《饲料中乙酸异戊酯乙基麦芽酚肉桂醛大茴香脑γ.docx

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《饲料中乙酸异戊酯乙基麦芽酚肉桂醛大茴香脑γ

《饲料中乙酸异戊酯、乙基麦芽酚、肉桂醛、大茴香脑、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、香兰素、乙基香兰素、桃醛的测定

气相色谱法》编制说明

（征求意见稿）

辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心

2017年6

一、工作简况

（一）任务来源

（二）主要工作过程

2016.1-5文献查询，试剂、色谱柱及标准物质的购置。

2016.12-2015.5样品前处理方法确定，研究优化气相色谱条件，灵敏度和精密度试验，进行重现性试验。

2017.6-8编写标准草案和编制说明，形成标准的《征求意见稿》。

（三）主要参加单位

主要参加单位为辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心，无其他协作单位。

（四）目的及意义

根据农业部2045号公告《饲料添加剂品种目录（2013）》及《食品安全国家标准食品添加剂使用卫生标准》（GB2760）中食品用香料名单中规定，食品用香料可以作为饲料添加剂使用，乙酸异戊酯、乙基麦芽酚、肉桂醛、大茴香脑、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、香兰素、乙基香兰素、桃醛均在食品用香料的目录之列,且均为常用的饲料香味添加剂。

而目前国内、外有关乙酸异戊酯、乙基麦芽酚、肉桂醛、大茴香脑、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、香兰素、乙基香兰素、桃醛的添加检测方法研究主要针对食品检测领域，仅有少量地方标准有针对上述香味剂作为饲料添加剂的检测方法，均为气相检测法【1-10】。

目前国内外尚无包含饲料中乙酸异戊酯、乙基麦芽酚、肉桂醛、大茴香脑、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、香兰素、乙基香兰素、桃醛等9种香味剂的相应国家或行业检测方法。

因此，本标准建立的检测方法，填补了上述9种香味剂检测标准的空白，为开展饲用香味剂的监督监测提供法律意义上的技术支撑。

二、编制过程

（一）乙酸异戊酯、乙基麦芽酚、肉桂醛、大茴香脑、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、香兰素、乙基香兰素、桃醛的理化性质及结构

1、化学结构式

香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑、乙基麦芽酚的化学结构式见图1-图9。

图1香兰素化学结构式图2乙基香兰素化学结构式

图3肉桂醛化学结构式图4桃醛化学结构式

图5乙酸异戊酯化学结构式图6γ—壬内酯化学结构式

图7肉桂酸甲酯化学结构式图8大茴香脑化学结构式

图9乙基麦芽酚化学结构式

2、理化性质

香兰素（Vanillin），白色至浅黄色晶体，熔点81~83℃，沸点284~285℃，相对密度1.060，闪电147℃，具有香荚兰香气及浓郁的奶香，广泛用在食品、日化、烟草等工业中作为香料、矫味剂。

溶于125倍的水、20倍的乙二醇及2倍的95%乙醇，溶于氯仿。

乙基香兰素（ethylvanillin）为白色至微黄色针状结晶或结晶性粉末，熔点77~78℃，沸点285℃，闪点146℃，类似香荚兰豆香气，香气较香兰素浓。

微溶于水，溶于乙醇、乙醚、氯仿。

肉桂醛（Cinnamaldehyde）：

无色或淡黄色粘稠状液体，大量存在于肉桂等植物体内。

有强烈的桂皮油和肉桂油的香气，温和的辛香气息，不应有辣味，香气强烈持久。

熔点-7.5℃，沸点253℃，难溶于水、甘油，易溶于醇、醚和石油醚中，能随水蒸气挥发。

桃醛（γ-Unsecalactone）,无色至淡黄色略粘稠透明液体。

有强烈的桃子和杏仁香气。

沸点286℃，闪点>230°F。

溶于乙醇、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、碱液、大多数非挥发性油和矿物油，几乎不溶于甘油和水。

乙酸异戊酯（Isoamylacetate），无色中性液体。

有香蕉香味。

熔点-78℃，沸点143℃。

几乎不溶于水和甘油，可混溶于乙醇、乙醚、苯、乙酸乙酯、二硫化碳等多数有机溶剂。

γ—壬内酯（gamma-Nonanolactone），俗称十八醛、椰子醛，是一种淡黄色或无色油状液体。

具有强烈椰子香气。

沸点266.6℃，闪点98.8℃。

易溶于乙醇、乙醚及油类，不溶于水。

肉桂酸甲酯（methylcinnamate），白色至淡黄色结晶或无色至淡黄色液体。

熔点34~38℃，沸点260~262℃，闪点>110℃。

溶于乙醇、乙醚、甘油、丙二醇、大多数非挥发性油和矿物油，不溶于水。

大茴香脑（anethole）无色或微黄色液体或结晶。

熔点20~21℃，沸点234~237℃，闪点195°F。

能与氯仿、醚混溶，溶于苯、乙酸乙酯、丙酮、二硫化碳、石油醚和醇，不溶于水。

带有甜味，具茴香的特殊香气。

乙基麦芽酚（ethylmaltol），为白色或微黄色晶体，遇碱呈黄色。

熔点89～92℃,易溶于热水、乙醇、氯仿与甘油,有焦糖香味和水果味。

乙基麦芽酚溶解度在15℃时65mL水中可溶解1g，25℃时55mL水可溶解1g。

3、主要作用和配方含量

有效刺激幼龄动物的嗅觉，吸引动物采食，有效掩盖饲料异味。

提高饲料适口性，诱食作用，提高采食量，加快动物生长速度。

掩盖饲料中异味，改善适口性。

使不同批次的饲料具有相同的香味，抵抗换料、高温、疾病等引起的应激反应。

使饲料更具商品性，提高质量档次。

【11】

常见饲用香味剂配方含量为1g/kg以上。

（二）方法的研制和试验条件的确定

1、色谱柱的选择

参照9种香料的相应的食品添加剂国标方法【2-10】，分别以DB-5（5%苯基甲基聚硅氧烷）长30米和60米的毛细管柱进行了试验，最终根据分离度和添加回收试验数据，选用了DB-5长60米的毛细管柱，其可以提供更好的分离和保留效果。

因此，该方法应用DB-5毛细管柱，长60m，内径0.25mm，膜厚0.25µm色谱柱进行本次检测方法研究。

2、色谱条件的选择

由于香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑、乙基麦芽酚的沸点及理化性质有很大差异，为了使这几种物质更好地分离，其他的物质不对其产生影响，在参照相应食品添加剂的国标方法（见表1）的基础上，本标准选用了程序升温的方式，并对不同的升温速率和温度进行了多次优化，以混合标准溶液多次进样，对色谱基线稳定性、保留时间、分离度等进行考察，最终确定的色谱条件为：

色谱柱：

DB-5毛细管柱，长60m，内径0.25mm，膜厚0.25µm，或性能类似的分析柱；

载气：

氮气，2.0mL/min；

分流比：

10：

1；

进样口温度：

270℃；

检测器温度：

290℃；

柱温箱温度：

起始温度90℃，保持2min，以15℃/min升至200℃，保持8min；

进样量：

1L。

试验结果表明该色谱条件均满足色谱分析的需要。

结果见图10。

图10香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑、乙基麦芽酚混合标样（20µg/mL）色谱图

物质名称

颁布的标准编号

使用仪器设备/检测器

使用色谱柱固定相

备注

香兰素

GB3861-2008

气相/FID

SE-30

乙基香兰素

QB/T1791-2006

气相/FID

5%-10%PEG-20M

肉桂醛

GB28346-2012

气相/FID

（5％苯基）甲基聚硅氧烷。

桃醛

QB/T1784-2007

气相/FID

HP-5,5%苯基甲基聚硅氧烷

乙酸异戊酯

GB6776-2006

气相/FID

PEG-20M

γ—壬内酯

QB/T1121-2007

气相/FID

HP-5,5%苯基甲基聚硅氧烷

肉桂酸甲酯

GB28348-2012

气相/FID

二甲基聚硅氧烷

大茴香脑（天然）

GB23489-2009

气相/FID

极性柱

天然大茴香脑（包含大茴香脑）

乙基麦芽酚

GB12487-2010

气相/FID

（5％苯基）甲基聚硅氧烷

表1相应食品添加剂的国标方法

3、提取液和提取方式的选择

根据香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑、乙基麦芽酚的理化性质，以上9种香味剂均易溶于乙醇或氯仿中溶解，在水中几乎不溶，结合实验室常用试剂及其毒性的大小，选择了无水乙醇进行试验。

试验结果表明，用无水乙醇作为提取液时，其回收率高，因此选择无水乙醇为提取液。

用无水乙醇为提取液，用涡旋振荡、摇床震荡和手摇动、超声分别提取5min、10min、20min、30min进行了比较。

试验结果表明：

超声提取20min的回收率较高且用时比30min短，故选取选用超声提取20min。

4、样品前处理和色谱条件的确定

综上所述，样品前处理过程确定为：

称取试样1g（精确至0.1mg），置于10mL棕色容量瓶中，加5mL无水乙醇，手动振摇混匀，超声20min后，用无水乙醇定容至刻度。

手动振摇5min，混匀后静置。

取上清溶液，溶液过0.45µm的微孔滤膜，供上机测定。

气相色谱参考条件：

色谱柱：

DB-5毛细管柱，长60m，内径0.25mm，膜厚0.25µm，或性能类似的分析柱；

柱流量：

2.0mL/min。

检测器温度：

290℃。

进样口温度：

270℃。

柱箱温度：

起始温度90℃，恒温2min。

以15℃/℃速率升温到200℃，恒温8min。

进样量：

1L。

（三）方法性能试验

1、标准品的定位及标准工作溶液的方法线性试验

用浓度为20g/mL的香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑、乙基麦芽酚标准工作液测定，得出九种标准品的出峰时间，结果见表2。

香味剂名称

乙酸异戊酯

乙基麦芽酚

肉桂醛

大茴香脑

γ—壬内酯

肉桂酸甲酯

香兰素

乙基香兰素

桃醛

出峰时间（min）

5.397

9.953

10.911

11.020

11.801

12.091

12.228

12.863

14.310

表2：

九种香味剂出峰时间

用浓度分别为5.00g/mL、10.00g/mL、20.0g/mL、50.0g/mL、100.0g/mL、200g/mL和500g/mL的混合标准工作溶液，每个浓度连续进样3次，按平均值,以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，计算标准曲线线性。

试验结果表明各种香味剂的浓度范围在5.00g/mL-500g/mL时，标准曲线的R2均≥0.999，有很好的线性，结果见图11-19。

图11：

乙酸异戊酯的标准工作液的线性

图12：

乙基麦芽酚的标准工作液的线性

图13：

肉桂醛的标准工作液的线性

图14：

大茴香脑的标准工作液的线性

图15：

γ—壬内酯的标准工作液的线性

图16:

肉桂酸甲酯的标准工作液的线性

图17：

香兰素的标准工作液的线性

图18：

乙基香兰素的标准工作液的线性

图19：

桃醛的标准工作液的线性

2、方法检出限和定量限

5µg/mL标准溶液的色谱图见图20，可见浓度为5µg/mL的9种香味剂混标溶液的色谱图分离度很好。

在空白载体中分别添加香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑、乙基麦芽酚各20mg/kg，色谱图见图20，空白饲料色谱图见由图22，添加回收试验结果见表3。

根据结果显示图谱中信噪比达到3:

1，将所以，将该方法的最低检出限定为20mg/kg。

图9种香味剂5µg/mL混标色谱图

图空白饲料中分别添加9种香味剂各20mg/kg色谱图

图空白饲料色谱图

在空白饲料中分别添加香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、大茴香脑、乙基麦芽酚各50mg/kg，结果见图23和表2。

通过添加回收试验表明，在添加浓度为50mg/kg时，信噪比达到10:

1且样品的回收率均在70%以上，且平行样品的重复性均小于10%。

因此，该方法的定量限为50mg/kg。

根据饲料中香味剂常用的使用量，该方法确定的最低检出限20mg/kg和定量限50mg/kg能满足各种饲用调味剂的检测。

图空白饲料中添加9种香味剂各50mg/kg色谱图

添加浓度（mg/kg）

乙酸异戊酯

乙基麦芽酚

肉桂醛

大茴香脑

γ—壬内酯

肉桂酸甲酯

香兰素

乙基香兰素

桃醛

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

回收率（%）

RSD

%

20

78.5

74.2

71.0

77.5

70.2

78.6

5.0

70.4

71.5

76.3

77.4

75.8

71.2

4.1

82.1

80.4

78.9

75.3

74.2

77.5

3.8

71.2

73.2

70.5

77.4

76.3

77.8

4.3

75.6

74.3

71.5

72.3

79.5

80.2

4.8

75.5

74.2

77.1

78.6

83.5

88.4

6.8

78.5

74.2

77.2

72.9

78.6

79.1

3.3

78.3

77.4

70.2

71.2

75.8

74.5

4.4

74.5

77.1

72.2

75.2

74.1

78.5

3.0

50

80.2

82.1

85.3

82.6

84.2

87.5

3.1

78.6

78.4

80.5

79.3

74.5

75.8

2.9

78.2

77.4

70.1

79.5

80.3

81.4

5.2

78.5

74.6

72.3

78.6

82.3

83.4

5.5

80.5

81.2

82.6

83.5

88.4

79.6

3.8

82.3

85.3

84.1

82.0

86.1

78.6

3.3

80.2

88.2

81.4

87.5

85.2

80.1

4.4

77.6

78.5

80.2

83.2

80.3

81.2

2.5

80.2

88.2

81.4

85.7

89.6

81.1

4.8

表3方法最低检出限和定量限添加回收结果

4、准确度、重现性和方法的适用性

选择空白饲料为测试对象，进行加标回收率试验。

在1g空白饲料中分别加入适宜体积的香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、乙基麦芽酚、大茴香脑混合标准工作溶液，使其添加浓度为20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg，进行加标回收试验，同一浓度做6次平行试验。

结果见表4～表12。

试验结果表明：

在添加上述6个不同浓度，其回收率为70.1-117.5%，重复性RSD最大的为11.4%。

说明该方法有较高的准确性和重现性。

为考察本方法的适用性，我们从市场上收集了5生产厂家的5种代表性饲料样品，添加20mg/kg、50mg/kg，平行测定6次，回收率均在70.6%-99.6%之间，结果见表13,。

从结果可以看出，不同的生产厂家、不同成分的饲料均可用该方法检测其香味剂含量。

通过以上试验，也表明了该方法适用的范围为饲料。

5方法重复性

根据添加回收试验表3～表10的结果，不同的饲料样品，在同一添加浓度时，6次检测结果的RSD%均小于20%；不同实验室间的方法重复性应小于20%。

6稳定性试验

为了考察香兰素、乙基香兰素、肉桂醛、桃醛、乙酸异戊酯、γ—壬内酯、肉桂酸甲酯、乙基麦芽酚、大茴香脑标准储备溶液和标准中间溶液的稳定性，在首次配制好储备溶液和中间溶液后放置于2℃～8℃冷藏密封保存，每隔一个月测定一次，对比其相同浓度峰面积的大小。

试验表明：

储备溶液的峰面积基本无变化，中间溶液在1个月以后有所降低。

因此，将贮备溶液的保存期定为2℃～8℃冷藏密封保存，有效期为3个月；中间溶液2℃～8℃冷藏密封保存，有效期为1个月。

添加浓度20mg/kg

添加浓度50mg/kg

添加浓度100mg/kg

添加浓度200mg/kg

添加浓度500mg/kg

添加浓度1000mg/kg

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

78.5

74.2

77.2

72.9

78.6

79.1

76.8

3.3

80.2

88.2

81.4

87.5

85.2

80.1

83.8

4.4

89.2

88.7

85.5

90.5

91.7

92.5

89.7

2.8

89.5

90.5

78.6

93.2

90.5

95.6

89.6

6.5

98.7

100.3

93.5

93.4

85.6

87.5

93.2

6.3.

93.6

97.3

98.2

99.6

90.1

99.4

91

96.4

3.9

表4香兰素添加回收试验结果

添加浓度20mg/kg

添加浓度50mg/kg

添加浓度100mg/kg

添加浓度200mg/kg

添加浓度500mg/kg

添加浓度1000mg/kg

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

78.3

77.4

70.2

71.2

75.8

74.5

74.6

4.4

77.6

78.5

80.2

83.2

80.3

81.2

80.2

2.5

80.5

88.2

80.1

81.4

88.5

85.3

84.0

4.6

88.9

90.4

91.3

95.2

97.5

99.6

93.8

4.6

98.9

103.2

101.2

87.6

90.5

99.5

96.8

6.5

105.5

104.5

110.5

109.6

100.2

93.4

104.0

6.1

表5乙基香兰素添加回收试验结果

添加浓度20mg/kg

添加浓度50mg/kg

添加浓度100mg/kg

添加浓度200mg/kg

添加浓度500mg/kg

添加浓度1000mg/kg

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

82.1

80.4

78.9

75.3

74.2

77.5

78.1

3.8

78.2

77.4

70.1

79.5

80.3

81.4

77.8

5.2

80.2

81.2

81.5

87.5

78.8

79.5

81.4

3.8

85.4

87.6

82.5

88.7

85.6

81.0

85.1

3.4

90.3

89.6

93.2

97.0

99.5

89.5

93.2

4.5

100.2

99.6

105.3

107.5

110.5

105.4

104.8

4.0

表6肉桂醛添加回收试验结果

添加浓度20mg/kg

添加浓度50mg/kg

添加浓度100mg/kg

添加浓度200mg/kg

添加浓度500mg/kg

添加浓度1000mg/kg

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

74.5

77.1

72.2

75.2

74.1

78.5

75.3

3.0

80.2

88.2

81.4

85.7

89.6

81.1

84.4

4.8

85.6

84.7

83.2

89.7

85.1

80.4

84.8

3.6

89.6

92.3

96.5

97.4

87.2

85.1

91.4

5.4

90.3

93.6

92.5

98.3

99.8

100.5

95.8

4.4

100.5

102.5

117.5

108.9

104.5

115.4

108.2

6.4

表7桃醛添加回收试验结果

添加浓度20mg/kg

添加浓度50mg/kg

添加浓度100mg/kg

添加浓度200mg/kg

添加浓度500mg/kg

添加浓度1000mg/kg

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

78.5

74.2

71.0

77.5

70.2

78.6

75.0

5.0

80.2

82.1

85.3

82.6

84.2

87.5

83.6

3.1

78.2

85.6

84.3

90.3

97.3

85.6

96.9

7.4

78.3

96.3

85.9

100.3

105.2

84.2

91.7

11.4

105.6

110.4

117.5

102.6

104.5

111.0

108.6

5.0

109．8

112.4

112.0

103．8

113．0

115．0

111.0

3.5

表8乙酸异戊酯添加回收试验结果

添加浓度20mg/kg

添加浓度50mg/kg

添加浓度100mg/kg

添加浓度200mg/kg

添加浓度500mg/kg

添加浓度1000mg/kg

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%

回收率

%

平均值

%

RSD

%