole和Marment设计，后经Hodgkin和Huxley改进并成功地应用于神经纤维动作电位的研究。

1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。

1981年Hamill和Neher等人对最早的膜片钳方法和电子线路做了较大的改进和完善，使其电流测量的灵敏度达到1pA，时间和空间分辨率分别达到10μs和1μm，并已逐步发展出几种适合不同需要的记录模式。

根据膜片与电极之间的关系，将这些记录模式分为四种:

细胞吸附式、膜内面向外模式、膜外面向外模式、全细胞模式四种。

3.膜片钳技术优缺点

膜片钳技术对细胞膜通道电流的记录具有很高的分辨率，信息含量大；能够改变细胞膜电位，进行单细胞记录，同时可以控制改变细胞的内外溶液成分，灵活性好；应用范围广，可以分析检测所有的离子通道类型；能记录到pA级电流变化和单通道开关状态，因此具有很高的高灵敏性；相对于荧光标记和放射性标记等手段具有更高权威性和精确性。

但是受限于膜片钳技术自身的缺点，仍然存在一些不可避免的问题，如每次只能对单个细胞进行操作，通量低，难以对细胞网络以及细胞间的通信进行研究，不能对胞内液进行方便换取。

在测量过程中，由于通道表达的缺乏会造成数据点丢失而引起数据不一致，需进行大量的实验。

对操作者的要求也非常高，需要熟练的技术人员进行小心翼翼、耗时耗力地在显微镜下手动控制显微操作仪，完成吸附、加液、换药、测量等一系列工作。

4.膜片钳技术主要用途

膜片钳技术广泛用于研究细胞离子通道，已经成为研究细胞水平生理功能的常用技术。

归纳其主要用途包括：

1）分辨单通道电流，直接观察通道开启和关闭的全过程。

通过测得的单通道特征参数可鉴别通道类型，同时可验证和研究通道的开关动力学模型。

2）单通道记录可以解释某些药物的作用机制，以研究特定药物对电压和递质依赖通道的影响。

3）膜片钳的空间分辨率高，在中枢神经系统中可分离细胞体与轴突和树突的电流；在周围神经系统中可深入了解受体的分布区域，绘制细胞表面的特定离子通道的分布图。

4）“内面向外”和“外面向外”膜片记录允许任意改变膜片内外溶液成分，分别研究单一组分对通道特征的影响，避免了其他成分的干扰。

而全膜片记录可用来研究常规电压钳无法研究的小型细胞，在控制细胞内一定离子浓度的同时监测整个细胞的电活动。

这种方法已被用于采用重组DNA技术表达的通道研究。

5.膜片钳技术的发展及应用

从1976年德国生理学家Neher和Sakmann首先建立膜片钳技术以来，该技术获得了快速的发展，已成为现代细胞电生理学研究中的常规方法，并逐步完善和发展出许多新的技术。

1）膜片钳技术与荧光技术的结合

荧光探针Fura-2、Fluo-3、Fluo-4等常用于检测细胞内的钙离子浓度，能与钙离子结合，产生较强的荧光，通过膜片微电极将其引入细胞，可以利用膜片钳记录细胞内的钙离子浓度，钙离子的释放及内流等情况，研究细胞膜钙离子通道的开放、关闭的动力学特征及生理学效应。

2）穿孔膜片钳技术

1988年Horn等对传统全细胞记录进行了改进，建立了穿孔膜片钳技术（perforatedpatchclamptechnique）：

即利用某些抗生素具有在生物膜上形成通透性孔道的性质，将这类抗生素充灌在电极液中，在高阻封接形成之后自发形成全细胞记录模式。

穿孔膜片钳技术通过应用一些特定的抗生素在膜片上形成选择性的孔道，不仅保持了电极内与胞内液之间电学的连续性，而且使细胞内环境相对稳定，有利于研究胞内信号转导机制和有rundown现象通道电流的记录，相对于传统的全细胞膜片钳技术实验成功率较高。

然而穿孔模式对离子选择性的分子基础目前尚不清楚，利用穿孔膜片钳技术记录全细胞电流的过程中可能出现再封口，单通道模式的形成以及自发性转变为传统的全细胞模式等现象仍需进一步观察和探讨。

3）在体膜片钳技术

在体膜片钳技术主要用于研究感觉系统对外界环境刺激的反应特性和机理。

早期膜片钳记录用的大多是急性分离的细胞，到了20世纪90年代，Pei等报道了在整体动物上进行膜片钳记录，从此开创了在体膜片钳技术的研究。

在体膜片钳的研究初期，以Blanton和Margrie为代表的“盲法”记录不能使电极与细胞膜准确地封接，带有一定的随机性，从而影响了该技术的准确性。

Margrie对此方法做了改进，采用TPTP（two-photontargetedpatching）技术。

该技术主要引入双光子显微技术，并结合荧光标记技术，使细胞内微电极的穿透可以准确的定位，能探测到胞体、树突甚至个别的棘突，大大提高了实验的准确率和成功率。

4）全自动膜片钳技术

全自动膜片钳技术是离子通道检测的新技术，它具有直接性、高信息量及高精确性的特点。

与常规的膜片钳技术相比，全自动膜片钳技术能够进行大量筛选，具有高通量性，并且高阻封接稳定，实验记录的精确性高，实现了操作过程的自动化。

SophionBiosc-ience公司研发了基于硅芯片系统的全自动膜片钳产品QPatch96，能够持续运行直到实验完成，提高了离子通道药物筛选的效率。

目前，该技术应用于以离子通道为靶标的药物的筛选，药效的测试以及安全性研究等方面。

5）膜片钳技术与分子生物学技术的结合

分子生物学是从分子水平上研究生物的形态结构及其功能的科学,膜片钳技术利用微电极来研究细胞膜上离子通道的通透性和电位的变化,二者之间的结合,可以将神经细胞离子通道的结构特性和物理特性展现出来。

同时,可在同一细胞中分离提取特异性表达的mRNA。

用膜片钳进行全细胞记录的同时,收集细胞胞浆,然后将mRNA反转录成cDNA,并进行PCR扩增,将PCR产物通过凝胶电泳和DNA序列进行分析。

再用特异性引物来区别离子通道亚单位,揭示神经细胞结构和功能的关系,从基因水平研究神经传导通路,提高对神经系统本质的认识。

6）膜片钳最新研究进展

传统膜片钳技术须先借助光学显微镜来实现玻璃微电极针尖在细胞膜表面的定位，之后再进行离子通道的记录，由于受制于光学衍射极限，光学显微镜的最高分辨率仅为200nm，因此探针定位不能实现对细胞膜表面200nm以下尺度的特定研究区域的准确选取。

为了解决传统膜片钳技术空间分辨率不足的限制，国内有学者将扫描离子电导显微镜技术（scanningionconductancemicroscopy,SICM）与商用膜片钳技术相结合，构建了基于SICM负反馈扫描控制技术的高分辨率膜片钳技术。

研究人员运用SICM负反馈技术控制纳米尺度玻璃微探针进行活体细胞表面的非接触扫描，获得细胞膜表面微结构的高分辨率成像，而后运用SICM负反馈控制技术操控该微探针在细胞膜表面非接触地移动并将其精确定位于扫描成像中感兴趣的膜表面纳米尺度微结构上方，最后利用该微探针作为膜片钳记录电极实现对此微结构的高分辨率电生理信号记录。

实验中，学者使用基于SICM负反馈控制的高分辨率膜片钳技术，成功实现了现代膜片钳实验中微探针的准确定位及特定纳米尺度微结构上的高分辨率膜片钳记录，为活体生物样品表面离子通道的空间分布及其功能研究提供了一种有效的工具。

补充：

目前国内院校中，华中科技大学生命科学与技术学院在膜片钳放大器研究方面取得较好的成绩。

学校研究团队已在武汉洪山科技园区成立华中科大仪博生命科学仪器有限公司，生产一系列型号的膜片钳放大器软硬件系统。

公司产品在进行的各种类型的电压门控和配体门控离子通道的全细胞和单通道记录实验中，能与美国的Axon和德国的EPC产品的记录相媲美。

美国AXON部分主要产品介绍：

1）MultiClamp700B电阻反馈式膜片钳和高速电流钳放大器

MD（Axon）的MultiClamp700B是计算机控制的微电极放大器，适用于各种细胞内或者细胞外的记录包括：

*高速电流钳（锐利电极或场电位）

*膜片钳（全细胞、巨膜片或者切割膜片）

*伏安法/电流测定法

*离子选择电极测量

*双分子人造膜记录

主要特征

*内部的自动模式开关

通过使用细胞膜电位作为触发器可以立即的转换记录模式。

预设电流钳模式中的电压阈值，当细胞膜中的电位达到该电压标准时，MultiClamp700B可以自动的切换到电压钳。

*振荡抑制

在全细胞记录时，突然改变细胞膜或者电极参数可能造成意外振荡。

MultiClamp700B会探测电流或者电压振荡并自动抑制或自动减少补偿设置来保护细胞。

*减缓电流注入

轻微的电压漂移，通常是由于电极性质的改变造成的，可能会污染到其它正常的电流钳记录。

为了持续的维持细胞膜电位，MultiClamp700B将按照用户设定的时间间隔，自动的注入补偿电流。

软件控制

代替通常的前面板按钮和开关，MultiClamp700B是由MultiClamp700B指令器,进行控制的，它是一个在主机（电脑和苹果机Macintosh，参看如下要求）上运行的程序，通过USB电缆与放大器进行通讯。

这种控制界面可以自动进行电桥平衡、吸液管偏移、吸液管和全细胞的电容补偿，除了"聪明的"特征，例如防止振动以及基于阈值的模式改变。

放大器的设置，例如增益、滤波器频率、全细胞电容、记录模式以及输入/输出缩放因素等都会通过计算机的操作系统的"信息"模式传送到数据采集软件中去。

2）Axopatch200B单探头超低噪声膜片钳放大器

Axopatch200B放大器是美国MD（Axon）公司设计的专门用于细胞膜电位信号放大的钳制放大器。

此放大器带宽1kHz时的开路噪声低到空前的15毫微微安陪以下，5kHz时的开路噪声低到60毫微微安陪以下，10kHz时的开路噪声最大130毫微微安陪。

带宽最大可达100kHz。

电容补偿100PF（β=1）或1000pF（β=0.1）。

将膜电位钳制为一个设定的电压值，记录膜离子通道电流信号。

保持膜离子通道电流为零，记录静息电位；设置恒定的膜离子通道电流，记录动作电位。

3）Digidata1440A数模转换器

Digidata1440A是MD公司推出的高分辨率、低噪声数模/模数转换器。

它的功能是将膜片钳放大器所采集的电信号转换成数码信号，从而被计算机采样软件识别并记录；同时，它还将计算机软件输出的刺激信号转换成模拟信号输出给膜片钳放大器并最终施加给细胞。

主要特点

*Digidata1440A系列转换器为16位A/D和D/A转换器，分辨率高。

*Digidata1440A系列转换器为即插即用设备，通过USB接口与计算机沟通，可被Window直接确认，使安装与设置更为简单。

*Digidata1440A单一导联的最高采样频率为250KHz，具有16个模拟信号输入导联、4个模拟信号输出导联、8个数码信号输出导联。

*输入范围：

-10.000V至+10.000V。

最大传输速度为4M采样点/秒，内部噪声和导联间的串扰平均小于±1mV（p-pat10kHz）。

*用于pClamp10、AxoScope10的采样，可通过USB界面直接与笔记本电脑连接。

主要应用范围

细胞内记录、场电位记录、膜片钳各种模式的记录、其他电生理信号的记录。

4）pClamp10记录和分析软件

主要特点

1.可通过MembraneTest功能监测并指导整个膜片钳技术操作过程，并给出瞬时封接以及膜反应参数。

2.集采样、分析功能于一体。

采样程序为Clampex，可采集细胞内外电位、自发放电活动、诱发电位、膜电位、动作电位、各种通道电流（全细胞、单通道）等。

分析程序为Clampfit，可对采集的各种信号进行数据处理、分析、作图、统计检验等。

3.pClamp10的分析程序Clampfit不需Dongle（密码锁），可装在任何计算机上使用。

4.支持MDC公司新一代转换器Digidata1440A和新一代双电极电压钳放大器Axoclamp900A。

主要应用范围

可记录几乎所有的电生理信号，主要的有：

（1）动作电位；

（2）肌电图（EMG）；

（3）眼动电图（EOG）；

（4）兴奋性突触后电流（EPSCs）；

（5）兴奋性突触后电位（EPSPs）；

（6）抑制性突触后电流（IPSCs）；

（7）抑制性突触后电位（IPSPs）；

（8）微小兴奋性电位（Minis）；

（9）长时程增强（LTP）；

（10）长时程抑制（LTD）；

（11）荧光染色比率；

（12）峰电位串；

（13）突触网络信号。

可对单细胞以及组织片进行如下模式的记录：

（1）电压钳；

（2）电流钳；

（3）全细胞记录；

（4）单通道记录。

德国EPC系列产品简介

德国HEKA公司生产的EPC（Extracellularpatchclamp）系列放大器的早期型号为EPC5，这是世界上最早的膜片钳放大器。

此后陆续升级为EPC7、EPC8、EPC9和EPC10，EPC9和EPC10为全电脑控制的膜片钳放大器。

目前EPC放大器的最高版本为EPC10膜片钳放大器。

EPC10USB膜片钳放大器主要有如下应用：

单通道记录：

可记录亚pA级的单离子通道电流。

低噪声全细胞膜片钳记录、电压钳/电流钳/低频电压钳（LFVC）记录：

可记录全细胞膜各种离子通道电流、细胞动作电位等。

传统细胞内记录：

可记录动作电位、细胞放电等。

使用金属电极的场电位记录：

如整体动物与脑片的诱发场电位记录。

突触长时程增强（LTP）/长时程抑制（LTD）记录：

整体动物与脑片的LTP/LTD记录。

松散封接记录、人工脂膜离子通道、纳米孔等的记录：

放大器探头有足够的大电流测量能力，最大可测量2μA的电流。

离子选择性测量：

采用离子选择性电极检测溶液中某一离子浓度。

电化学检测（伏安法/安培测量法）：

如采用碳纤电极的细胞或膜片安培测量法，检测细胞某些物质的释放。

细胞胞吞/胞吐或突触递质释放的研究：

采用膜电容测定法，可测量因细胞胞吞、胞吐或突触递质释放所引起的全细胞膜电容的微小变化。

EPC10膜片钳放大器具有如下显著特点：

仪器面板的各个功能钮/键均为计算机控制，所有操作均在程序面板中通过鼠标与键盘进行。

面板程序可在PC机（Windows2000\XP\Vista操作系统）和苹果机（MacOS10.4及以上版本操作系统）上运行。

放大器本底噪声小于90fA。

探头有三种反馈电阻，可测量的最大电流分别为200pA（50GΩ）、20nA（500MΩ）、2μA（5MΩ），测量范围满足绝大多数电生理实验信号的要求。

电极电容（快电容）和膜电容（慢电容）补偿可自动进行。

液接电位实现了自动校正，无需其他常见膜片钳放大器的手工计算与校正。

具有Lock-in放大器功能，可对膜电容微小变化进行精确检测，用于与膜面积有关的细胞分泌等的研究。

通过软件扩展功能，可进行离子浓度荧光检测，实现光电联合检测。