附7禽流感实验室检测技术方案.docx
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附7禽流感实验室检测技术方案
附7禽流感实验室检测技术方案
一、实验室网络设置
实验室网络由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心和省级流感实验室两级组成。
二、实验室条件及生物安全操作的要求
1．省级流感实验室实验条件及生物安全的操作要求
（1）实验生物安全要求：
安全Ⅱ级+（BSL-2级+）或安全Ⅲ级（BSL-3级）。
（2）特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测、血清学检测顶用到的血凝抑制实验（HI）可以在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室里操作。
（3）特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测在安全Ⅱ级+（BSL-2级+）实验室的生物安全柜里提取病毒的核酸，进行病毒核酸检测的实验室要求请参照国家有关核酸检测要求的规定。
（4）微量中和实验、特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测阳性的采样标本的病毒分离、尸检标本的检测必需在安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。
（5）省级流感实验室实验条件：
具有进行禽流感相关临床标本初筛所需的生物安全柜、离心机、PCR仪、电泳仪、紫外线检测仪等配套设备。
2．国家流感中心
实验生物安全要求：
生物安全Ⅱ级+（BSL-2级+）和生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室。
3．省级流感实验室职责
（1）禽流感标本特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测；
（2）禽流感H5的血清学检测工作;
（3）特异性H5的RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离必需在生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室；
（4）没有生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室的，将标本送国家流感中心做病毒的分离工作。
4．国家流感中心实验室职责
（1）国家流感中心设立在中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感室；
（2）对各省报告的禽流感疑似病例或确诊病例进行复核、确认；
（3）对不具有禽流感病毒分离条件的省份送检标本的检测、分离和确认；
（4）对需要做微量中和实验的血清标本进行微量中和实验；
（5）对各省级实验室检测人员的培训；
（6）对各省级流感实验室的质量控制。
三、原始标本收集
1．标本收集人员
医疗机构的医生、护士或本地疾病预防控制中心专业人员负责标本收集并填写标本记录表，标本收集人员依照《禽流感职业暴露人员防护指导原则》做好个人防护。
2．标本收集种类和时限
（1）收集标本的种类：
疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液、血清和死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物。
（2） 收集标本时间：
1）咽、鼻拭子或含漱液在发病的头3天收集；
2）急性期血清在发病后7天内收集，恢复期血清在发病后2-4周收集；
3）尸检标本尸检时收集。
3．标本的输送：
所有收集的标本应在医院收集时当即分装，一式二份，其中一份单独保留，以备复核。
收集的标本若不能在24小时内送达，则应尽快在－70℃以下保留。
无－70℃条件的需在－20℃冰箱短时间暂存，并尽快联系递送标本。
4．标本收集的方式：
详见国标《流行性伤风诊断标准及处置原则》
四、送流感中心的标本包装、输送与接收
1．标本的包装
（1）标本必需放在大小适合的带螺旋盖内有橡胶圈的塑料管里，拧紧。
（2）将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋内密封；每袋装一份标本。
（3）直接在塑料管上用油性记号笔写明样本的种类、采样时间、编号、姓名，同时也将标本有关信息填在禽流动人体标本送检记录表，连同塑料管用另一塑料袋密封。
（4）将装标本的密封袋放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水缓和冲能力的材料。
同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一个塑料袋内再次做密封。
若将进行病毒分离，可将密封好的装有标本的容器直接放入液氮运输罐内运输。
所有容器必需印有生物危险标识。
2．标本输送
（1）航空或铁路输送。
（2）专人专车输送：
主要用于近距离样品输送。
3．标本的接收
（1）各省级中心实验室应发布标本接收联系方式，并实行24小时标本接收制；
（2）国家实验室标本接收：
需送国家流感中心实验室检测的原始标本、病毒分离物、可疑阳性标本、血清等，填写标本送检记录表，在低温保留条件下，于24小时内送至中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所流感中心进行复核。
国家流感中心标本接收联系方式为：
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，地址：
北京市宣武区迎新街100号，联系人：
郭元吉、王敏，联系电话：
0，0，传真：
（010）。
五、标本检测方式
1．禽H5病毒核酸检测：
材料：
疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。
方式：
RT-PCR，用于禽H5亚型流感病毒的快速检测、测序及排除工作
试剂：
特异性H5及甲型流感病毒的引物、病毒RNA提取试剂盒、逆转录酶、TaqDNA聚合酶等试剂,建议利用德国QIAGEN的RneasyMiniKit（病毒核酸提取）和QIAquickGelExtractionKit（PCR产物纯化）产品。
2．病毒分离及鉴定：
材料:
疑似禽流感患者的咽、鼻拭子或含漱液，死亡病例的尸检肺组织、气管分泌物等。
方式：
采用鸡胚和MDCK细胞分离方式，血凝及血凝抑制实验（HAI）具体方式详见国标《流行性伤风诊断标准及处置原则》。
经特异性H5RT-PCR病毒核酸检测阳性标本的病毒分离及鉴定工作必需在安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。
试剂：
鸡胚接种采用SPF鸡胚，MDCK细胞等。
3．疑似病例的血清学检测：
材料：
疑似病例的急性期和恢复期的双份血清
方式：
血凝抑制实验具体方式详见国标《流行性伤风诊断标准及处置原则》。
试剂：
H5灭活病毒。
4．微量中和实验
材料：
疑似病例的急性期和恢复期的双份血清
试剂：
H5活病毒，必需在生物安全Ⅲ级（BSL-3级）实验室里操作。
六、检测结果的确认
以下情况的原始标本及分离物送国家流感中心检测、复核、确认。
1．标本分离物血凝实验（HA）阳性，同时H5血凝抑制实验（HI）阴性，H5的RT-PCR检测阳性。
2．标本分离物血凝实验（HA）阳性，同时H5血凝抑制实验（HI）阳性或H5的RT-PCR检测阳性。
3．标本分离物血凝实验（HA）阳性，同时H5的RT-PCR检测阳性。
4．病人恢复期血清比急性期血清的H5抗体有4倍或以上增高。
5．标本分离物血凝实验（HA）阳性，H5血凝抑制实验阴性，并已排除是当前流行的甲、乙型毒株的可能。
七、检测结果报告
一般情况下,实验室收到的样本当即进行实验，并于收到标本后24小时内出具RT-PCR检测报告，3-5天出具病毒分离培育结果，于分离到病毒后的3-5天出具流感病毒的血凝抑制结果，微量中和实验须3-5天完成。
当实验进程中出现不可预测情况或意外事件，影响了按时出具报告时，应及时报告和说明。
附件
ICS
GB
中华人民共和国国家标准
GB
流行性伤风诊断标准及处置原则
Diagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza
（报批稿）
发布实施
国家质量技术监督局发布
目 次
前言――――――――――――――――――――――――――――――――3
1范围―――――――――――――――――――――――――――――――4
2诊断原则―――――――――――――――――――――――――――――4
3诊断标准―――――――――――――――――――――――――――――4
4处置原则―――――――――――――――――――――――――――――5
附录A（规范附录）病原学诊断方式―――――――――――――――――5
附录B（规范附录）血清学诊断方式―――――――――――――――――7
附录C（资料附录）红细胞凝集抑制实验―――――――――――――――8
附录D（资料附录）神经氨酸酶活性抑制实验――――――――――――――12
附录E（资料附录）对流免疫电泳及琼脂凝胶沉淀实验―――――――――16
附录F（资料附录）流感快速诊断方式――――――――――――――――19
GB
前言
流行性伤风（简称流感）为一种人、禽、畜共患的病毒性急性传染病。
流感病毒按照其核蛋白（NP）和M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲、乙、丙三型。
甲型流感病毒常以流行形式出现，能引发世界性流感大流行，它在动物中普遍散布，并也能在动物中引发流感流行和造成大量动物死亡。
乙型流感病毒能引发流感局部暴发，不会造成世界性流感大流行，至今除在人之外还能在海豹中分离到它。
丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引发流感流行，它也能感染猪。
流感常突然发生，迅速蔓延，波及面广，发病率和死亡率均高但病死率低。
至今仍严重要挟着人的身心健康，乃至夺走性命，常给国民经济带来庞大损失，我国被世界公以为是流感的多发地。
受卫生部传染病防治监督管理办公室委托，由郭元吉同志负责对流行性伤风诊断标准及处置原则GB15944-1995进行修改，其目的：
把过时的，不适用的删除，加入适用新的内容。
具体修改的地方如下：
1．前言中强调了流感为一种人、禽、畜共患病，同时考虑到禽流感病毒在人群中可引发的流感，其传播途径不清楚，故把传播途径删除。
2．诊断原则中增加了或从患者收集的标本中查到病毒颗粒特异的蛋白或特异核酸成份。
3．实验室诊断中去掉白细胞计数指标，因该指标不能做为流感的实验诊断依据。
4．附录A。
病毒分离中，因甲型流感病毒“O”相特性的出现，故强调了细胞系统分离病毒的重要性；在HA测定中不该用鸡红细胞，而应用豚鼠或人的红细胞。
5．把B3神经氨酸酶抑制实验改成附录D。
把B3中不规范的一概改成现今国际上统一利用的方式。
6．删除B2已过时，操作复杂，易受实验条件影响的“型特异性补体结合实验，改成附录E“对流免疫电泳”，同时考虑到对禽血清抗体测按时，常常利用琼脂凝胶沉淀实验。
因此，在附录E中也加入后者的内容。
7．快速诊断为附录C改成附录F。
同时加入FLUOIAKit和RT-PCR法。
本标准的附录A和B是规范的附录。
本标准的附录C-F是资料的附录。
本标准由中华人民共和国卫生部提出。
本标准起草单位：
中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
本标准主要修订人：
郭元吉
本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部传染病防治监督管理办公室负责解释。
中华人民共和国国家标准
流行性伤风诊断标准及处置原则GB
Diagnosticcriteriaandprinciplesofmanagementofinfluenza
1 范围
本标准规定了流感的诊断标准及处置原则。
本标准适用于各级医疗、卫生、保健机构和人员。
对流感的诊断，报告和处置的应用。
2 诊断原则
流感流行时一般可按照临床症状，结合流行病学资料可对患者作出初步诊断。
如确诊则需要病毒分离阳性或病人双份血清抗体测定，其恢复期抗体滴度较急性期增高4倍或以上，或从患者收集的标本中查到病毒粒特异的蛋白或特异核酸成份。
3 诊断标准
3．1流行病学资料
在流行季节一个单位或地域同时出现大量上呼吸道感染病人；或近期内本地域或临近地域上呼吸道感染病人明显增多；或医院门诊呼吸道感染病人明显增多；或挨家挨户上呼吸道感染患者明显增多。
3．2临床症状
3．2．1出现急起畏寒、高热、头痛、头晕、满身酸痛、乏力等中毒症状。
3．2．2可伴有咽痛、干咳、流鼻涕等症状。
3．2．3少数病例有食欲消退、伴有腹痛，腹胀、呕吐和腹泻等消化道症状。
3．3实验室诊断
3．3．1从病人鼻咽分泌物中可分离到流感病毒（见附录A）。
3．3．2患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍或以上（见附录B）。
3．3．3在患者呼吸道上皮细胞查到流感病毒颗粒特异的蛋白成份或特异的核酸（见附录F）。
3．3．4收集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，查到流感病毒粒特异的蛋白或特异的核酸（见附录F）。
3．4病例分类
3．4．1疑似病例（流感样病例）
具有腋下体温≥38℃，加上其他临床症状两项或以上，或加3、1及胃肠道症状两项或以上。
3．4．2确诊病例
疑似病例加或或或。
4. 处置原则
初期隔离病人,服抗流感病毒药物,对症医治和防并发症.
初期发现病人,初期隔离（因地制宜,当场适当隔离）病人是重要的办法.对病人医治一般采用对症疗法,发病初期（48小时内）可服用抗流感病毒药物,严重患者如严重肺炎,呼吸极度困难,高热不退等需住院医治.防治并发症主要应避免流感病毒性肺炎和细菌性肺炎,尤其对年老体衰者或伴有心血管,糖尿病,慢性呼吸道疾病者或婴幼儿等流感高危人群因他们由于流感本身或其它归并症可造成死亡,故应特别注意增强医治护理.
4．2预防办法
一般采用综合性办法，讲究卫生，注意体魄锻炼和营养，维持室内空气流通；对易动人群应采取相对隔离办法，如避免接触病人，不去公开场合等；对年老和健康状态差，尤其带有慢性病的人必要时可采用灭活疫苗接种，对疫苗过敏者或可能已被感染（如密切接触病人）者应及时服用抗流感病毒药物。
附录A
（规范附录）
病原学诊断方式
A1病毒分离
从疑似流感病人呼吸道收集标本分离病原体．
A2标本的收集
病毒分离成功与否很大程度上取决于收集标本的质量，时间（应于发病的头3天，越早越好），及其保留运输等环节。
标本主要取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次为气管和支气管分泌物，有时也采用肺活检材料等。
常常利用的采样液为：
普通肉汤，pH的Hanks氏液或Eagle氏液或水解乳蛋白液。
在采样液中需加入抗菌素，以往多用青、链霉素，近来发现很多种类细菌对它们具有耐药性，故近来多用庆大霉素（其终浓度为每ml采样液中加入ml的10mg/ml）和抗真菌素（终浓度为每ml采样液中加入ml的250ug/ml）。
A2．1标本收集方式
A2．2．1鼻拭子
将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。
以同一拭子拭双侧鼻孔。
将棉签浸入4-5ml采样液的管中，尾部弃去。
然后，塞紧或盖好管盖。
A2．2．2咽拭子
用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，一样将棉签头浸入4-5ml采样液的管中，尾部弃去，塞紧或盖好管盖。
注：
亦可将鼻、咽拭子搜集于同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。
A2．2．3鼻咽抽取物或抽取气管和支气管分泌物
用与负压泵相连的搜集器从鼻咽部抽取粘液或从气管抽取气管和支气管分泌物。
先将搜集器头部插入鼻腔或气管，接通负压，旋转搜集器头部并缓慢退出。
搜集抽取的粘液，并用采样液涮洗搜集器3次。
近来国内有效小孩导尿管接在50ml注射器上来替代搜集器。
A2．2．4漱口液
用10ml采样液漱口。
漱时让患者头部微后仰，发噢声，让洗液在咽部转动。
然后，用平皿或烧杯搜集漱液。
注：
取漱口液时，需预先了解患者是不是对抗菌素有过敏史，如有，含漱液中不该含抗菌素。
A2．2．5肺活检材料
肺活检组织在无菌条件下，用灭菌过的乳钵磨碎，用生理盐水配成20%悬液，2000rpm离心10min，取上清加入上述提到的抗菌素。
A3标本输送
标本应在≤4℃条件下，尽快送至实验室。
标本至实验室后，病毒分离标本应尽快进行接种分离，48h内能进行接种可置4℃保留，如未能接种应置≤-70℃下保留。
A4标本处置
标本至实验室后，含棉拭子的标本，先将棉拭子在管壁反复挤压后掏出。
然后用干净灭过菌的毛细吸管反复吹打搜集的溶液，以便打坏粘液。
置4℃待其自然沉淀5-10min。
注：
如采样液中尚未加抗菌素应补加上，所加的量同前，加完并混匀，置4℃1-2h后方可用于接种。
A5接种与培育
最常常利用的为细胞接种和鸡胚接种法，有条件的应两法并用。
近来由于“O”相毒株的出现，MDCK（MadinDardyCanineKidney）等一些细胞对“O”相毒株的敏感性大大超出鸡胚的敏感性。
同时“O”相毒株几乎不凝集鸡红细胞，故近来在红细胞凝集和凝集抑制实验中常常利用豚鼠或人的“O”型红细胞，而不用鸡的红细胞。
A5．1MDCK细胞接种和收获
成片的MDCK细胞弃生长液，用Hanks氏液洗两遍，将残余的牛血清洗净，每瓶加入接种标本ml，（接种量要按照瓶的大小），一般2瓶/标本，轻晃细胞瓶，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附1-2h；倒掉感染液，再用Hanks氏液洗1-2遍，每瓶加入3ml（随瓶的大小而异）维持液（不含小牛血清，而含终浓度为2ug/ml胰酶的Eagle氏溶液），置35℃培育；第二天起天天观察有无细胞病理转变（CPE）；当CPE出现+++～++++号时，即75%-100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可将细胞冻融1-2次以提高收获标本的病毒滴度。
由于CPE不能证明就是流感病毒所造成。
最后还需检查维持液中是不是有红细胞凝集活性（HA），用毛细吸管取细胞维持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人红细胞，轻摇混匀，置室温或4℃，1h后观察结果。
出现红细胞凝集的为阳性标本，收获所有的维持液进行病毒鉴定。
如收获的维持液HA滴度不高或量不够用于鉴定，需在MDCK细胞中传代，把HA滴度提高或量增加后，方可进行病毒鉴定。
如HA阴性，应在MDCK细胞上盲传一代，如HA仍阴性，可以为是阴性标本，弃之。
注：
CPE出现时间随感染病毒的型别，乃至毒株的不同和感染量的大小而异。
一般标本接种后7-10天还不出CPE，维持液中又查不出HA活性，大体上可以为阴性标本，弃之。
同时要注意MDCK细胞的代数，因随MDCK细胞代数增加，其对流感病毒的敏感性下降。
A5．2鸡胚接种和收获
取9-11日胚龄鸡胚，经羊膜腔和尿囊腔接种标本ml，每份标本接种3-4只胚，置33-35℃培育72h。
然后将鸡胚置4℃留宿（或置-20℃冰箱1h再置4℃数小时），别离收获尿囊液和羊水并检查HA活性（用毛细吸管别离取3-4滴尿囊液和羊水，别离置大孔塑料板不同孔内，再加入3-4滴1%豚鼠或人红细胞，摇匀后置室温或4℃1h后观察结果。
如HA为+++～++++时，再按系列倍比稀释测定HA滴度，如具有必然的HA滴度即可进行病毒鉴定。
如HA阴性，可盲传一代，如HA仍为阴性则弃之。
A6病毒鉴定
至今对流感病毒鉴定最常常利用的方式为红细胞凝集抑制（HI）测定，因该法简便易行，结果可信（具体方式见附录C）。
其次为神经氨酸酶活性抑制（NI）测定（具体方式见附录D）。
进行型鉴按时常常利用对流免疫电泳（具体方式见附录E）。
附录B
（规范附录）
血清学诊断方式
B1血清标本收集
血清标本应包括急性期和恢复期双份血清。
急性期血样应及早收集，一般不晚于发病后7天。
恢复期血样则在发病后2-4周收集。
单份血清一般不能用作诊断。
血液标本2000-2500rpm离心15min。
搜集血清，弃血凝块。
B2血清标本输送和保留
血清标本在4℃下输送，置≤-20℃下长期保留。
B3抗体测定
测定用抗原一般为当前人群中流行的H3N2和H1N1亚型及乙型流感病毒。
测定方式为HI法（见附录C）。
B4结果判断
凡恢复期血清抗体滴度比急性期增高≥4倍为阳性结果，其余的均为阴性结果。
附录C
（资料附录）
红细胞凝集抑制实验
C1原理
流感病毒粒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构，能够与一些哺乳类动物和禽的红细胞发生凝集，这就是红细胞凝集现象。
虽然多种哺乳动物和禽类的红细胞均能被流感病毒凝集，但目前应用最广的是豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。
“O”相毒株是指只能在鸡胚羊膜腔或敏感细胞中生长，感染的羊水或细胞维持液只凝集人或豚鼠的红细胞，而几乎不凝集鸡的红细胞的流感毒株。
这种毒株在鸡胚尿囊腔适应传代后，取得了在鸡胚尿囊腔复制的能力，同时还取得了对鸡红细胞凝集能力与人及豚鼠的一样好，这种生物学特性发生改变的病毒为“D”相毒株。
流感病毒能从凝集的红细胞表面释放下来，释放下来的病毒还能凝集新的红细胞，而被凝集和释放后的红细胞不能再被相同的病毒颗粒所凝集。
于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制实验。
目前，红细胞凝集和凝集抑制实验为流感各方面工作中应用最普遍的一种技术。
C2实验器材
C2．1大孔或小孔塑料板
C2．210ml或1ml或1000ul和200ul或多排吸管
C2．3200ul和1000ul吸头
C3试剂
C3．1%无菌生理盐水
C3．2Alsever氏液
葡萄糖
柠檬酸钠g
柠檬酸g
NaCl0.42g
加蒸馏水至100ml
8磅20分钟高压灭菌，置4℃备用。
C3．31%红细胞悬液
以鸡红细胞为例：
于10或20ml注射器中先吸入约3ml阿氏液（Alsever'sSolution），然后从鸡翅静脉或心脏收集，用生理盐水洗涤3次，前2次1500r/min离心5min，最后1次同速度离心10min，弃上清，用无菌生理盐水配成1%悬液，置4℃待用。
一般置4℃能保留7天左右，一旦发生溶血应弃掉。
C3．4受体破坏酶（RDE）
C3．5免疫血清或测定血清
C4红细胞凝集实验
C4．1操作步骤
C4．1．1取一干净的大孔塑料板，标记所要测定的标本名称
C4．1．2于第一孔加入（1：
2开始稀释）或（1：
5开始稀释），从第二孔开始一概各加%生理盐水。
C4．1．3如1：
2开始稀释，于第一孔中加入病毒悬液；如1：
5开始稀释，于第一孔中加入病毒悬液。
用吸管吹打，使充分混匀，吸出至第二孔，依次类推作倍比稀释，直至最后一孔，吹打后吸出弃掉。
C4．1．4于每孔中加入生理盐水，然后再加入1%红细胞悬液。
相混后置室温或4℃30-60min，而后观察结果。
注：
如采用微量法，应用小孔塑料板和稀释枪，总量为75ul（病毒25ul，25ul生理盐水和红细胞悬液25ul），其余同常量法。
C4．2观察结果
结果以++++、+++、++、+、±和—表示之。
一层红细胞均匀地铺于孔上者为++++。
大体同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。
红细胞形成一个环状，周围有小凝集块者为++。
红细胞形成一个小团，但边缘不滑腻，周围有小凝块者为+。
红细胞于孔底形成一个小团，边缘滑腻并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为—。
但用豚鼠或人“O”型红细胞时常见不到孔底形成一个小团和眼泪滴样结果出现。
“±”即为可疑，计算时以“—”（阴性）处置。
C4．3红细胞凝集滴度计算
结果以++为终点，亦即一个凝集单位。
也就是说最高稀释度病毒能引发++号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称血凝滴度。
下面以表1为例，进行计算。
表１红细胞凝集单位计算
标本号
病毒稀释度
滴度
备注
1:
10
1:
20
1:
40
1:
80
1:
160
1:
320
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