基于hplc分析南烛叶中乌饭成分的方法研究可.docx
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基于hplc分析南烛叶中乌饭成分的方法研究可
基于hplc分析南烛叶中乌饭成分的方法研究可
基于HPLC分析南烛叶中乌饭成分的方法研究可行性报告
及项目经费概算
一、项目可行性报告
（一）立项的背景和意义
南烛树又称乌饭树（VacciniumbracteatumThunb），为杜鹃花科植物，是常绿灌木，主要长在山坡林内和灌木从中，在其群落中为优势树种。
在我国分布
[1]极广，主要产于江苏、浙江一带，产量可观。
江浙一带民间有用南烛树叶渍米做乌饭的习俗。
据《本草纲目》记载:
“南烛树叶气味甘平、无毒、止泻除睡、强筋益气力。
久服轻身长年、令人不饥、变白却老、填胃补髓、消灭三虫。
取南烛茎叶捣碎，渍汁浸粳米，九渍九蒸九曝，米粒紧小如翳珠，袋盛，可以适远方也。
”从现代观点来看，南烛叶中的天然有效成分具有强身健体、减肥养颜、延年益寿的功效。
由于南烛树叶具有特殊的特性和口味，良好的抑菌防腐作用，可以作为天然色素和防腐剂。
而市场对新奇品种的需求逐渐旺盛，开发野生乌饭树具有十分重要的现实意义。
无论从药用、日用化工角度，还是从食品添加剂角度开发乌饭树系列产品都具有广阔的应用前景，并能产生较大的社会和经济效益。
但由于南烛叶作为原材料存在地域性和季节性的限制，以及国内外南烛叶中乌饭成分相关研究的缺乏，不适应现代人的生活节奏，南烛叶相关产品一直未能进入现代食品或者中药材市场，尚属于未开发的植物资源，关于南烛叶的研究还处于起步阶段。
关于南烛叶乌饭机理有诸多推测，有认为是花青苷引起的，也有认为是槲皮素引起的。
本项目申请者由于偶然机会发现，南烛叶冷冻后再放于室温下，在有水的条件下由绿色变为红色，而无水的条件下变成褐色，发生变色后的南烛叶不能和米饭共煮发生乌饭现象，说明南烛叶中乌饭成分对温度和水分的存在比较敏感。
后又经实验发现不同产地的乌饭叶乌饭效果相差较大，乌饭叶提取物在没有米存在的情况下单独加热并未发生变色反应，而含槲皮素的鱼腥草、荷叶等植物也并不能有乌饭现象的发生。
因此，现有的研究并不能确定出南烛
1
叶中的乌饭成分，也不能说明南烛叶的乌饭机理。
迄今为止对于乌饭叶的着色机理尚未有一个较为统一的意见。
如果开发南烛叶系列产品，必须对南烛叶乌饭成分的结构与理化性质进行进一步研究，对乌饭成分的分析检测方法进行探索，从而为制定南烛叶系列产品质量标准提供技术支持。
本项目拟通过研究不同产地南烛叶中的成分差异，从南烛叶中提取出不同的组分，将不同的组分与米饭进行共煮，以期寻找出南烛叶中能够乌饭的成分，建立南烛叶乌饭成分的HPLC分析方法。
并利用高效液相制备色谱技术分离制备出乌饭成分高纯品，采用UV、HPLC-MS、NMR等技术对该成分进行鉴定。
并通过研究有机溶剂、温度、时间、pH值、氧、金属离子、水分等对乌饭成分乌饭效果的影响来探索乌饭成分的理化性质。
为开发系列具有自主知识产权天然乌发剂和食品防腐剂等南烛叶系列产品提供理论依据和技术基础。
（二）国内外研究现状和发展趋势
[2]根据本草记载乌饭叶能够益精气、强筋骨、明目、益肠胃、补骨髓。
现代研究亦表明乌饭树叶含有花青素、无羁萜、表无羁萜醇、β-谷甾醇、熊果酸、蓝黑色素、异荭草素、对羟基桂皮酸、内消旋肌醇、α-亚麻酸、乌索酸、齐墩果酸、三十一烷、鞣质等，还含有多种微量元素，其中Fe、Mn、Zn等的含量
[3-5]相对较高。
有报道指出乌饭叶具有促进视红素再合成、Vp样机能、改善血
[6-8]液微循环、抗溃疡、抗炎症、抗衰老、止泄、抗菌等多种生理活性。
乌饭叶浸出汁和米饭共煮做成的乌米饭，具有驱虫效果，并且可以放置多日不馊不变质。
因此乌饭叶是一种良好的药食同源植物资源。
但迄今为止，由于国内外对于南烛叶的研究尚未引起足够重视，属于未开发的植物资源，因此关于南烛叶的研究还处于起步阶段，目前关于南烛叶相关报道较少，仅有的少量报道主要集中于南烛叶中的有效成分提取的研究和有效成分药效的研究两个方面，而对于乌饭叶中乌饭成分的分离纯化、乌饭成分分析方法的建立以及乌饭机理的探讨尚处于空白状态。
关于乌饭叶有效成分药效的研究报道主要集中于抗疲劳、提高免疫力、保
[9]护视网膜、抗炎抗过敏和抗病毒等方面。
James等报道乌饭树嫩叶的醇提取物具有抗疲劳和耐寒作用，乌饭树提取物具有增强记忆和提高动作协调能力的功
[10]能。
闫赋琴等研究表明乌饭树提取物能够减轻大鼠氧化应激损伤，提高应激
2
[11]刺激大鼠脑组织中的SOD值。
王立等研究通过体外实验表明乌饭树提取物具
[12]有抑制癌细胞生长和清除氧自由基的作用。
张雪彤等的研究发现乌饭树叶及
[13]其提取液能明显提高视网膜功能，对视网膜具有明显的保护作用。
黄丽娜等研究发现乌饭叶醇提物能够对睡眠剥夺大鼠所致的精神疲劳有一定的改善作用，可以提高精神疲劳大鼠的自发活动度与认知能力，并通过改变脑干内的单
[14]胺类递质的含量发挥作用。
章海燕等采用二倍稀释法和管碟法对乌饭树树叶提取物进行体外抑菌实验，研究表明乌饭树叶提取无对霉菌和酵母菌的抑菌效果不明显，而对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽胞杆菌等抑菌效果较好，并且热处理会降低乌饭树树叶醇提物和水提物的抑菌效果，但会改善乌饭树树
[15][16]叶多糖的抑菌效果。
Weiss等、Li等研究表明乌饭叶中的槲皮素还具有保护血管、抗炎、抗过敏和抗病毒的作用。
乌饭树叶的众多功效引起众多学者对乌饭树叶色素的提取及理化性质作了大量的研究与推测。
有的学者认为其枝叶中的色素与同属植物果实中的色素相近，为多种花色甙类，呈紫红色。
也有学者推测乌饭树叶中色素的主要成分是环烯醚萜类化合物。
还有学者认为乌饭树叶中含有丹宁和丰富的铁质，丹宁遇铁离子变成兰黑色，其着色度牢而有光泽。
也有部分学者推测乌饭叶中的槲皮素含量较高，并认为槲皮素为乌饭叶中的主要色素成分。
因此关于乌饭叶中有效成分提取的研究主要集中于色素和黄酮类化合物的提取与分离纯化。
[5][17]林勇、植雄等的研究报道，以质量分数为50%-60%的乙醇作为提取溶剂，提取温度在50?
-60?
之间，该条件下提取的乌饭树色素与水提法得到的色素特征基本相似，在可见区无特征吸收峰，在紫外区286nm及309nm处均有
[4]吸收，并推测乌饭树色素是花色苷类物质。
胡志杰等研究报道乌饭树叶色素浸膏呈黑色膏体，具有龙眼香气，无异味，具有较强的吸湿性，易溶于水，微溶于75%的乙醇，不溶于乙醚、脂肪和油类。
色素耐光性、耐还原性强，耐氧化性较弱，酸性条件下较稳定，碱性、冷藏、热加工有增加色素色泽良好的效果。
加热到70?
时颜色变深变黑，并且能与氯化钠、Vc、苯甲酸共存短时间内
[18]无明显变化，对米饭、蛋清和毛发等有良好的染色效果。
张琳等采用多种色谱技术分离出南烛叶中的黄酮苷类成分，并采用波谱技术和理化性质鉴定出了其中的12种黄酮苷类成分，其中有四种是首次从越橘属中分离出，有8种是首
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次从南烛中分离出的。
由于南烛叶着色与诸多因素有关，并非是花青苷或者槲皮素单独作用的结
果，因此关于南烛叶中乌饭成分的分离和提取虽有一定的研究，但多数集中于
大类组分、花色苷或槲皮素的提取分离，关于南烛叶乌饭成分的机理也只是一
个推测，并未得到统一定论。
因此对于乌饭成分的纯化鉴定工作尚未展开，而
对于南烛叶中乌饭成分的分析方法建立缺乏相应的标准品，南烛叶中乌饭成分
分析方法的建立处于空白状态，这严重制约了南烛叶的产业化开发。
因此有必
要开发乌饭成分的分离分析技术，建立南烛叶中乌饭成分的分析方法，为开发
系列南烛叶防腐剂、着色剂等产品质量标准提供技术支持。
参考文献
[1]魏振承，张名位.乌饭树属植物资源的营养功能及其开发应用[J].中国野生植物资源，
2007
（2）:
21-23.
[2]屠鹏飞,胡迎庆,刘江云.越桔属植物的化学成分与开发应用价值[J].中草药,1996,27
（9）:
565-568.
[3]江水泉,李伯珩.野生乌饭树叶中脂肪的超临界CO萃取及色谱分析[J].中国油脂,2
2003,28（7）:
56-57.
[4]胡志杰,姜萍.乌饭树叶色素提取工艺及色素性质再研究[J].中国野生植物资源,
2001,20
（1）:
47-48.
[5]林勇,朱良辉,吴永忠.比色法测定不同产地乌饭叶总黄酮含量[J].时珍国医国药,1999,
10
（2）:
97-98.
[6]ConnorAM.Variabilityinantioxidantactivityinblueberryandcorrelationsamongdifferent
antioxidantactivityassays[J].JournalofAmericanSocietyforHorticulturalScience,2002,
127
（2）:
238-244.
[7]ZhangXT,ZhangHY,YaoHY,etal.EffectofVacciniumbracteatumThunb.leavesextract
onbloodglucoseandplasmalipidlevelsinstreptozotocin-induceddiabeticmice[J].Journal
ofEthnopharmacology,2010,130（3）:
465-469.
[8]陶欣艺,卢艳花,周文瑜,等.欧洲越桔和笃斯越桔对神经细胞氧化损伤的保护作用[J].中
国临床康复,2005,9（33）:
50-53.
[9]JamesA.Reversalsofagerelateddeclinesineuronalsignaltransduction,cognitive,and
motorbehavioraldeficitswithblueberry,spinach,orstrawberrydietarysupplementation
4
[J].TheJournalofNeuroscience,1999,19（18）:
8114-8121.
[10]闫赋琴,孙慧萍,吕娟丽.乌饭树叶提取物改善大鼠氧化应激状态的研究[J].中国药
师,2010,13（3）:
357-358.
[11]王立,姚惠源,陶冠军等.乌饭树树叶中黄酮类色素的抗氧化活性[J].食品与生物技术
学报,2006,25（4）:
81-85.
[12]张雪彤,王立.乌饭树提取物对兔眼视网膜电流图的影响[J].苏州大学学报（医学版）,
2006,26（6）:
1092-1094.
[13]黄丽娜,马文领,周健,等.乌饭树叶醇提物抗大鼠精神疲劳作用[J].中国公共卫生,2008,
24（8）:
964-966.
[14]章海燕,王立,张晖.乌饭树树叶不同提取物抑菌作用的初步研究[J].粮食与食品工
业,2010,17
（1）:
34-37.
[15]WeissEI.Inhibitoryeffectofahighmolecularweightconstituentofcranberryonadhesion
oforalbacteria[J].CriticalReviewsinFoodScienceandNutrltion,2002,42（3）:
l285-292.
[16]LiW，XueTZ,ZhangHYetal.EffectofVacciniumbracteatumThunb.leavesextract
onbloodglucoseandplasmalipidlevelsinstreptozotocin-induceddiabeticmice[J].
JournalofEthnopharmacology,2010,130（3）:
465-469.[17]植雄,江水泉.超临界萃取南烛叶有效成分的色谱分析[J].南京农业大学学报,1999,22
（1）:
101,103.
[18]张琳,李宝国,付红伟等.乌饭树叶黄酮苷类成分研究[J].中国药学杂志,2009,44（23）:
1773,1776.
（三）项目主要研究开发内容、技术关键及主要创新点。
项目的主要研究内容
本项目拟通过研究不同产地南烛叶中的成分差异，并从南烛叶中提取出不
同的组分，将不同的组分与米饭进行共煮，以期寻找出南烛叶中能够乌饭的成
分，建立乌饭成分的HPLC分析方法;并利用高效液相制备色谱技术分离制备
出乌饭成分高纯品，采用UV、HPLC-MS、NMR等技术对该成分进行鉴定。
通
过研究溶剂、温度、时间、pH值、氧、金属离子、水分含量等对乌饭成分乌饭
效果的影响来探索乌饭成分的理化特性，揭示乌饭成分的乌饭机理。
从而为开
发具有自主知识产权天然乌发剂和食品防腐剂等南烛叶系列产品提供理论依据
5
和技术基础。
本项目主要包括南烛叶中乌饭成分的分离纯化技术和南烛叶乌饭机理的研究。
第一部分为南烛叶中乌饭成分的分离纯化和鉴定。
利用HPLC分析不同产地南烛叶中的成分差异，并对南烛叶中的不同组分进行提取和乌米饭共煮，寻找出乌饭成分，建立南烛叶中乌饭成分的HPLC分析方法。
用柱层析法探索乌饭成分的分离纯化工艺，并利用高效液相制备色谱技术制备出乌饭成分的高纯品进行UV、HPLC-MS和NMR鉴定，从而确定出南烛叶中的乌饭成分。
第二部分为乌饭机理的研究。
通过研究溶剂、温度、pH值、金属离子、氧、水分、光线等因素对乌饭成分乌饭效果的影响，探讨乌饭成分的理化特性及其乌饭机理，为开发南烛叶天然乌发剂、天然防腐剂和天然色素等系列产品提供理论依据。
拟解决的关键问题
1）南烛叶中的乌饭成分的分离鉴定
2）南烛叶中乌饭成分的HPLC分析方法建立
项目的主要创新点
1）寻找出南烛叶中的乌饭成分
2）探索出乌饭成分高纯品的高校液相制备色谱的制备工艺
（四）项目预期目标（主要技术经济指标、社会效益、技术应用和产业化前景以及获取自主知识产权的情况）。
1）建立南烛叶中乌饭成分的HPLC分析方法;
2）建立南烛叶中乌饭成分高纯品的高效液相制备色谱制备工艺;
3）发表高水平论文3篇，撰写发明专利1项。
4）培养硕士生2名。
（五）项目实施方案、技术路线、组织方式与课题分解。
拟采取的技术路线和研究方法
1）采用HPLC研究不同产地南烛叶中的成分差异，研究不同产地南烛叶乌
6
饭效果和成分差异的相关性。
2）采用不同极性的溶剂对南烛叶中的成分进行提取，研究不同提取物乌饭效果的差异，寻找出乌饭组分。
3）探索乌饭成分的分离纯化工艺，并采用高效液相色谱制备技术制备出具有乌饭效果的乌饭成分高纯品。
4）采用UV、HPLC-MS、NMR对乌饭成分进行鉴定。
5）建立南烛叶中乌饭成分的HPLC分析方法
6）研究金属离子、温度、氧、水蒸汽等对乌饭成分乌饭效果的影响，探索南烛叶中乌饭成分的理化性质及其乌饭机理。
项目的总体研究框架如下图所示。
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（六）计划进度安排。
2012.1-1012.12
1）不同产地的南烛叶采集及常规营养成分的测定;
2）南烛叶中乌饭组分的筛选;
3）乌饭组分的纯化工艺及分析方法的建立
4）撰写不同产地南烛叶营养成份研究、南烛叶中乌饭组分的HPLC分析方法研究论文2篇;撰写乌饭成分纯化工艺专利一项
2013.1-2013.12
1）乌饭组分的UV、HPLC-MS、NMR鉴定;
2）乌饭组分乌饭条件的研究;
3）金属离子、pH、温度等对乌饭成分的影响
4）撰写?
乌饭成分乌饭机理的研究论文
5）本项目的考核、鉴定、验收、结题。
（七）现有工作基础和条件。
申请者，女，讲师，工学博士，分析化学博士后。
自1999年以来，项目负责人长期从事天然产物的药理药效学研究、天然药物中有效成分的提取分离、天然产物质量标准的研究等工作。
先后参与的项目有工蜂胎免疫活性肽的结构与功能研究、蜂胶功效成分提取新技术研究及系列产品开发、蜂胶的纳米化技术研究及系列产品研制、中药配伍引起的物理化学变化研究新思路、叶绿素及其衍生物的分析及标样制备、神经系统药物药效评价体系的建立及新药开发研究、燕窝蛋白的水解工艺及抗皱美白活性成分的筛选等项目。
协助指导博士论文2名，硕士毕业论文4名。
申请者发表的论文及授权专利
1.Investigationontheoriginof5-HMFinShengmaiyindecoctionbyRP-HPLCmethod.
JournalofZhejiangUniversitySCIENCE.2005,6B（10）:
1015-1021.
2.Investigationoninfluentialfactorsof5-HMFcontentinSchisandraJournalofZhejiang
UniversitySCIENCE.2007,8（6）:
439-445.3.Fructosedecompositionkineticsinorganicacidsenrichedhightemperatureliquidwater.
BiomassandBioenergy.2009.05:
1182-1187.
8
4.KineticstudyofthecomplexationofgallicacidwithFe（II）.SpectrochimicaActaPartA:
MolecularandBiomolecularSpectroscopy.2009,3:
829-834.
5.Effectsofethanolandwaterextractsofpropolis（beeglue）onactuteinflammatoryanimal
models.JournalofEthnopharacology.2005,100:
276-283.
6.EnhancedactivityofyqhDoxidoreductaseinsynthesisof1,3-propanediolbyerror-prone
PCR.ProgressinNaturalScience.2008,12:
1519-1524.
7.ProtectiveeffectsofChineseandBrazilianpropolistreatmentagainsthepatorenallesionin
diabeticrats.Human&ExperimentalToxicology.2011.03
8.BiologicalActivitiesofChinesePropolisandBrazilianPropolisonStreptozotocin-Induced
Type1DiabetesMellitusinRats.2011.08.
9.炮制对五味子中5-HMF含量的影响初探.中国现代应用药学.2010.27（11）:
992-995.
10.高效液相色谱—串联质谱法对蜂王浆中27种药物残留的同时测定.分析测试学报.
2010.29（6）:
539-543.
11.炮制对北五味子水浸率影响的研究，现代生物医学进展.2007,7（5）:
707-710
12.蜂胶提取液对大鼠急性胸膜炎的作用及其机制的研究.营养学报.2007,29
（2）:
189-191.
13.中药配位化学研究进展.中国中药杂志.2006,31（16）:
1309-1313.
14.顶空气相色谱法在药物分析中的应用.药物分析杂志.2005,25（11）:
1404.
15.蜂胶对大鼠佐剂性关节炎作用及其机制研究.中国药学杂志.2005,40（15）:
1146-1148.（EI
收录）
16.不同方法提取的蜂胶液中总黄酮含量的测定及抗肿瘤及抗炎作用研究.中国食品学报.
2005,5（3）:
11-15.
17.蜂胶对急性肺损伤大鼠肺组织中NF-KB活性及CD54表达的影响.中国病理生理杂志.
2004,20（6）:
1066-1069.
已授权专利
1一种水溶性蜂胶的提取方法及用途.专利号:
ZL03150648.8.发明专利.
2去苦去涩佛手酒的制备方法.专利号:
ZL200410067006.7.发明专利.
3纳米蜂胶制品的制备方法.CN200510049745.8.发明专利.
4亚微米蜂胶微胶囊的制备方法.CN200510049746.2发明专利.
5一种化妆品用燕窝提取物的制备工艺.CN200710069423.发明专利.
9
6大孔吸附树脂从虫草发酵废水中回收腺苷的方法.CN20071006731发明专利.7.一种利用酶解与膜过滤耦合技术连续制备窄分子量分步燕窝提取物的方法.
CN200810061920.发明专利.
工作条件
本项目申请者博后时的合作导师所在单位是国内最早开展天然产物分离领域学术研究的单位之一，长期从事天然产物提取分离纯化方面的理论研究及应用技术的开发。
该单位学校分析测试中心和“211化学工程学科群”拥有先进的NIR、GC/MS、HPLC/MS、NMR、XRD、元素分析等仪器，可支撑本项目的特殊分析需要。
本项目组成员所在的学院分析测试中心可提供本项目使用的仪器有:
GC、HPLC、UV和高效液相制备色谱。
所有设备的使用已得到落实。
二、经费概算
省级科技计划项目经费概算表
项目名称:
金额单位:
万元
省财政拨款地方部门配套概算科目名称合计经费经费
（1）
（2）（3）（4）
5一、经费支出（合计）105
4.5
（一）直接费用9.04.5
1、设备费
（1）购置设备费
（2）试制设备费
（3）设备租赁费
2、材料费3.3
2.23、测试化验加工费
4、燃料动力费
1.555、差旅费
6、会议费
7、合作协作研究与交流费
8、出版/文献/信息传播/知识产权事务费1.2
0.759、劳务费
10、专家咨询费
0.51.00.5,二,间接费用
11、管理费0.5
10
0.512、激励费
三,其他
13、其他费用明细说明
5105二、经费来源（合计）
1、申请省财政经费5
2、地方、部门配套拨款5
3、自筹经费
（1）单位自有货币资金
（2）其他资金注:
支出概算按照经费开支范围确定的支出科目和不同经费来源编列，同一支出科目一般不同时在财政拨款经费和自筹经费中概算。
二、经费概算说明
承担单位和相关部门可以提供大型仪器的使用，本项目的经费主要用于实验材料购买、资料复印与信息传播和知识产权事务费、测试化验费、差旅费和管理费。
实验材料费主要包括实验原料费用、化学试剂费用、色谱柱填充料费用、液相色谱用溶剂费用等。
出版/文献/信息传播/知识产权事务费主要
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