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荧光法测定维生素C

本科生毕业论文（设计）

荧光法测定片剂中抗坏血酸的含量

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院系：

化学系

专业：

化学本科

提交日期：

2010-4-28

荧光法测定片剂中抗坏血酸的含量

康玉胜

指导老师；张娜

（黄山学院化学化工系，黄山，安徽245041）

摘要：

基于维生素C本身没有荧光，苯甲酸与维生素C反应生成荧光物质的特性，建立了一种测量维生素C含量的方法。

在pH=6.0的NaOH—邻苯二甲酸氢钾的缓冲介质中，苯甲酸对维生素C促荧光明显，可在激发波长310nm，发射波长410nm处测其产物的荧光强度.Vc浓度在0-3.5×10-5g/mL范围内其荧光强度呈良好线性关系，检测限较低，相关系数为0.988.利用本法进行回收实验与样品测定，结果令人满意，适应于片剂中维生素C的测定。

关键词：

荧光光度法；维生素C；苯甲酸

FluorescencespectrometryintabletsofAscorbicacid

KangYusheng

Instructor;ZhangNa

（HuangshanUniversityDepartmentofchemistryandchemicalengineering,Huangshan,Anhui245041）

Abstract:

BasedonvitaminCitselfhasnofluorescence,benzoicacidandvitaminCreactionoffluorescencematerialcharacteristics,establishesameasurevitaminccontent.AtpH=6.0ofNaOH—potassiumhydrogenphthalatebuffermedia,promotinghydroxybenzoicacidonvitaminCcanbeusedinfluorescenceobvious,excitationwavelength310nm,measuringtheemissionwavelength410nmatitsproductsoffluorescenceintensity.Vcconcentrationinthe0-3.5×10-5g/mLrangeitsfluorescenceintensityisgoodlinearrelationships,thedetectionlimitislow,thecorrelationcoefficient0.988.Usethislawtorecycleandspecimens,theresultsareatisfactory,theyaresuitableforthetabletsinthedeterminationofvitaminC.

Keywords:

fluorescencespectroscopy;vitaminC;benzoicacid

引言

维生素C是可溶于水的无色结晶，是一种分子结构最简单的维生素。

由于其防治坏血病的功能，所以在医药上常把它叫做抗坏血酸。

维生素C能保持巯基酶的活性和谷胱甘肽的还原状态，起解毒作用等。

它广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、猕猴桃、柑橘等食品中含量尤为丰富。

准确测定维生素C的含量，对饮食健康、医疗保健都具有十分重要的意义。

近年来文献报道的测定方法[1],主要有光度法[2、3]电化学法[4]、滴定法[5]、酶法[6]、色谱法[2、7]等。

Deutsch和Weeks曾经报道过一种检测维生素C的荧光分析法（OPDA），并被指定为维生素C的经典荧光分析法[9]。

在该方法中，维生素C先被活性炭（Norit）氧化为脱氢抗坏血酸（DHAA），DHAA再与荧光底物邻苯二胺（OPDA）结合生成荧光产物，通过对该荧光产物的检测实现对维生素C的定量分析[8]。

邻苯二胺本身有很强的荧光，而且过量的活性炭会吸附一定量的维生素C，所以有人提出了一种新的测定维生素C的荧光分析方法[10、11]。

基于维生素C被Cu2+氧化为DHAA，DHAA进一步与苯甲酸及十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作用[9]，通过对体系荧光强度的测定进行维生素C的定量分析。

该方法所涉及的体系稳定性好，但需要进行加热，且反应时间较长。

本文的基本思路是，在以上实验的基础上，尝试探索和寻找一种效果更好的氧化剂氧化抗坏血酸。

实验结果表明，在不外加氧化剂的条件下，苯甲酸与Vc在特定的酸度条件下可反应生成一种较强的荧光物质，其荧光强度与Vc的浓度成正比，据此建立了新的荧光测定Vc的方法。

与经典的Deutsch荧光方法相比，反应底物荧光较弱，降低了背景干扰，与孙振艳荧光方法相比，本反应不需外加氧化剂，且反应时间较短，反应条件控制较容易。

其原理可以表示如下图：

1.实验部分

1.1仪器

荧光分光光度计（日立F-4500，天津天美科技有限公司），分析天平（AL104，北京赛多利斯天平有限公司）

1.2试剂

邻苯二胺（1,2-diaminobenzene，江阴市华亚化工有限公司）：

4.0×10-4g/mL

水杨酸（2-Hydroxybenzoicacid，宜兴市辉煌试剂厂）：

4.0×10-4g/mL

苯甲酸溶液（Benzoicacid，BA，国药集团试剂有限公司）：

1.0×10-4g/mL

硫酸高铁氨溶液（Ammoniumiron，国药集团试剂有限公司）:

2.0×10-3g/mL

维生素C（vitaminC，国药集团试剂有限公司）：

准确称取0.0500克，配制到100ml容量瓶，可制得5.0×10-4g/mL的储备液（避光密封2到8°C）。

维生素C工作液：

1.0×10-5g/mL，使用时用去离子水由储备液逐级稀释。

氢氧化钠（SodiumHydrate，）：

0.2mol/L

硼酸（BoricAcid，国药集团试剂有限公司）：

0.2mol/L

磷酸二氢钾（potassiumdihydrogenphosphate;monopotassiumphosphate，上海试剂有限公司）：

0.2mol/L

磷酸二氢钠（sodiumdihydrgenphosphate，江苏太仓化工厂）：

0.2mol/L

氯化钾（PotassiumChloride，中国上海试剂一厂）：

0.2mol/L

盐酸（hydrochloricacid，中国宿州化学试剂有限公司）：

0.2mol/L

邻苯二甲酸氢钾（potassiumacidphthalate，汕头市西陇化工厂有限公司）：

0.2mol/L

无水乙醇（absolutealcohol;anhydrousethanol上海展云化工有限公司）

硼砂（四硼酸钠）（sodiumtetraborate，中国云岭化工厂）：

0.2mol/L

Vc药片：

湖北华中药业有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1249

上海玉安药业有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1445

南京白敬宇制药有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1486

上海信谊黄河制药有限公司规格（0.1g/粒）m=0.1540

1.3实验方法

于10mL比色管中依次加入1.00mLVc工作液，2.5mLbuffer，1.5mL苯甲酸，去离子水稀释定容至刻度,测定荧光光谱。

同时在λex/λem=310nm/410nm处，测定荧光强度F。

同时测定试剂空白（2.5mLbuffer，1.5mL苯甲酸）的荧光强度F0,F1=F-F0。

2荧光底物的选择

2.1邻苯二胺

取Vc工作液（1ml）+硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+邻苯二胺（2ml）测得荧光强度F，取硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+邻苯二胺（2ml）测得荧光强度F0，测得荧光值如表1。

表1pH值对邻苯二胺体系荧光的影响

pH

1

6

8

9.2

F

374.1

1506

1477

1476

F0

67.53

1396

1585

1565

F-F0=F1

306.57

110

-108

-89

图1pH值对邻苯二胺体系荧光的影响

由图1可看出邻苯二胺本身具有较强的荧光强度，而且与Vc反应生成产物所促的荧光值很小。

2.2水杨酸

取Vc工作液（1ml）+硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+水杨酸（2ml）测得荧光值如表2。

表2pH值对水杨酸体系荧光的影响

pH

1

6

8

9.2

F

329

758

2164

1978

F0

271.1

577.3

2056

2484

F-F0=F1

57.9

180.7

108

-506

图2pH值对水杨酸体系荧光的影响

由图2可以看出，水杨酸也具有很强的荧光强度,与Vc反应所增荧光值很小。

2.3苯甲酸

取Vc工作液（1ml）+硫酸高铁铵溶液（2ml）+缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（2ml）测得荧光值如下表。

表3pH值对苯甲酸体系荧光的影响

pH

1.2

6

7.6

8.4

F

7.33

148

74.83

49.19

F0

6.273

47.98

24.85

17.64

F-F0=F1

1.057

100.02

49.98

31.55

图3pH值对苯甲酸体系荧光的影响

根据图3可以看出，苯甲酸体系荧光增强非常明显，故本文选用苯甲酸作为荧光底物进行下一步研究。

3.实验结果与讨论

3.1荧光光谱

BA用量（1ml），buffer用量（2.5ml），Vc用量（1ml）不同组合的体系荧光光谱图叠加如下图：

从图中我们可以看出，曲线4、5、6、7、8（对应苯甲酸+缓冲，缓冲，去离子水，维生素C+缓冲，维生素C）均没有荧光，曲线2、3（对应维生素C+苯甲酸，苯甲酸）有荧光但荧光强度很弱，1号荧光强度非常强，我们可以知道Vc+BA+buffer体系所促荧光最佳。

由上图可见，在苯甲酸体系中加入不同量的维生素C，体系的荧光发生有规律的增强。

从而建立了荧光光度法测定维生素C的方法。

3.2酸度的影响

取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2ml）测得荧光强度为F，取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+缓冲溶液（2ml）测得荧光强度为F0。

酸度对体系的荧光强度有很大的影响，见下表与下图。

表4pH值对体系荧光的影响

pH

F

F0

F1

1.2

7.33

6.273

1.057

2

7.974

7.866

0.108

2.8

22.92

24.83

-1.91

3.6

33.67

29.87

3.8

4.4

30.62

32.31

-1.69

5.2

79.25

14.02

65.23

6

148

47.98

100.02

6.8

69.14

35.57

33.57

7.6

74.83

24.85

49.98

8.4

49.19

17.64

31.55

图4酸度对体系的荧光强度的影响

由图可以看出，在pH=1.2～8.4之间，体系的ΔF先增大而后降低，在pH=6.0时，体系的ΔF值达到最大，故本文选择pH=6.0的0.10molL-1的缓冲体系进行进一步的研究。

3.3不同缓冲体系的影响

取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+不同体系缓冲溶液（2ml）定容测得荧光强度为F，取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+不同体系缓冲溶液（2ml），定容测得荧光强度为F0。

不同缓冲体系的荧光强度有较大的影响，见下表与下图。

表5不同缓冲体系对苯甲酸体系荧光的影响

缓冲体系

F

F0

△F

1

251.4

70.4

181

2

214.2

71.11

143.09

3

126.7

37.56

89.14

4

437.9

96.55

341.35

5

822.2

152.9

669.3

图5不同缓冲体系对苯甲酸体系荧光的影响

1.磷酸二氢钾—NaOH2.柠檬酸钠—NaOH3.乙酸—乙酸钠

4.磷酸二氢钾—硼砂5.NaOH—邻苯二甲酸氢钾

由图可以看出，当缓冲体系为NaOH—邻苯二甲酸氢钾时，体系的ΔF值达到最大，故本文选择pH=6.0的NaOH—邻苯二甲酸氢钾缓冲体系进行进一步的研究。

3.4缓冲体系体积的影响

取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液不同体积定容测得荧光强度为F，取硫酸高铁铵（1ml）+苯甲酸（2ml）+缓冲溶液不同体积定容测得荧光强度为F0。

缓冲体积对体系的荧光强度也有一定影响，见下表与下图。

表6pH值对苯甲酸体系荧光的影响

V（缓冲溶液）

F

F0

△F

0

7.7

6.339

1.361

0.5

142

90.38

51.62

1

200.2

130.5

69.7

1.5

230.8

142.8

88

2

255.2

156.6

98.6

2.5

255

160.8

94.2

3

257.4

158.7

98.7

3.5

258.7

153.1

105.6

4

267.1

171.4

95.7

5

266.3

168.5

97.8

图6pH值对苯甲酸体系荧光的影响

由图可以看出，当缓冲溶液用量为2.5ml时，体系的ΔF值达到最大且保持稳定，故本文选择pH=6.0的NaOH—邻苯二甲酸氢钾2.5ml缓冲溶液进行进一步的研究。

3.5Fe3+用量的影响

苯甲酸（2ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2ml）分别加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mlFe3+溶液，定容测得荧光强度F，苯甲酸（2ml）+缓冲溶液（2ml）分别加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mlFe3+溶液，定容测得荧光强度F0。

表7氧化剂Fe3+用量对体系荧光强度的影响

V

F

F0

△F

0

2310

528.6

1781.4

0.5

1468

579

889

1

658.4

324.9

333.5

1.5

324.7

141.2

183.5

2

134.7

82.94

51.76

2.5

62.64

44.31

18.33

3

18.6

22.67

-4.07

图7氧化剂Fe3+用量对体系荧光强度的影响

由图可以看出，不添加铁离子时，体系荧光增强数值△F最大，所促荧光强度更强一些，效果更佳。

3.6加入顺序的影响

苯甲酸（BA）1.5ml，缓冲（bf）2.5ml，工作液Vc（Vc）1.0ml

试验了不同的加入顺序对体系的荧光强度的影响，结果见下表。

表8不同加入顺序对体系荧光强度的影响

顺序X

F

F0

△F

1.BA+VC+bf

675.1

240.1

435

2.BA+bf+Vc

713.9

203.7

510.2

3.bf+BA+Vc

594.5

394

200.5

4.bf+Vc+BA

733

188.2

544.8

5.VC+BA+bf

701.1

185.5

515.6

6.VC+bf+BA

813.3

179.2

634.1

图8不同加入顺序对体系荧光强度的影响

由图8可以看出，试剂的加入顺序对该体系的荧光强度有一定影响。

本文选择按6的顺序加入。

即先加入Vc，然后是缓冲溶液，最后加入BA为最佳条件。

3.7时间的影响

取Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（2ml）定容测得荧光强度为F，取缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（2ml）定容测得荧光强度为F0。

表9反应时间对体系荧光强度的影响

t/min

F

F0

△F

3

383

93.05

289.95

5

452.7

105.3

347.4

10

579.6

135.3

444.3

15

676.7

154.6

522.1

20

748

195.8

552.2

25

823.7

212.7

611

30

852.7

235

617.7

35

893

251.3

641.7

40

911.3

272.8

638.5

45

939.4

292.7

646.7

50

954.2

305.9

648.3

55

985

312.2

672.8

60

999.4

337.6

661.8

65

1028

344.5

683.5

70

1034

353.1

680.9

75

1055

362.5

692.5

80

1058

382.3

675.7

90

1078

395.3

682.7

95

1073

410.8

662.2

105

1121

430.2

690.8

图9反应时间对体系荧光强度的影响

由图可以看出，反应体系的荧光增强数值△F在35min达到最大,几乎不受反应时间的影响,且至少在105分钟内ΔF基本保持不变，故本文要求在35分钟以后105分钟内完成测定。

3.8温度的影响

取Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（2ml）定容测得荧光强度为F，取缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（2ml）定容测得荧光强度为F0。

分别放在25、30、35、40温度下反应三十分钟测得荧光强度如下表

表10反应温度对体系荧光强度的影响

温度

25

35

40

50

1次F

614.9

488.8

1990

998.2

1次F0

303.5

416.8

1320

992.5

温度

25

35

40

50

2次F

585.6

2777

3481

657.6

2次F0

306.3

2434

3412

550.7

由表中数据可以看出，在高温条件下其荧光值，极其不稳定，所以本文直接在常温条件下测定最佳。

3.9苯甲酸用量的影响

取Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2.5ml）+不同体积苯甲酸，定容，测得荧光强度为F，取缓冲溶液（2ml）+不同体积苯甲酸，定容，测得荧光强度为F0

苯甲酸的用量对体系的荧光△F程度有一定影响见下表下图:

表11苯甲酸用量对体系荧光强度的影响

V（苯甲酸）

F

F0

△F

0

431.3

436.6

-5.3

0.5

579.2

178.8

400.4

1

613.5

163.8

449.7

1.5

722.6

172.5

550.1

2

619.4

158.6

460.8

2.5

594.1

173.3

420.8

3

689.4

168.8

520.6

图10苯甲酸用量对体系荧光强度的影响

由图可以看出，当苯甲酸（BA）溶液用量为1.5ml时，体系的ΔF值达到稳定，故本文选择苯甲酸（BA）溶液加入量为1.5mL进行进一步的研究。

3.10表面活性剂的影响

取活性剂溶液（0.5ml）+Vc工作液（1ml）+缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F，取活性剂溶液（0.5ml）+缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F0。

表12不同表面活性剂对体系荧光强度的影响

活性剂

F

F0

△F

3.0×10-6OP乳化剂浓度

555.8

215.3

340.5

1.5×10-4聚山梨酯-80浓度

440.3

199

241.3

CTMAB

570.5

239

331.5

空白

439.1

189.7

249.4

图11不同表面活性剂对体系荧光强度的影响

图12OP乳化剂的发射光谱图

由图可以看出，活性剂1与4相比较虽然ΔF较大，但是OP本身荧光值很大高达1088，活性剂3虽然ΔF值比较大，但是其F0较大，活性剂2和4相比无差别，所以我们选择不添加任何表面活性剂。

3.11共存离子干扰试验

测定浓度为1.0×10-5g/mL的维生素C时较低浓度钠离子、钾离子没有干扰，而铝离子、钙离子、铁离子、卤离子、溴离子、硫酸根离子在较低浓度对荧光强度有猝灭强度。

3.12工作曲线的制备

准确称量Vc分析纯0.0522g到100ml容量瓶配得储备液，取2ml储备液到100ml容量瓶定容所得工作液浓度为1.044×10-5g/ml,取新配置的Vc工作液0.0ml、0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml，与10ml比色管中，再加缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F，缓冲溶液（2ml）+苯甲酸（1.5ml）定容测得荧光强度为F0。

V（工作液）

F

F0

△F

0

250.8

250.8

0

0.5

412.8

247.4

165.4

1

543.9

240.5

303.4

1.5

718

248.6

469.4

2

980.8

246.9

733.9

2.5

1268

249.6

1018.4

3

1544

252.4

1291.6

3.5

1880

243.8

1636.2

由上图和表可见，加入维生素C后，体系的荧光强度有规律的明显增强，线性关系良好。

线性方程为：

Y=464.14X—109.96,R2=0.977（R=0.988）

4.样品测定结果

研磨一片Vc药片，在分析天平称取0.0010g左右粉末配置到25ml容量瓶中，下面是不同厂家药片的测定结果：

A.湖北华中药业有限公司B.上海玉安药业有限公司

C.南京白敬宇制药有限公司D.上海信谊黄河制药有限公司

药品

称量Vc一粒药片质量

理论药片Vc含量

Vc理论浓度g/ml

A

0.0010

80.06%

3.2×10-5

B

0.0015

69.20%

4.15×10-5

C

0.0018

67.29%

4.85×10-5

D

0.0017

64.94%

4.42×10-5

分别取药片溶液上清液（0.5ml）+缓冲溶液（2.5ml）+苯甲酸（1.5ml）比色管中，测得荧光值结果如下表：

A

B

F

625.3

701.6

664

819

935

998

F0

259.4

259.4

259.4

259.4

259.4

259.4

F1=F-F0

365.9

442.2

404.6

559.6

675.6

738.6

平均

404.2

657.9

C

D

F