中检院送检细胞制剂检定项目SOP.docx

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中检院送检细胞制剂检定项目SOP

人脐带间充质干细胞P4代成品细胞质量标准

检测项目

检测方法

标准规定

【生物学属性】

细胞形态

镜检

细胞贴壁生长时，呈梭形，应为成纤维样细胞

细胞计数

细胞计数仪检测

标示量的90%～120%

STR图谱

多重PCR复合扩增系统检测

无交叉污染

细胞活率

细胞计数仪检测

不低于85%

细胞表面抗原分析

CD90

流式细胞术（FCM）

不低于95%

CD73

不低于95%

CD105

不低于95%

CD44

不低于95%

CD166

不低于95%

CD45

不得过2%

CD34

不得过2%

CD19

不得过2%

CD14

不得过2%

HLA-DR

不得过2%

【微生物学安全性检查】

无菌

需氧菌及真菌

全自动血培养仪监测

系统检测

阴性

厌氧菌及真菌

阴性

内毒素

凝胶法

阴性

支原体

培养法

阴性

逆转录病毒

PERT法检测逆转录酶活性

阴性

HIV-1

荧光PCR核酸检测

阴性

HBV

荧光PCR核酸检测

阴性

HCV

荧光PCR核酸检测

阴性

HCMV

荧光PCR核酸检测

阴性

EBV

荧光PCR核酸检测

阴性

HPV

荧光PCR核酸检测

阴性

人细小B19病毒

荧光PCR核酸检测

阴性

HHV6/7

PCR核酸检测

阴性

HTLV

PCR核酸检测

阴性

猪细小病毒

PCR核酸检测

阴性

猪细环病毒

PCR核酸检测

阴性

猪圆环病毒

PCR核酸检测

阴性

牛副流感病毒

PCR核酸检测

阴性

牛腺病毒

PCR核酸检测

阴性

牛细小病毒

PCR核酸检测

阴性

牛腹泻病毒

PCR核酸检测

阴性

牛呼肠孤病毒

PCR核酸检测

阴性

【生物学活性检查】

诱导分化能力检测

成骨成脂诱导分化染色法

具有成骨成脂诱导分化潜能

成瘤性检测

软琼脂克隆生长试验

无克隆形成

细胞流式检测标准操作程序

1目的：

对细胞表面抗原进行流式鉴定，保证检测的准确性。

2范围：

细胞流式检测的全过程

3责任人：

技术部

4内容

4.1仪器和试剂

4.1.1仪器设备：

流式细胞仪（FACSCaliburTM）、台式离心机、1000µL微量移液枪、100µL微量移液枪、10µL微量移液枪。

4.1.2试剂以及耗材：

FITC单克隆抗体、APC单克隆抗体、PE单克隆抗体、PerCP单克隆抗体、相应的同型对照；1XPBS；鞘液专用流式管、枪头。

4.1.3样本准备

4.1.3.1将样本按条码号顺序排列好，每份样本按照检测抗体种类的需要取流式专用管若干支，分别标记好单阳管、阴性管、同型对照管和样本检测管。

4.1.3.2各取100µL样本加入标记好的流式管中，然后根据流式管标记的信息分别添加对应的抗体。

充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30分钟。

4.1.3.5孵育结束以后加入1mlPBS，充分混匀，1200rpm离心5分钟。

4.1.3.7弃上清液，加入300µLPBS。

充分混匀，随后上机检测。

4.2仪器开机程序

4.2.1依次打开稳压电源，主电源，流式细胞仪电源，计算机。

4.2.2开启电脑，在出现的密码登录框中，输入BDIS，按Enter。

4.2.3打开鞘液筒抽屉，检查鞘液筒和废液筒存液情况，鞘液筒空则需要加液，废液筒满则取出倒除，检查管路是否有气泡，否则应排除，没有问题以后，打开鞘液压力开关。

4.2.4开机后，仪器预热5min，即可开始进行实验。

4.2.5实验之前，仪器清洗，专用流式管装满双蒸水，放置仪器吸液管下，设备“run+high”情况下，然后PRIME（排空气）模式运行两次。

4.2.6流式细胞仪上样前FAScomp质控分析

4.2.6.1标准微球的制备（标准微球“CalBRITEbeads”保存4度）

三色检测：

管1：

1滴Unlabeled+0.5ml鞘液（或者0.5ml蒸馏水）

管2：

1滴unlabeled+FITC,PE,Percp各一滴+1ml鞘液

四色检测：

管1：

1滴unlabed+1滴APC+0.5ml鞘液

管2：

1滴unlabed+FITC,PE,Percp,APC各一滴+1ml鞘液

4.2.6.2打开FAScomp软件，在“sighin”窗口下，输入信息，然后“accept”,进入“setup”窗口。

4.2.6.3“setup”窗口下，选择分选模式：

“Lyse/wash”（用于溶血素洗涤样本）（通常选择该模式），“Lyse/Nowash”（用于溶血处理后的免洗样），然后输入CaliBRITEBeads”批号（批号为6位编码，最后一位为大写字母），选择存储文件。

4.2.6.4然后点击“RUN”，进入PMT窗口，在该窗口下，用管1为样品，选择“RUN-/high”。

点击“start”自动调节光电倍增管的电压，屏幕出现闪烁“PMTSsetsuccessfully”,点击“NEXT”。

4.2.6.5在“COMP”窗口下，用“管2”为样品，选择“RUN/HIGH”，点击“START”，可执行自动调节荧光补偿：

FL1-%FL2,FL2-%FL1和FL3-%FL2,屏幕出现“COMPENSATIONSETSUCCESSFULLY”便可点击出“NEXT”。

4.2.6.6在“sens”窗口下，依然用管2为样，点击“start”可自动检测各参数灵敏度。

4.2.6.7在“summaryreport”下得到所有检测的结果。

4.2.6.8质控完成后，移去标准微球管并插上双蒸水流式管，在“summaryreport”状态下，点击“quit”键，或从“filemenu”中选择“quit”退出程序。

4.2.7打开cellquestpro软件，按”common+B”组合键，连接流式细胞仪。

4.2.8从“cytometer”菜单中选择“detectors”（或者键盘“common+1”）、“threshold”（或者“common+2”）、“compensation”（或者键盘“common+3”）、“status”（键“common+4”）,将出现各自对应的窗口，将其拖至空白处。

4.2.9确定软件与细胞仪完成连接。

如果有必要，可点击Cytometer视窗，观察软件与细胞仪是否完成连接。

4.2.10完成连接后，在Cytometer视窗下方会显示CytometerConnected。

检视各项试剂液面是否正常。

在Cytometer视窗右下方会显示各项试剂液面高度。

视实验需要补充FACSFlow，倒除废液。

如果视窗下方显示CytometerDisconnected，可尝试重新启动Cellquestpro软件。

4.2.11接着可以开始规划实验挡、或设置仪器。

4.3上样检测

4.3.1在工具板中选择点图，在文件的空白区点击，然后拖动对角线至所需大小，出点图对话框，点击“plottype”,选择“acquisition->analysis”；X、Y轴默认为FSC、SSC，然后上阴性管，调节FSC、SSC电压，再设置目标细胞群“region”，该“region”在调节荧光探测器时使用，在工具板中选择多边形“region”，在FSC/SSC散点图上，设淋巴细胞“region”，该“Region”在调节荧光探测器时使用；在工具板中选择多边形的“Region”,在FSC/SSC点图上，设目标细胞群“region”,在“region”外点击，将拖至空白区。

然后建立FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4点图,选择“G1=R1”,在工具板上选择象限标尺，三个点图上画象限，指定阴性/阳性区域，调节FL1、FL2、FL3、FL4电压，使细胞群调在各点图所在图的左下角，点击“Acquisitioncontrol”窗口中的“pause”,移去阴性对照管。

4.3.2依次上FITC、PE、Percp、APC单阳管，必要时，调节FL2-%FL1、FL1-%FL2、FL2-%FL3、FL3-%FL2、FL3-%FL4、FL4-%FL3的补偿，调节完成后，点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”,移去单阳管。

4.3.3插上同型对照管，删除FL1/FL2、FL3/FL2、FL3/FL4点图,建立FL1、FL2、FL3、FL4直方图，点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”，之后Setup之面方框‘√’去掉，然后点击‘Acquire’,收集10000个细胞，然后同型管图型外阳性区域画直方图Marker,设定Marker左右边界，移去同型对照管。

4.3.4插上样本检测管，点击“acquisitioncontrol”窗口中的“pause、abort”,之后Setup之面方框‘√’去掉，然后点击‘Acquire’，收集10000个细胞，结束以后，移去样本管，插上双蒸水管，将仪器处于“standby”状态。

4.3.5分析数据，选中一个图表，点击菜单中stats，选择“HistogramStats”,出现该选中图的数据分析结果，选择Stats菜单下的“EditHistogramStats”，出现对话框，去掉一些不需要的参数，点击OK。

4.3.6数据储存，首先在Cytometer视图菜单下选择InstrumentSetting保存数据条件，然后Files视图菜单下选择saveDocumentas保存数据模板，之后可使用相关软件进行数据分析。

4.4仪器关机程序

4.4.1换上双蒸水管。

4.4.2在High+Run条件下，运行3min，2次，然后PRIME+high进行排空气2次。

4.4.3点选File>>Quit退出软件。

关闭细胞仪，关闭电脑。

如有必要，请加入1/10体积

漂白水，再倒掉废液，避免生物性危险。

4.4.4填写运行记录。

5修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人/修订日期

支原体培养法检测标准操作程序

1目的：

规范培养法检测支原体的标准操作程序

2范围：

细胞产品中支原体的检测

3责任人：

技术部

4内容

4.1实验试剂耗材

4.1.1仪器：

生物安全柜，二氧化碳培养箱，电动移液器，移液枪

4.1.2耗材：

EP管，200µl枪头，5ml移液管，15ml离心管

4.1.3试剂：

支原体培养法检测试剂盒

4.2实验步骤

4.2.1用5ml移液管取细胞培养上清于15ml离心管中备用。

4.2.2取出试剂盒的测试板准备种样本，移液枪吸取100ul培养液加入A1-空白对照孔。

4.2.3将100ul细胞培养上清加到UU-MH培养瓶中，混匀。

4.2.4吸取100ulUU-MH培养瓶中的混合液体分别接种到样本检测的微孔中，所有微孔滴加1-2滴试剂盒中的矿物油。

4.2.5将测试板加盖后置培养箱中35-37℃培养24-48小时，观察结果：

接种标本的培养基培养后，澄清透明不变色为阴性，澄清透明并呈明显红色为阳性。

4.2.6若偶遇培养基变浅红色（即变色不明显），建议延长12~24h培养报结果（可能刚感染支原体，标本中支原体数量过少或受抗生素抑制作用而使变色不明显）。

5记录

5.1试剂盒的支原体鉴定报告单

6修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人/修订日期

逆转录病毒PERT法检测标准操作程序

1目的：

规范质量检验中逆转录病毒PERT法检测标准操作程序

2范围：

细胞产品中逆转录病毒的检测

3责任人：

技术部

4原理

逆转录病毒是一大类含有逆转录酶的RNA病毒，分为肿瘤病毒亚科、慢病毒亚科和泡沫病毒亚科。

逆转录病毒进入宿主细胞后，以RNA为模板逆转录合成双链DNA，DNA被整合酶整合至宿主染色体形成前病毒，建立终生感染并可随宿主细胞分裂传递给子代细胞。

基于这一共同特点，可通过检测逆转录酶活性来检测细胞样品是否被逆转录病毒污染。

以MS2噬菌体RNA为模板，在合适的反应条件下，利用待检细胞的裂解液或者培养液进行逆转录，再以逆转录反应液为模板，以MS2噬菌体基因组特异性引物进行PCR，根据PCR的结果即可判断待检样品是否受逆转录病毒污染。

5内容

5.1实验物品的准备

5.1.1仪器:

Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统

5.1.2试剂：

MS2噬菌体RNA、去RNase水、逆转录酶、2×EasyTaqDNA聚合酶、DNAMarker、

MS2噬菌体基因组特异性引物、RibonucleaseInhibitor、琼脂糖

5.2实验步骤

5.2.1样品制备收集培养的hUC-MSCs约1X106，加入100μLPBS。

置于-20℃冰冻30min，

然后室温融化，反复冻融三次以裂解细胞，10000g离心10min，取上清液备用。

5.2.2对照设置以逆转录酶为阳性对照，此时逆转录酶体积为1μL，去RNase水的体积相应

变化，保持总反应体系为20μL；以去RNase水为阴性对照。

5.2.3逆转录体系如下：

成分

体积（μL）

RNase-freewater

2.5mMdNTP

5×RTBuffer

10mMprimer

0.5

RibonucleaseInhibitor

0.5

MS2RNA

待检样品

总体积

42℃反应30min，85℃加热5min使拟转录酶灭活。

5.2.4PCR体系如下：

成分

体积（μL）

2×EasyTaqDNApolymerase

10μMPrimer_F

10μMPrimer_R

逆转录反应液

ddH20

总体积

PCR程序如下：

过程

温度

时间

预变性

95℃

5min

PCR反应

（35个循环）

94℃

30sec

59℃

30sec

72℃

20sec

延伸

72℃

1min

5.2.5凝胶电泳

取5μLPCR产物，加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳。

电压为120V，时间为30min。

电泳结束，利用凝胶成像仪拍照。

预期PCR产物阳性对照必须有308bp条带出现，阴性对照必须无任何扩增，否则实验无效。

6记录

6.1《逆转录病毒检测实验记录》

7修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人

/修订日期

细胞基因组DNA提取操作标准流程

1目的：

规范质量检验中从细胞中提取DNA的标准操作

2范围：

细胞基因组DNA提取

3责任人：

技术部

4内容

4.1实验物品的准备

4.1.1试剂：

DNA快速提取试剂盒、异丙醇

4.1.2耗材：

10mL移液管、5mL移液管、50mL离心管、10μL&200μL枪头、1.5mLEP管

4.1.3仪器：

掌上离心机、混匀仪、电热恒温水槽、台式离心机、Nanodrop微型分光光度计

4.2实验步骤

4.2.1提前打开水浴锅，设置为70℃，预热高压的去离子水（溶解DNA用），将细胞沉淀（滴度测定实验准备的新鲜样品或-80℃冻存样品）用180μL的PBS重悬。

4.2.2加入20μL蛋白酶K溶液（用之前震荡混匀离心），充分震荡混匀，瞬离，加入200μL结合液CB，立刻涡旋震荡，充分混匀，70℃水浴锅内放置20min（10min时震荡混匀一次）。

4.2.3瞬离（为避免管盖沾有液体），加入100μL异丙醇，立刻涡旋震荡，充分混匀，此时可能出现絮状沉淀。

4.2.4瞬离（为避免管盖沾有液体），将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）（加之前吹打两下，使之混匀），加入后立即盖好盖子，防止异丙醇挥发，13000rpm，1min，20℃，离心，倒掉收集管中的液体。

4.2.5加入500μL抑制物去除液IR（用之前摇一下混匀），12000rpm，1min，20℃，离心，弃掉废液。

4.2.6加入500μL漂洗液WB（检查已加入无水乙醇），12000rpm，1min，20℃，离心，弃掉废液。

4.2.7加入500μL漂洗液WB（检查已加入无水乙醇），12000rpm，1min，20℃，离心，弃掉废液。

4.2.8将吸附柱AC放回收集管中，13000rpm，2min，20℃，离心，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。

4.2.9取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，打开盖子静置2min，使乙醇完全挥发，如样品较多，晾干2分钟后需盖上所有管盖；在吸附膜的中间部位加50μL预热过的高压的去离子水，70℃水浴锅中放置5min，13000rpm，1min，20℃，离心。

4.2.10利用Nanodrop检测所提DNA溶液浓度，要求A260/A280在1.8-2.0之间，A260/A230大于2.0。

DNA溶液储存于4℃或-20℃待用。

5记录

5.1《内外病毒DNA因子检测记录》

6修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人

/修订日期

细胞基因组RNA提取操作标准流程

1目的：

规范质量检验中从细胞中提取RNA的标准操作

2范围：

细胞内RNA提取

3责任人：

技术部

4内容

4.1实验物品的准备

4.1.1试剂：

EasyPure®RNAPurificationkit、70%乙醇、β-巯基乙醇

4.1.2耗材：

10μL&200μL&1000μL枪头、1.5mLEP管

4.1.3仪器：

掌上离心机、混匀仪、电热恒温水槽、台式离心机、Nanodrop微型分光光度计

4.2实验步骤

4.2.1样品处理

收集细胞，离心得到的细胞沉淀，去除上清后，轻弹离心管底部，细胞细胞沉淀检散，加入相应体积的裂解液BB4（每1mlBB4加入10ulβ-巯基乙醇,现配现用），剧烈涡旋，直至细胞沉淀分散均匀。

（注意：

当细胞量《1*10^6,BB4用量0.3ml;当细胞量1*10^6《5*10^6,BB4用量0.6ml）

4.2.2均质化处理

用RNase-free的针管反复吹吸5-10次，使溶液合均匀质化，然后室温12000g离心5min,吸上清于一RNase-free的离心管中。

4.2.3RNA提取

4.2.3.1向上清中加入1倍体积的70%乙醇，涡旋彻底混匀，分散沉淀，将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000g离心30s，弃掉流出液。

4.2.3.2向离心柱中加入500ulCB4,室温12000g离心30s,弃掉流出液。

4.2.3.3去除基因组：

向离心柱中英加入80ul的DNaseI工作液，室温放置15min,向离心柱中再次加入500ulCB4,室温12000g离心30s,弃掉流出液。

4.2.3.4离心柱中加入500ulWB4,室温12000g离心30s，弃掉流出液；重复该步骤一次。

4.2.3.5室温12000g离心2min,彻底去除残留的乙醇，在室温敞开静置数分钟彻底晾干离心柱。

4.2.3.6将离心柱转入一个新的1.5mlRNase-free的离心管中，并向离心柱中英加入30-100ul37℃预温的RNase-freeWater，室温静置1min,然后室温12000g离心2min,洗脱RNA。

4.2.3.7利用Nanodrop检测所提RNA溶液浓度。

RNA溶液储存于-20℃或-80℃保存待用。

5记录

5.1《内外病毒RNA因子检测记录》

6修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人

/修订日期

病毒PCR法检测标准操作程序Ⅰ

1目的：

规范质量检验中用PCR法检测病毒核酸的标准操作程序

2范围：

细胞产品中内外病毒DNA的检测

3责任人：

技术部

4内容

4.1实验物品的准备

4.1.1仪器

Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统

4.1.2试剂

猪源病毒PCR试剂盒、HHV6/7试剂盒、牛细小病毒/牛腺病毒PCR试剂盒、琼脂糖

4.2实验步骤

4.2.1样品DNA的制备

用自选方法提取纯化样品的DNA，并检测DNA浓度，要求A260/A280在1.8-2.0之间；A260/A230大于2。

4.2.2对照设置

将试剂盒自带的阳性对照稀释1000倍，稀释后浓度为105拷贝/μL，作为阳性对照。

以ddH20作为阴性对照。

4.2.3PCR扩增

PCR体系如下：

成分

体积（μL）

2×PCRMagicMix3.0

病毒PCR引物混合液

DNA模板

ddH20

总体积

PCR程序如下：

过程

温度

时间

预变性

95℃

5min

PCR反应

（35个循环）

95℃

15sec

55℃

15sec

72℃

20sec

最后延伸

72℃

10min

4.2.4电泳检测

取5μLPCR产物，加样到1%琼脂糖凝胶进行电泳。

电压为120V，时间为30min。

电泳结束，利用凝胶成像仪拍照。

预期PCR产物阳性对照有相应的条带出现，阴性对照无任何扩增条带，否则实验无效。

5记录

5.1《内外病毒DNA因子检测记录》

6修订记录

序号

版本号

修订内容摘要

修订人/修订日期

病毒PCR法检测标准操作程序Ⅱ

1目的：

规范质量检验中用PCR法检测病毒核酸的标准操作程序

2范围：

细胞产品中病毒RNA的检测

3责任人：

技术部

4内容

4.1实验物品的准备

4.1.1仪器

Nanodrop微型分光光度计、离心机、PCR仪、水平电泳仪、凝胶成像系统

4.1.2试剂

牛病毒性腹泻病毒/牛副流感/牛呼肠弧病毒PCR试剂盒、琼脂糖

4.2实验步骤

4.2.1样品RNA的制备

用自选方法提取纯化样品的RNA，并检测RNA浓度.

4.2.2RNA质量鉴定

浓度为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件条件为：

电压120V，时间30min.电泳结果要求28s和18s条带清晰，且亮度符合2：

1.表明RNA完整。

4.2.3样品检测

4.2.3.1逆转录

逆转录体系：

试剂

用量（μL）

RNase-freewater

6.5

dNTP（2.5mMeach）

5×RTbuffer

BVDV_F/BVDV_R（10μM）a

各0.5

RibonucleaseInhibitor（50U/μL）

0.5

RNAb

ReverseTranscriptase

Total

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