球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾致病力相关性分析.docx
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球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾致病力相关性分析
26
（2）143-148
中国生物防治
ChineseJournalofBiologicalControl
2010年5月
球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾
致病力相关性分析
121*
陈冬虹
1
（1华南农业大学资源环境学院,广州510642;2广东省农科院植保所,广州510640）
摘要:
为明确球孢白僵菌的各项生物学指标与其对小菜蛾致病力间的相关性,对一株球孢白
僵菌菌株GXUBb进行单孢分离,测定了菌株GXUBb及其分离子菌株GXUBb16、GXUBb10、
GXUBb13和GXUBb05这5个菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率、胞外蛋白酶水平和几丁
质酶水平等多项生物学指标。
结果表明,各菌株间生长速率和孢子萌发率无显著差异;产孢量
变化范围154
107~298
107个/ml;胞外蛋白酶水平变化范围104~119;几丁质酶水平
变化范围105~114;各菌株间对小菜蛾二龄幼虫的致病力差异较大,校正死亡率变化范围为
3981%~8379%。
将各生物学指标与菌株对小菜蛾二龄幼虫的校正死亡率进行回归分析得
出,球孢白僵菌对小菜蛾的致病力与菌株生长速率、孢子萌发率无显著相关关系;与产孢量、胞
外蛋白酶水平呈极显著正相关关系;与几丁质酶水平呈显著正相关关系。
关
键
词:
球孢白僵菌;小菜蛾;生物学特性;致病力;相关性
中图分类号:
S47612
文献标识码:
A
文章编号:
10059261（2010）02014306
CorrelationbetweenBiologicalCharacteristicsofBeauveriabassiana
andItsVirulencetoPlutellaxylostella
LEIYanyuan1,LULihua2,HEYurong1*,CHENDonghong1
（1CollegeofResourcesandEnvironment,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642;
2PlantProtectionResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou510640,China）
Abstract:
ToexplicitthecorrelationbetweenbiologicalcharacteristicandvirulenceofBeauveriabassiana
toPlutellaxylostella,fiveB.bassinanastrains,includingparentalstrainGXUBbanditsfoursingle
sporeisolationswereassayedonthegrowthrate,sporulation,sporegerminationrate,extracellularpro
teaselevel,chitinaselevelandtheirvirulencetothesecondinstarlarvaeofP.xylostella.Results
showedtherewasnosignificantdifferenceingrowthrateandsporesgerminationrateamongthestrains.
Thesporulationofthesestrainswas154
107-298107conidial/ml.Theextracellularproteaselevel
andchitinaselevelwere104-119and105-115,respectively.Thecorrectedmortalityofeach
straintothesecondinstarlarvaewas3981%-8379%.Factorsaffectingthevirulencewereanalyzed
收稿日期:
20090722
基金项目:
公益性行业（农业）科研专项（200803001）;广东省农业攻关项目（2006B20301037）
作者简介:
雷妍圆（1981-）,女,博士研究生;*通讯作者,Email:
yrhe@scau.edu.cn。
143
雷妍圆,吕利华,何余容
中国生物防治
第26卷
basedonthecorrelationcoefficient（r）.ThevirulenceofB.bassianastrainsagainstP.xylostellawas
notaffectedbythegrowthrateandsporegerminationrate,butwaspositivelycorrelatedwiththesporula
tion,extracellularproteaselevelandchitinaselevel.
Keywords:
Beauveriabassiana;Plutellaxylostella;biologicalcharacteristic;virulence;correlation
小菜蛾[Plutellaxylostella（L.）]是十字花科蔬菜的重要害虫,因其长期依赖单纯的化学药
剂防治,不但杀灭了大量有益的天敌昆虫,而且造成小菜蛾极强的抗药性[1,2]。
随着人们对蔬
菜生产安全性的要求越来越高,使得小菜蛾防治技术的研究转入非化学防治。
虫生真菌在持
续长久控制害虫,维护生态平衡方面具有不可代替的作用,在生物防治中受到极大重视[3~7]。
球孢白僵菌[Beauveriabassiana（Balsamo）Vuillemin]可侵染15目149科的700余种昆虫[8],
具有广谱性,被认为是最具开发潜力和应用价值的虫生真菌之一
[9]
。
研究表明,一些球孢白僵
菌菌株对小菜蛾具有很强的致病力
[10,11]
。
但在应用过程中,关于球孢白僵菌感染小菜蛾过程
中菌株各项生物学特性的研究进展相对缓慢,球孢白僵菌入侵小菜蛾过程中相互作用及相互
关系等问题尚未圆满解决,给小菜蛾高致病力球孢白僵菌菌株的筛选、致病机理的探索和主要
活性分泌物的分离纯化等研究带来困难。
以往的相关报道中,有些报道仅对球孢白僵菌产孢量与致病力间关系进行分析,或对几种
主要酶活性与致病寄主能力相关性进行讨论;还有些报道仅凭简单比较得出相关与否的结论,
缺乏必要的统计学依据。
Charnley[12]认为虫生真菌的侵染过程与穿透昆虫表皮的机械压力及
其对体壁结构物质分解酶的活性有关,其入侵致病寄主的过程是多因子联合作用的结果,有必
要将菌株的多项生物学特性与致病力间进行相关性分析。
为此,作者以1株野生型球孢白僵
菌菌株GXUBb为亲本菌株,对其47个单孢分离株进行了致病力测定,从中选出4个菌株,并
根据菌落生长形态,将菌株区分为菌丝型和孢子型两种类型。
本文以球孢白僵菌2个菌丝型
和2个孢子型分离子菌株与其亲本菌株在多项生物学指标上进行比较,分析球孢白僵菌生物
学特性与其对小菜蛾致病力间的相关性。
现将研究结果报道如下。
1
11
材料与方法
供试菌株和虫源
供试菌株（表1）均保存于华南农业大学,在SDAY培养基上培养20d,备用。
小菜蛾采集
表1
供试菌株的来源及特征
Table1
Originsandcharactersofthetestedstrains
菌株
Strain
GXUBb
来源
Origin
家蚕虫尸
培养代数
Culture
generation
8
菌落正面
Obversecharacterofcolonies
白色,蓬松菌丝,疏松粉层,中心低平同心环
菌落背面
Rearcharacterofcolonies
红褐色,边缘处有一宽约2mm深褐色环
类型
Type
菌丝型
GXUBb16单孢分离
6
沙黄色,低平粉层,多条辐射凹陷纹
黄褐色,中心至边缘1/2处有一宽约孢子型
4mm深褐色环
GXUBb10单孢分离
6
沙黄色,低平粉层,多条辐射凹陷纹
黄褐色,中心至边缘1/2处有一宽约孢子型
4mm深褐色环
GXUBb13单孢分离
GXUBb05单孢分离
7
7
乳白色,蓬松菌丝,疏松粉层,中心凸起同心环
乳白色,蓬松菌丝,疏松粉层,中心凸起同心环
黄褐色,中心至边缘呈丘状隆起
黄褐色,中心至边缘呈丘状隆起
菌丝型
菌丝型
144
第2期
雷妍圆等:
球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾致病力相关性分析
于广州市市郊华南农业大学农场的芥蓝地,室内用盆栽芥蓝苗继代饲养。
12
1
菌落生长速率测定
斜面上挑取分生孢子,接入已灭菌的005%吐温80溶液中,血球计数板调整孢子浓度为
107孢子/ml的孢子悬浮液。
99mlSDY培养液中接种孢子悬浮液1ml,25!
、110r/min摇瓶
（250ml）培养48h。
1mm2灭菌滤纸片沾取培养悬液,接于每皿（=9cm,下同）25mlSDAY平板
中心,parafilm封口,25!
黑暗培养。
每处理5次重复。
每2d定时定方向测定菌落直径的增长
量1次,共测5次,计算菌落生长速率（mm/d）。
13
产孢量和孢子萌发率的测定
在SDAY平板培养20d的培养物上,于菌落中心至边缘1/2处打孔取样（=13mm）,放入
装有10ml葡萄糖蛋白胨（GP）和1滴吐温80液的50ml三角瓶中,110r/min、25!
摇瓶培养
13h。
点样血球计数板计数,计算产孢量和孢子萌发率。
每菌株计数3次。
14
胞外蛋白酶的测定
参照唐晓庆等[13]的明胶琼脂平板法进行。
每皿15ml培养基制成平板,按12纸片法操
作接种于平板中心,封口膜封口。
每菌株重复3皿。
25!
黑暗培养5d后用十字交叉法测量透
明圈和菌落直径,以两者比值表示产酶水平（菌落透明圈直径/菌落直径）。
15
胞外几丁质酶的测定
参照谢湘玉[14]的方法制备胶体几丁质和处理琼脂。
采用夏国庆等[15]的孢外几丁质酶产
生菌筛选培养基,每皿15ml制成平板。
接种方法同14,25!
黑暗培养10d后用十字交叉法测
量透明圈和菌落直径,以两者比值表示产酶水平（菌落透明圈直径/菌落直径）。
16
致病力生物测定
按13方法取样,置于同成分同体积的培养液中,经涡流振荡制成浓度为1
7
的孢子悬浮液,作为供试菌液。
将个体大小、活力一致的小菜蛾二龄幼虫挑入菌液中,浸渍10s
后挑出,置于滤纸上吸去多余水分,移至叶片上,放入皿底垫有滤纸片的培养皿中,滴水保湿
48h。
以同体积营养液为对照。
视皿内叶片被取食情况更换新鲜甘蓝叶片。
每处理25头幼
虫,5次重复。
幼虫接菌后置于人工智能箱中（25!
RH90%,L∀D=14h∀10h）。
24h后每天记
录感病症状,统计死亡虫数。
收集的死虫置于灭菌培养皿内25!
保湿培养,观察虫尸上菌丝
生长情况,以区分球孢白僵菌致死虫数和非球孢白僵菌致死虫数。
8d后终止试验。
17
数据分析
用几率分析法计算幼虫的校正死亡率,用多重比较法进行差异性比较。
将菌株生物学指
标测定值分别与校正死亡率进行相关分析和回归分析,并进行统计检验。
根据P值和相关系
数r的大小,分析球孢白僵菌的各项生物学指标在其对小菜蛾致病力中的重要性差异。
2
21
结果与分析
各菌株生物学特性及对小菜蛾的致病力
从表2看出,各菌株间平均生长速率和孢子萌发率无显著差异。
产孢量上,孢子型子菌株
GXUBb16的产孢量最高,达298107个/ml;菌丝型子菌株GXUBb13的产孢量最低,仅154
107个/ml;亲本菌株GXUBb介于两者之间。
产酶水平上,各菌株的胞外蛋白酶水平变化范
围为104~119,表现为孢子型菌株显著高于菌丝型菌株。
各菌株几丁质酶水平变化范围为
145
10孢子/ml
中国生物防治
第26卷
105~114,其中,孢子型菌株GXUBb16、菌丝型菌株GXUBb13和亲本菌株GXUBb的几丁质
酶水平无显著差异。
各菌株对小菜蛾二龄幼虫的致病力差异较大,孢子型菌株GXUBb16和
GXUBb10的校正死亡率分别为8379%和7129%,显著高于亲本菌株及菌丝型的子菌株。
表2各菌株生物学特性及对小菜蛾二龄幼虫的致病力（Mean#SE）
Table2
BiologicalcharacteristicofB.bassianastrainsandtheirvirulencetothe2ndinstarlarvaeofP.xylostella
菌株
Strain
GXUBb
GXUBb16
GXUBb10
GXUBb13
GXUBb05
生长速率
Growthrate
（mm/d）
1268#002a
1208#001a
1285#003a
1277#002a
1204#001a
产孢量
Sporulation
（107conidia/ml）
194#068c
298#006a
242#242b
154#087d
189#122c
孢子萌发率
Sporegermination
rate（%）
5198#001a
5084#002a
5072#002a
5261#001a
5144#002a
蛋白酶水平
Extracellular
proteaselevel
109#002c
119#002a
114#002b
105#003d
104#003d
几丁质酶水平
Chitinase
level
115#002a
114#003a
107#001b
113#002a
105#002b
校正死亡率
Corrected
mortality（%）
6081#001c
8379#004a
7129#003b
5711#003c
3981#009d
注:
同列数据后不同小写字母表示5%水平上差异显著。
Note:
Valuesinthesamecolumnfollowedbydifferentsmalllettersaresignificantlydifferentat005level.
22
菌株各项生物学指标与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率的相关性
结果表明（图1~图3）,小菜蛾二龄幼虫
校正死亡率（Y）与菌落生长速率、孢子萌发率
（X）间线性方程分别为Y=4212X+9979（r
=0084303758X+4322（r=00806P=02653）,与产孢量间线性方程为Y=
2018X+1930（r=06003>r001=04960,P
=00056）。
相关分析表明,小菜蛾二龄幼虫
的校正死亡率与菌株生长速率和孢子萌发率
均无显著相关关系。
说明菌株生长速率和孢
图1
Fig.1
菌落生长速率与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率的关系
Correlationsbetweencolonygrowthrateandcorrected
mortalityofthe2ndinstarlarvaeofP.xylostella
图2
Fig.2
产孢量与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率的关系
Correlationsbetweenthesporulationandcorrected
图3
Fig.3
孢子萌发率与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率的关系
Correlationsbetweenthesporegerminationrateand
mortalityofthe2ndinstarlarvaeofP.xylostella
correctedmortalityofthe2ndinstarlarvaeofP.xylostella
子萌发率与各菌株致病力关联很小或缺乏关联。
小菜蛾二龄幼虫的校正死亡率与产孢量呈正
相关关系,相关性达极显著,说明球孢白僵菌产孢量越高,对小菜蛾的致病力越强。
146
第2期
雷妍圆等:
球孢白僵菌生物学特性与其对小菜蛾致病力相关性分析
23
菌株产酶水平与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率的相关性
小菜蛾二龄幼虫校正死亡率（Y）与各菌株胞外蛋白酶和几丁质酶水平（X）间呈直线相关
（图4、图5）,线性方程分别为Y=1996X-1593（r=06538>r001=06230,P=00019）和Y
=2046X-1649（r=05100>r005=04970,P=04646）。
菌株胞外蛋白酶和几丁质酶水平
与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率间皆呈正相关关系,但前者相关性达极显著,后者为显著。
说明
两种酶在菌株感染寄主的过程中均具致病效果,但胞外蛋白酶水平对致病力的影响更高。
图4
Fig.4
胞外蛋白酶与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率的关系
Correlationsbetweentheextracellularproteaselevel
图5
Fig.5
胞外几丁质酶与小菜蛾二龄幼虫校正死亡率的关系
Correlationsbetweenthechitinaselevelandcorrected
andcorrectedmortalityofthe2ndinstarlarvaeofP.xylostella
mortalityofthe2ndinstarlarvaeofP.xylostella
3
讨论
从虫尸上分离的野生型菌株多为异核体。
由于异核体不稳定,人工培养基上继代培养过
程中,异核体内核比例不断变化,往往适应于培养基腐生类型的核被选择出来占优势,引发菌
种退化,常表现为气生菌丝徒长、产孢量下降、对害虫毒力减弱等现象[16]。
本文中野生菌株
GXUBb从获得到使用,保存期不长,尚未出现严重退化。
单孢分离获得的孢子型子菌株,无论
在生长性状还是对小菜蛾致病力上皆显著优于其亲本菌株和菌丝型子菌株。
产孢量与致病力
呈正相关,与此前产孢量与对马尾松毛虫（Dendrolimuspunctatus）幼虫毒力间具线性正相关的报
道一致[17,18]。
生长速率与致病力间无相关性,可能是由于各菌株在营养丰富的SDAY培养基
上皆生长良好的缘故。
孢子萌发率与致病力间无相关性,表明菌株致病力并不取决于孢子萌
发,很可能与孢子在小菜蛾体表的附着力,即是否形成附着胞或侵染钉等侵染结构有关。
球孢白僵菌产酶水平与致病力关系的认识尚未达成一致。
胡景江等[19]研究发现不同世
代的白僵菌菌株胞外蛋白酶产酶水平与毒力都随继代移植次数的增加而减少。
樊美珍等[20]
研究结果表明球孢白僵菌的蛋白酶产量与对马尾松毛虫的致病力呈线性相关。
但冯明光[21]
认为白僵菌蛋白酶活性与毒力相关性虽然显著但却有限,仅适于大量菌种的初筛工作,在统计
学意义上不足以将其作为菌株的毒力指标。
几丁质酶作为另一体壁降解酶,其能否作为球孢
[22]
认为球孢白僵菌的致病力与几丁质酶活性呈
[23]
研究表明球孢白僵菌几丁质酶活性与致病力并非直接的线性关
系,并推测菌株致病力是由多基因决定的,毒力指标只有与其它指标协同作用,才能与如酶活
性等一些生化指标产生相关性。
本试验中两种类型的菌株产酶水平存在明显差异,且产酶水平的高低差异与其对小菜蛾
的致病力间有显著或极显著相关性。
当供试寄主改变时,相关性程度也会随之改变。
因为不
147
白僵菌致病力的指标也存有争议。
张爱文等
典型的正相关;而王成树等
中国生物防治
第26卷
同寄主或同一寄主的不同龄期表皮结构相异,对芽管入侵机械压力、酶水解作用的敏感性是不
同的。
因此要阐明这些致病因子在致病过程中的作用,还需借助其他试验手段进一步研究。
根据产酶水平与致病力的相关性分析结果,胞外蛋白酶在球孢白僵菌侵染小菜
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