胡椒中抑菌成分提取及工艺优化.docx

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胡椒中抑菌成分提取及工艺优化

胡椒中抑菌成分提取及工艺优化

摘要

本实验首先对胡椒抑菌活性成分的提取工艺进行选择，在以抑菌效果作为首要选择标准的前提下对超声波提取法和回流提取法进行筛选，然后再分别对提取试剂、提取时间、浸泡时间等提取条件进行筛选，最后综合以上实验结果利用二次通用旋转组合设计对提取工艺进行优化。

实验结果如下：

黑胡椒用回流提取抑菌效果比用超声波提取的效果好，用95%乙醇提取对黑曲霉有最佳的抑菌效果；用80%乙醇提取则对大肠杆菌有最佳的抑菌效果；黑胡椒在提取60min时对大肠杆菌和黑曲霉均具有最佳抑菌效果；黑胡椒浸泡12h时对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌效果最好。

而白胡椒则是用超声波提取的抑菌效果比较好，用80%乙醇提取时对大肠杆菌具有最佳的抑菌效果；用60%乙醇提取对黑曲霉有最佳的抑菌效果；白胡椒在提取60min是对大肠杆菌有最佳抑菌效果；在提取100min时对黑曲霉具有最佳抑菌效果。

白胡椒浸泡4h对大肠杆菌和黑曲霉的抑菌效果最好。

采用二次通用旋转组合设计对以上提取工艺进行优化，得出对大肠杆菌抑菌效果最优的提取工艺为：

白胡椒用95%乙醇提取，浸泡720min，提取100min时对黑曲霉具有最佳的抑制效果；当白胡椒用81%乙醇提取，浸泡480min，提取80min时对大肠杆菌具有最佳的抑制效果。

黑胡椒80%乙醇提取，浸泡720min，提取70min时对黑曲霉具有最佳的抑制效果；当黑胡椒用80%乙醇提取，浸泡480min，提取70min时对大肠杆菌具有最佳的抑制效果。

本论文的目的在于研究不同条件下胡椒中抑菌活性物质的提取及其对不同细菌的抑制作用。

主要意义在于将胡椒的抑菌活性物质应用于果蔬保鲜及农产品生产过程。

研究方法为胡椒活性物质的提取及抑菌效果的分析。

实验成果及结论是证明黑白胡椒对不同的菌种具有不同的抑制效果。

关键词：

黑胡椒；白胡椒；提取；抑菌；二次通用旋转组合设计

Abstract

Thisexperimentfirstcarriesontheselectionofthepepper'santibacterialsubstances'extractcraft.Intheprimaryselectionoftheantibacterialeffect,toscreenthecraftofultrasonicwaveextractionandrefluxextraction.Andthenscreeningtheextractivereagent,extractivetimeandimmersingtime.Finallythesynthesisaboveexperimentalresultandusesquadraticgeneralrotaryunitizeddesigntocarryontheoptimizationtotheextractiveprocess.Theexperimentalresultsareasfollows:

blackpepperusesrefluxextractionanditsantibacterialactivityisbetter,95%ethylalcohol’sextractionhasbesteffectonaspergillusnigerand80%ethylalcohol’sextractionhasbesteffectonescherichiacoli.Whenextracting60minutes,ithasbesteffectonbothescherichiacoliandaspergillusniger.Whenblackpepperisimmersed12hours,itsextractionhasbesteffectonescherichiacoliandaspergillusniger.Inwhitepepperaspect,theantibacterialeffectwhichwithdrawswiththeultrasonicwaveextractionisquitegood.80%ethylalcohol’sextractionhasbesteffectonescherichiacoliand60%ethylalcohol’sextractionhasbesteffectonaspergillusniger..Whenextracting60minutes,ithasbesteffectonescherichiacoliandextracting100minutes,ithasbesteffectonaspergillusniger.Whilewhitepepperisimmersed240min,itsextractionhasbesteffectonescherichiacoliandaspergillusniger.Makeusesofquadraticgeneralrotaryunitizeddesigntoimprovetheextractionprocess,theresultis:

Thebestcraftonaspergillusnigerofwhitepepperis95%ethylalcoholasextraction,immersed12hoursandextracting100minutes.Thebestcraftonescherichiacoliofwhitepepperis81%ethylalcoholasextraction,immersed480minandextracting80minutes.Thebestcraftonaspergillusnigerofblackpepperis80%ethylalcoholasextraction,immersed720minandextracting70minutes.Thebestcraftonescherichiacoliofwhitepepperis80%ethylalcoholasextraction,immersed480minandextracting70minutes.

Keywords：

blackpepper;whitepepper;extract;antibacterialactivity目录

摘要1

Abstract2

前言4

1实验材料与方法5

1.1实验材料5

1.1.1原材料5

1.1.2菌种5

1.1.3试剂5

1.2仪器设备5

1.3实验方法5

1.3.1样品预处理5

1.3.2提取方法选择6

1.3.3提取溶剂选择6

1.3.4提取时间选择6

1.3.5浸泡时间选择6

1.3.6乙醇溶解液配制6

1.4抑菌试验6

1.4.1试验前准备6

1.4.2抑菌试验7

2结果及分析7

2.1白胡椒结果分析8

2.1.1白胡椒提取方法选择结果8

2.1.2提取溶剂选择结果8

2.1.3提取时间选择结果8

2.1.4浸泡时间选择结果9

2.1.5白胡椒的工艺优化10

2.2黑胡椒结果分析13

2.2.1黑胡椒提取方法选择结果13

2.2.2提取溶剂选择结果14

2.2.3提取时间选择结果14

2.2.4浸泡时间选择结果14

2.2.5黑胡椒的工艺优化15

3结论18

参考文献19

致谢…………………………………………………………………………….20

前言

胡椒属胡椒科常绿藤本植物胡椒的接近成熟或成熟果实，它只能生长在年降水量2500mm的热带地区，生长期中还需要一段干热的间隔期，现广泛栽培于热带国家[1]。

胡椒可精深加工胡椒碱、胡椒油树脂等系列产品，在食品工业和医药工业上具有很多十分重要的用途[2]。

胡椒一般加工成胡椒粉，用于烹制内脏、海味类菜肴或用于汤羹的调味，具有祛腥提味的作用。

胡椒因采收期和处理方法的不同分为黑胡椒和白胡椒，两者都是食物的调味品，然而白胡椒的味道较不刺激[3]。

胡椒已成为全球进出口贸易最大和最有潜力的特种香料油料产业作物，胡椒碱和胡椒油树脂产业在美国、欧盟各国、日本、韩国等许多发达国家已形成成熟的市场，并且主宰着全球胡椒产业的发展[1]。

胡椒在中医上属辛热纯阳之物，适合肠胃寒湿人士服用，能健胃及驱除肠道积气。

另一方面胡椒亦可治疗肠胃温热、胃寒、痰多、肚痛反胃、食欲不振、牙痛等症状，以至解热、利尿及解除虾蟹等所引起之食物中毒[4]。

胡椒（碱）对蛛网膜下腔出血后迟发性脑血管痉挛有预防作用，其抗血管痉挛作用可能与胡椒碱抑制血浆内皮素-1（ET-1）、促进一氧化氮合成酶（NOS-1）活性有关[5]。

胡椒具有持久的辛辣味和芳香的挥发油两大优势，在漫长的寒冬里可以减少肉类的腐烂并掩盖住因长期储存而产生的不受人欢迎的味道[6]。

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1原材料

白胡椒、黑胡椒，以上香辛料均购自百佳汇超市中兴店。

1.1.2菌种

大肠杆菌、黑曲霉、酵母菌，以上菌种为海南大学食品学院微生物实验室提供。

1.1.3试剂

名称

标准

厂家

无水乙醇

分析纯

广州化学试剂厂

氯化钠

分析纯

广州化学试剂厂

氢氧化钠

化学纯

广东汕头市西陇化工厂

蛋白胨

食品级

北京市海淀区微生物培养基制品厂

牛肉浸膏

——

上海蓝季科技发展有限公司

琼脂

——

——

1.2仪器设备

仪器名称

型号

厂家

超声波清洗机

CQ-10

广州经济技术开发区明珠电器有限公司

电热恒温水浴锅

LSY

北京市医疗设计厂

数显恒温水浴锅

B-200

上海亚荣生化仪器厂

循环水式真空泵

SHZ-D（Ⅲ）

巩义市英峪予华仪器厂

生化培养箱

——

南京实验仪器厂

电热恒温鼓风干燥箱

101-1-BS

上海跃进医疗器械厂

立式压力蒸汽灭菌器

LS-B50L

上海医用核子仪器

旋转蒸发仪

RE5CS

上海亚荣生化仪器厂

电子天平

PL303

梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

1.3实验方法

1.3.1样品预处理

将白胡椒和黑胡椒分别置于50～60℃非鼓风烘干1天，待冷却后，粉碎，过40目筛，取筛下物留作样品[7]。

1.3.2提取方法选择

在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后按料液比1：

20g/mL加入100mL95%乙醇，浸泡4h后分别用超声波提取法[7]和回流提取法[8]提取1h。

提取结束后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后称重并计算提取率。

提取率（%）=

%

1.3.3提取溶剂选择

在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后按料液比1：

20g/mL分别加入100mL95%乙醇，80%乙醇，60%乙醇，40%乙醇，水，浸泡4h后黑胡椒及白胡椒分别用各自最佳的提取方法提取1h。

提取结束后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后称重并计算提取率。

1.3.4提取时间选择

在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后按料液比1：

20g/mL分别加入最佳提取溶剂，浸泡4h后黑胡椒及白胡椒分别用各自最佳的提取方法提取20min、40min、60min、80min、100min、120min。

提取结束后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后称重并计算提取率。

1.3.5浸泡时间选择

在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后按料液比1：

20g/mL分别加入最佳提取溶剂，分别浸泡0h、4h、8h、10h、16h，然后黑胡椒及白胡椒分别用各自最佳的提取方法提取。

提取结束后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后称重并计算提取率。

1.3.6样品溶液液配制

将样品提取物用95%乙醇配制成3%的样品溶液液，备用。

1.4抑菌试验

1.4.1试验前准备

制备牛肉膏蛋白胨培养基[9]

配方：

牛肉膏10.0g、蛋白胨20.0g、氯化钠10.0g、琼脂40.0g、水2000mL，pH7.0。

步骤：

称取牛肉膏10.0g、蛋白胨20.0g放入小铝锅，加入100mL水置电炉上加热搅拌至牛肉膏和蛋白胨完全溶解。

向铝锅内加入1000mL水，10.0g氯化钠和洗净的琼脂，继续搅拌，加热至琼脂完全溶化，补水至2000mL。

用玻棒沾少许液体，测定pH值，用10%氢氧化钠或10%盐酸调至pH7.0。

用分装漏斗分装于3支18mm×180mm试管中，塞好棉塞并用报纸包好，其余的装入500mL的三角瓶中并用报纸包好。

生理盐水配制

将0.9g氯化钠溶于100mL蒸馏水，制成0.9%的生理盐水，按每管10mL分装于若干试管中，塞好棉塞并用报纸包好，备用。

灭菌

将已配制的培养基与生理盐水放入121℃，0.1Mpa的灭菌锅中灭菌20min。

试管培养基灭菌后趁热摆放斜面，以备菌种活化时使用。

菌种活化

将供试菌种接种于斜面试管内，大肠杆菌置于37℃恒温培养箱内培养24h左右，黑曲霉及酵母菌置于28℃恒温培养箱内培养44-48h。

菌悬液配制

供试菌种于斜面活化后，加入10ml生理盐水制成含菌数为106～107个/ml的菌悬液，备用[10]。

1.4.2抑菌试验

平板打孔法是固体平板扩散法的其中一种，可以在平板上打一定大小的圆孔，然后把被测物滴入孔内。

经培养后在物质扩散所及的范围内出现抑菌圈（或生长圈），测量圈的直径，即可知道被测物的抑菌能力[11]。

每个平板中加入适量培养基，冷却后加入0.3ml菌悬液涂布均匀，然后用直径为11cm的打孔器打孔，吸取0.1mL样品溶液注入已打好的圆孔中（以95%乙醇为空白），大肠杆菌于37℃下培养24h，黑曲霉和酵母菌于28℃下培养44-48h，测抑菌直径。

抑菌直径（mm）=样品抑菌直径-空白抑菌直径

2结果及分析

2.1白胡椒结果分析

2.1.1白胡椒提取方法选择结果

由1.3.2的试验操作，结果见下表。

表1白胡椒不同提取工艺的提取效果及抑菌效果

提取方法

提取率（%）

抑菌直径（mm）

大肠杆菌

黑曲霉

酵母菌

回流法

5.86

3.66

3.68

1.01

超声波法

5.08

4.38

7.62

0.24

由表1表明，白胡椒用回流法提取，提取率较高，但是用超声波法提取的抑菌效果较好，故白胡椒选择用超声波法进行提取。

由于白胡椒的提取物均对酵母菌没有明显的抑菌效果，因此以下试验不进行对酵母菌进行抑菌实验。

2.1.2提取溶剂选择结果

根据1.3.2的实验结果，白胡椒以超声波提取法进行1.3.3的试验操作，实验结果见表2。

由表2可知白胡椒提取率最高的是80%的乙醇溶液，在对大肠杆菌的抑菌试验中，用80%的乙醇溶液提取的抑菌效果最好；对黑曲霉的抑菌效果最好是60%的乙醇溶液。

表2不同浓度溶剂白胡椒的提取效果及抑菌效果

乙醇浓度（%）

提取率（%）

抑菌直径（mm）

黑曲霉

大肠杆菌

95

9.12

5.38

5.20

80

10.90

5.58

5.95

60

9.20

7.32

5.14

40

4.84

8.81

3.95

0

2.88

5.69

1.59

2.1.3提取时间选择结果

表3不同提取时间对白胡椒的提取效果及抑菌效果

提取时间

（min）

大肠杆菌

黑曲霉

提取率（%）

抑菌直径（mm）

提取率（%）

抑菌直径（mm）

20

8.66

5.10

9.10

5.95

40

9.58

5.20

8.72

5.96

60

10.26

6.39

10.18

7.27

80

9.66

6.15

9.62

7.64

100

9.32

6.17

9.52

8.44

120

9.42

6.23

9.98

4.50

根据1.3.3的实验结果，以60%的乙醇溶液为黑曲霉抑菌试验的提取溶剂，以80%乙醇溶液为大肠杆菌抑菌试验的提取溶剂进行1.3.4的试验操作，结果见表3。

由表3可知白胡椒提取60min时，对大肠杆菌有最佳的提取率和抑菌效果；提取100min时对黑曲霉有最佳的抑菌效果。

2.1.4浸泡时间选择结果

根据1.3.4的实验结果，以60%的乙醇溶液为黑曲霉抑菌试验的提取溶剂提取100min，以80%乙醇溶液为大肠杆菌抑菌试验的提取溶剂提取60min进行1.3.5的试验操作，结果见表4。

由表4可知在白胡椒对大肠杆菌的抑菌试验中，浸泡720min时提取率最高的，但抑菌效果最好是浸泡240min；在对黑曲霉的抑菌试验中，提取率最高的是浸泡720min，但抑菌效果最好也是浸泡240min。

表4不同浸泡时间对白胡椒的提取效果及抑菌效果

浸泡时间（min）

大肠杆菌

黑曲霉

提取率（%）

抑菌直径（mm）

提取率（%）

抑菌直径（mm）

0

8.70

6.12

8.46

5.87

240

10.72

7.05

8.84

6.91

480

9.80

6.37

9.58

6.65

720

14.74

6.12

10.40

6.77

960

10.18

6.21

10.34

6.64

根据1.3.4的实验结果，以60%的乙醇溶液为黑曲霉抑菌试验的提取溶剂提取100min，以80%乙醇溶液为大肠杆菌抑菌试验的提取溶剂提取60min进行1.3.5的试验操作，结果见表4。

由表4可知在白胡椒对大肠杆菌的抑菌试验中，浸泡720min时提取率最高的，但抑菌效果最好是浸泡240min；在对黑曲霉的抑菌试验中，提取率最高的是浸泡720min，但抑菌效果最好也是浸泡240min。

2.1.5白胡椒的工艺优化

根据以上单因素实验结果，分别将溶剂浓度X1、浸泡时间X2、提取时间X3对抑菌效果的综合影响，采用DPS数据处理系统设计三因素二次通用旋转组合试验设计，对白胡椒进行工艺优化。

试验结果分析均在DPS数据处理软件下运行[12]。

编码因子见表5，设计方案及结果见表6。

表5白胡椒的二次通用旋转组合设计因子水平及编码

编码

因子水平

溶剂浓度%（v/v）X1

浸泡时间（min）

X2

提取时间（min）

X3

1.682

95

720

100

1

89

623

92

0

80

480

80

-1

71

337

68

-1.682

65

240

60

表6白胡椒提取条件的三元二次通用旋转组合设计方案及结果

试验号

x1

x2

x3

提取率（%）

抑菌直径（mm）

黑曲霉

大肠杆菌

1

1

1

1

9.60

5.23

5.19

2

1

1

-1

9.64

5.43

5.16

3

1

-1

1

11.44

5.41

5.20

4

1

-1

-1

10.90

5.26

5.03

5

-1

1

1

11.14

5.37

5.34

6

-1

1

-1

11.02

5.21

5.21

7

-1

-1

1

9.66

6.10

5.28

8

-1

-1

-1

10.36

5.83

5.15

9

-1.682

0

0

9.94

5.84

5.87

10

1.682

0

0

8.30

5.22

5.30

11

0

-1.682

0

9.54

5.38

6.02

12

0

1.682

0

10.20

5.58

6.13

13

0

0

-1.682

9.88

5.20

5.64

14

0

0

1.682

8.74

4.61

5.79

15

0

0

0

9.42

4.90

5.66

16

0

0

0

9.62

4.82

5.65

17

0

0

0

9.68

4.87

5.73

18

0

0

0

9.46

4.75

5.69

19

0

0

0

9.62

4.89

5.65

20

0

0

0

9.34

4.73

5.70

白胡椒对黑曲霉抑菌效果的回归分析

采用DPS系统对白胡椒对黑曲霉抑菌效果进行回归分析得到以下回归方程，试验结果的方差分析见表7。

其回归方程如下：

Y=4.82609-0.01004X1-0.12422X2+0.10049X3+0.28011X12+0.26242X22+0.05908X32+0.16750X1X2-0.06000X1X3-0.05750X2X3

当α=0.10显著水平剔除不显著项后，简化后的回归方程：

Y=4.82069-0.124422X2+0.10049X3+0.28011X12+0.26242X22+0.05908X32+0.16750X1X2-0.06000X1X3-0.05750X2X3

以抑菌直径为准，将其回归方程用LONGO语言进行分析，得到最佳方案为：

乙醇浓度为95%，浸泡时间720min，萃取时间100min。

对最佳方案进行验证，得到提取率为6.92%，抑菌直径为6.48mm，与理论值的6.62mm相差不大，所以可认为其为最佳方案。

表7白胡椒对黑曲霉抑菌效果的试验结果方差分析

变异来源

平方和

自由度

均方

比值F

显著水平p

X1

0.015

1

0.015

0.260

0.621

X2

2.230

1

2.230

39.709

0.000

X3

1.459

1

1.459

25.988

0.000

X12

11.965

1

11.965

213.073

0

X22

10.502

1

10.502

187.021

0

X32

0.532

1

0.532

9.479

0.012

X1X2

2.375

1

2.375

42.296

0.000

X1X3

0.305

1

0.305

5.427

0.042

X2X3

0.280

1

0.280

4.984

0.050

回归

2.564

9

0.285

F2=5.073

0.011

剩余

0.562

10

0.056

失拟

0.535

5

0.107

F1=20.163

0.