记忆障碍动物模型的制作及方法.docx
《记忆障碍动物模型的制作及方法.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《记忆障碍动物模型的制作及方法.docx(8页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![记忆障碍动物模型的制作及方法.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2023-2/2/96e44a7a-8654-4731-ad48-576482b1a70c/96e44a7a-8654-4731-ad48-576482b1a70c1.gif)
记忆障碍动物模型的制作及方法
记忆障碍动物模型的制作及方法
引起动物的记忆障碍有多种方法,包括电休克、缺血缺氧、某些化学药品等。
对记忆障碍的测定则采用学习记忆的实验方法。
在此先介绍常用的学习记忆实验法。
1 学习、记忆实验法(learnandmemorytest)
人们和动物的精神活动、心理状态都是无法直接观察到的。
为了研究这些活动的发生过程,科学家们只能根据可观察到的刺激反应进行推测。
对脑内记忆过程的研究只能从人类或动物学习或执行某项任务后间隔时间,测量他们的操作成绩或反应时间,由此来衡量这些过程的编码形式、储存量、保持时间以及它们所依赖的条件等。
学习、记忆实验方法的基础是条件反射,各种各样的方法均由此衍生而来。
现简介常用的动物学习、记忆实验方法。
1.1 跳台法(stepdowntest)
(1)实验方法 大鼠和小鼠跳台法均较常用。
实验装置为1只长方形实验箱,箱内用黑色塑料板分隔成独立的5个小间,每个小间的规格为12cm×12cm×20cm(小鼠)或23cm×25cm×40cm(大鼠)。
反射箱底部是间距为1cm的铜栅,可以通电,电压强度可由一变压器调控,一般采用40V电压。
每间内有一可自由移动的、高和直径均为4.5cm的平台(小鼠)或高为5cm、直径为8cm(大鼠),一般置于左后或右后角。
将动物放入反射箱内适应环境3min,然后予以通电。
动物受到电击后,其正常反应是寻找躲避伤害性刺激的可能,因此很快会跳上平台。
多数动物可能再次或多次跳至铜栅上,受到电击后又迅速跳回平台,如此训练5min,记录仪将记录每鼠受到电击的次数或叫错误次数,以此作为学习成绩。
24h后重作测试:
将小鼠放在平台上,然后予以通电,动物自平台跳至铜栅上的时间为次跳下平台的潜伏期,此即记忆保持测验。
记录受电击的动物数、每鼠次跳下平台的潜伏期和3min内的错误总次数。
(2)模型特点和比较医学 该模型属回避性条件反射实验,本法简便易行,一次可同时测试5只动物。
既可观察药物对记忆过程的影响,也可观察对学习的影响,敏感性较高,适合对药物的初筛。
缺点是动物的回避性反应差异较大,可采取对动物进行预选的方法以减少差异性。
跳台法在电击前如果施以条件刺激,则可同时观察被动和主动回避性反应。
1.2 避暗法(stepthroughtest)
(1)实验方法 此法是利用鼠类的嗜暗习性而设计的,常用动物为小鼠。
实验装置包括明、暗两室。
小鼠明室大小为11cm×3.2cm,其上方约20cm处有1盏白炽灯照明,暗室大小为17cm×3.2cm。
两室之间隔板底部有1个直径为3cm的圆洞。
两室底部均为铜栅,暗室内的铜栅可以通电。
电压强度可由一变压器调控,一般采用40V电压。
暗室与一计时、计数器相连,可自动记录动物由明室进入暗室的潜伏期和进入暗室的次数。
实验时将小鼠背朝洞口放入明室,同时启动计时、计数器。
动物穿过洞口进入暗室即受到电击,此即小鼠次由明室进入暗室遇到电击所需的时间(潜伏期),取出小鼠。
24h后再次测试,记录动物进入暗室的潜伏期、5min内的电击次数和受电击的动物数。
(2)模型特点 该模型也属于回避性条件反射实验,实验方法简便易行,以潜伏期作为指标,其准确度高于跳台法,对记忆过程特别是记忆再现有较高的敏感性。
大量研究资料显示,小鼠的平均潜伏期约十几秒,训练期接受一次电击后,记忆的保持可持续l周之久。
1.3 迷津(maze)
迷津的种类和装置繁多,但不外乎由3个基本部分组成:
起步区、跑道或称路径、目标区(放置食物或安全区)。
动物由起步区开始训练,经过复杂的路径寻找过程,终到达目标区。
正常动物经过训练,可很快到达目标区。
而记忆障碍动物,此过程明显长于正常对照的动物。
迷津包括Y型迷路、水迷路和Morris迷津。
1.Y型迷路(Y-maze)
(1)实验装置 该装置一般分成三等份,分别称之为Ⅰ臂(中间臂,为起步区)、Ⅱ臂(右侧臂,为电击区,与电刺激器相连)、Ⅲ臂(左侧,为安全区)。
(2)实验动物 健康小鼠,体重为20~22g。
(3)实验方法 在此介绍两种训练方法。
种:
将动物放入起步区,操纵电击控制器训练小鼠遭遇电击时直接逃避至左侧安全区为正确反应,反之为错误反应。
训练方法有以下三种:
①固定训练10~15次,记录正确和错误反应的次数。
②动物在连续获得二次正确反应前所需的电击次数。
③动物的学习成绩达到9/10次正确反应前所需的电击次数。
24h后测验动物的记忆成绩。
此法简单、属一次性训练的空间辨别反应试验。
第二种:
按上述方法训练完成后,将Ⅱ臂改为起步区,动物在遭遇电击后直接逃至T臂(左侧)为正确反应,逃至Ⅲ臂(右侧)则为错误反应。
训练达到要求后,再将Ⅲ臂改为起步区,动物于电击后逃至左侧(Ⅱ臂)为正确反应,逃至右侧(Ⅰ臂)为错误反应。
以动物在三臂训练均达到规定标准所需电击次数的总和作为学习成绩。
24h或48h后测定动物的记忆成绩。
(4)注意事项 ①如果在目标区放置食物,则动物于实验前需禁食,以使其体重减至原体重的85%,这样动物才具有摄食的驱动力。
②在目标区停留的时间不能太短暂,否则失去强化效果。
③每天训练结束后需清洗实验箱,以消除动物留下的气味。
④每天训练次数以10~15次为宜。
2.水迷路(watermaze)
水迷路的种类很多,在此介绍一种较复杂的水迷路。
如图13-1所示:
S为起步区,F为目标区。
在目标区有一爬梯,动物可爬出水面而获得休息。
此爬梯可移至图13-1B中的“1”和“2”的位置,分别是指训练第1日和第2日爬梯放置的位置,即为第1日训练动物游至1处,第2日训练动物游至2处。
现已有中国医学科学院药物研究所制造的“水迷宫程序自动控制仪”供选用。
3.莫里斯水迷津(Morriswatermazetest)
20世纪80年代初,英国心理学家Morris等利用大鼠在盛有水和牛奶混悬的不透明的水池中搜寻目标物的方法,研究大鼠的海马等脑区受到损害后的学习、记忆能力的变化,取得了令人瞩目的结果。
这种装置可观察并记录动物入水后搜寻目标所需时间、采用的策略和它们的运动轨迹,有助于分析和推断动物的学习、记忆、空间定向以及认知功能等方面的能力。
现已较广泛采用,称之为莫里斯水迷津法。
(1)实验装置 该实验装置由黑色塑料圆桶、摄像头、视频采集卡、视频分析软件和计算机等构成。
用于大鼠实验:
圆桶直径为160cm、高为45cm、水池的水深为40cm;用于小鼠实验:
圆桶直径为120cm、高为40cm、水池的水深为30cm。
水池内有一站台,站台直径对小鼠实验为6cm、对大鼠实验为9cm。
在圆桶的上缘等距离地设东、南、西和北4个标记点,作为动物进水池的入水点。
以这4个入水点在水面和圆桶底部的投影点,将水面和圆桶部分分成均等的4个象限。
按实验要求,可地将站台放置于某一象限的中间(图13-2)。
(2)实验方法 实验前将圆桶灌以清水至预定的水池高度,再加入适量的黑色颜料(白色鼠)或奶粉(黑色鼠),使水池成为不透明状。
水温控制在23~25℃之间。
将站台放置在水池的预定部位,作为动物入水后搜索的目标。
站台的顶端平面应低于水面2cm,这样动物凭视觉无法辨认水池中有无站台。
实验程序如下:
1)训练方法 每只动物每天训练4次。
每天将动物按东、南、西和北4个入水点分别放入水池。
实验时,将动物头朝池壁轻轻地放入水中。
同时开启视频采集系统,此系统将采集动物自入水到找到站台后四肢爬上站台时所需要的时间,即潜伏期。
同时记录动物入水后的游泳轨迹,并分析动物在水中活动的总时间、总路程、上台前路程、潜伏期、分别在4个象限的活动时间和路程、分别在站台周围Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ区域内的活动时间和路程等多项指标。
动物爬上站台后,让动物在站台上站立10s。
若动物入水后在60s内未能找到水池中的站台或未能爬上站台,可将动物放置于站台上站立10s。
然后将动物从站台上拿下来。
休息30~60s以后,再进行下一次训练。
一般情况下,正常动物或服用促智药物的动物在经过5~6个实验日的训练后很快就学会以丨快丨佳的轨迹搜索到站台的位置。
此阶段的实验称之为定位航行实验。
2)撤台实验 第6或第7个实验日将站台撤除,并将动物从池壁的一点面朝壁轻轻放入水中。
正常动物会在站台的原来位置不断寻找,表现为穿过站台原有位置的次数明显增多以及在站台周围活动的时间明显延长。
而智力障碍的动物穿过站台原有位置的次数明显减少,或在水中呈现无目标的游泳。
此阶段的实验称之为空间探索试验。
(3)模型特点 影响该实验结果的因素很多,其中以实验环境较为重要。
实验室的设备、仪器、工作台、椅子、门窗和灯具等陈设的位置和实验操作者所站立的位置在整个实验过程中均需固定,否则会影响实验结果。
因为动物常常会利用实验室内固有的环境作为它搜索目标时的参照物。
由于莫里斯水迷津的水容量大,所以动物的排泄物和所分泌的外激素不会影响其他动物的作业成绩,这一特点优于其他的动物行为试验方法。
(4)比较医学 莫里斯水迷津法操作简便,方法可靠。
药物、神经毒素、血管性痴呆以及多种因素引起的记忆障碍动物模型,均可使动物的潜伏期延长,撤台实验时穿越原有站台位置的次数明显减少,并可引起定向障碍和运动轨迹混乱。
而有效的促智药物可使潜伏期缩短,增强动物的定向能力,从而能提前达到学会的标准。
因此,奠里斯水迷津法可用来检验神经药物对动物的学习、记忆和定向能力的影响,并可用来筛选促智药物。
2 记忆障碍动物模型
回避性条件反射方法虽已得到广泛应用,但动物经一次训练即可学会逃避电击,且很快趋于巩固,并可维持相当长一段时间。
在这种情况下观察药物改善学习记忆的作用是困难的,即使受试物有很好的药效,但由于组间差异甚小,因此也是无法通过统计学检验的。
现研究者通常采用记忆缺失的动物模型,这不但有助于评定药物的作用,还可以初步分析药物的作用机制。
(1)实验方法 完整的记忆过程包括记忆获得、巩固与再现三个阶段。
不同类型的记忆障碍模型可分别观察药物对上述三个阶段的影响。
形成记忆障碍的方法很多,主要有:
电休克,脑部缺血、缺氧,某些化学药品,应激,剥夺睡眠,老年动物以及有遗传缺陷的动物等。
下面分别介绍记忆获得障碍、记忆巩固障碍和记忆再现缺失动物模型的形成方法。
1)记忆获得障碍 抗胆碱能药物影响记忆的机制比较清楚,结果且易于重复,并且无明显非特异性作用,用此类药物来造成记忆获得障碍模型是较为理想的,因此在国内外得到广泛采用。
常用的抗胆碱药物是东莨菪碱,其次为樟柳碱。
于训练前30min经腹腔注射给药一次,剂量为2~4mg/kg体重,可显著破坏动物学习和记忆的获得。
利血平、戊丨巴丨比丨妥丨钠、氯丙嚓、利丨眠丨宁等中枢抑制剂均可明显抑制记忆的获得。
2)记忆巩固障碍 常用的方法有电休克,缺氧和给予蛋白质合成抑制剂等。
①电休克:
动物训练结束后立即将电极接于其头部和鼻部,给予一强度为7mA的电流刺激,持续1s,24h后重作测验,动物的记忆将不再保持。
②缺氧:
造成缺氧的方法有以下几种:
训练后立即将小鼠置于密闭的罐子里,通以96.2%N2和3.8%O2的混合气体,直至动物倒地意识丧失时为止;给动物吸入纯CO2;皮下注射NaNO2(120mg/kg体重)。
这些方法均可破坏记忆的巩固。
③蛋白质合成抑制剂;常用的药物有环己酰亚胺、氯霉素、茴香霉素等。
其中以环己酰亚胺的作用易于重复,结果可靠。
用药剂量为120mg/kg体重,于训练后立即或训练*min腹腔注射一次,即可破坏记忆的巩固。
3)记忆再现缺失 经训练的小鼠于重测前30min经腹腔注射40%~45%乙醇(0.1ml/10g体重),可明显干扰记忆的再现。
乙醇价廉易得,结果稳定,易于重复,对中枢和一般运动功能无明显影响。
但其影响记忆的机制还不清楚。
(2)给药方案 采用不同的给药方案和不同类型的记忆障碍模型,可分别观察药物对学习效应和记忆不同阶段的影响,从而可更地了解受试药物作用的性质和特点。
可采取训练前、训练后以及重测前给药的方法。
训练前给药:
于训练前几天给药可观察药物对长期学习效应的影响;训练前数分钟内给药可观察药物对学习成绩和记忆获得的影响。
训练后给药:
于训练后立即或短时间内给药可观察药物对记忆巩固作用的影响,训练后几天继续给药可观察药物对记忆保持的作用。
重测前给药:
经过训练,动物于重测前数分钟内给药可观察药物对记忆再现的影响。
但上述给药方案不是的。
有些学习、记忆实验,动物需经过多次或多天训练才能学会执行某一操作(如莫里斯水迷津)。
因此,药物的效果很可能是对学习、记忆获得和记忆保持的综合作用结果。
(3)注意事项 学习、记忆试验应在隔音室或半隔音室内进行,实验时要保持环境安静,室内温度、湿度和光照度应适宜并保持一致;实验前数天将动物移至实验室以适应周围环境;实验者需每天接触动物如喂水、喂食和抚摸动物,实验应选择适宜时间进行,每天的实验要在同一时间内完成。
(4)结果评价 一个药物是否有效,至少要满足以下几个条件:
①结果经得起重复。
②药物有量一效关系或其作用规律。
③在不同类型实验方法和不同类型动物模型中均显示效果,并且在作用性质和方向上相吻合。
对于实验结果需进行综合分析。
因为药物往往具有多方面的作用,有的作用易化记忆过程,而有的作用则阻抑记忆过程;或在给药后不同时间分别产生不同的作用,以致在某一时间内出现记忆改善,而在随后的某一时间内记忆减弱;并且同一药物在脑的不同部位可产生不同的作用。
另外,某些药物在动物种属产生阳性结果,而在另一些动物种属则无效,这些都是应该在分析实验结果时需要综合考虑到的因素。