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许毕业论文6
本科毕业论文
题目甘肃金鳟IGF-Ⅱ单核苷酸多态性分析
学院生命科学与学院技术
专业生物技术（制品方向）
毕业届别2012
姓名许尔柱
指导教师苏军虎
职称讲师
甘肃农业大学教务处制
二〇一二年五月
目录
摘要2
关键词2
Abstract3
Keyword3
引言3
1材料和方法4
1.1材料来源4
1.2引物设计与合成4
1.3基因组DNA的提取5
1.4PCR扩增反应5
1.5PCR变性5
1.6聚丙烯酰胺凝胶电泳5
1.7电泳结果处理5
2结果与分析6
2.1IGF-Ⅱ基因引物P5的SNPs分析6
2.1.1PCR扩增结果6
2.1.2SSCP检测结果6
2.2IGF-Ⅱ基因引物P6的SNPs分析7
2.2.1PCR扩增结果7
2.2.2SSCP检测结果7
2.3IGF-Ⅱ基因引物P7的SNPs分析7
2.3.1PCR扩增结果7
2.3.2SSCP检测结果8
2.4IGF-Ⅱ基因物P8的SNPs分析8
2.4.1PCR扩增结果8
2.4.2SSCP检测结果9
3讨论9
致谢10
甘肃金鳟IGF-Ⅱ单核苷酸多态性分析
许尔柱
（甘肃农业大学生命科学技术学院，兰州730070）
摘要：
甘肃金鳟是中国自主培育的虹鳟新品种，为进行其种质资源研究，以其尾鳍为试验材料，提取基因组DNA，通过PCR-SSCP技术对其IGF-2基因进行单核苷酸多态性分析。
经过对实验结果的分析，四种引物中P6引物所扩增的片段检测出存在突变点的基因型较多，我们应更加深入进行这方面的研究，以便能更好的为今后甘肃金鳟遗传改良、资源保护、开发利用和科学管理以及新品种的培育奠定基础。
关键词：
甘肃金鳟；单核苷酸多态性；胰岛素生长因子2
AnalysisofSingleNucleotidePolymorphismsinGansugoldenTroutIGF-2
XuErzhu
（CollegeofLifeScienceandTechnology,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070）
Abstract:
GansuRainbowTroutisaNewvarietiesofRainbowtroutwhichiscultivatedbychina,inordertoresearchitsGermplasmresources,wemakeitsCaudalfinastestmaterial,andextractgeonmicDNA,andanalyzeitsSingleNucleotidePolymorphismsofGeneIGF-2withthetechnologyofPCR-SSCP.Afteranalyzingtheresult,wethinktheprimerP6isthemostsuitableprimeroffourprimer,woshouldmakemoreresearchofGansugoldenTroutIGF-2,then,wocanLayafoundationofGeneticimprovement,resourceprotection,exploitationandscientificmanagementandthecultivationofnewvarietiesofGansugoldenTroutinfuture.
Keyword:
GansugoldenTrout；SingleNucleotidePolymorphisms；insulin-likegrowthfactor2
引言
甘肃金鳟是甘肃省水产科技工作者历经15年以虹鳟的突变体为材料选育而成的新品系[1]，是以冷水性鱼类虹鳟的突变体为材料选育而成的一个鱼类新品种,在分类学上属鲱形目、鲑科、鳟属[2]，2006年通过全国水产原种和良种审定委员会审定，其与目前国内外养殖的道氏虹鳟、日本金鳟相比，体色更艳丽，眼球血红具有很好的观赏价值，且性情温顺、生长快、抗病力强、耐氧低，是适应中国西北地区的特色冷水养殖品种2007年4月甘肃金鳟被农业部列为适宜在全国具冷水资源的地区养殖的优良品种。
甘肃金鳟优良的性状吸引了很多人的研究以期望对其进行改良从而更好的产生社会和经济效益，包括其人工繁育养殖技术[3]、生物学特性[4]、肌肉成分分析[5]等都研究的很全面和成熟了，而有关甘肃金鳟分子水平上的遗传特性研究,却很少有学者进行报道。
胰岛素样生长因子2（insulin-likegrowthfactor2,IGF2）作为胰岛素样生长因子家族成员之一,是一种促细胞分裂多肽,可介导生长激素发挥作用、刺激培养细胞生长,在发育中具有促生长的重要功能[6]。
本研究采用PCR技术、聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对IGF-2进行单核苷酸多态性分析，通过对相同品种、不同个体之间单个核苷酸的差异比对来评估甘肃金鳟人工养殖群体的遗传变异水平便于对其进一步改良提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料来源
实验材料实验用甘肃金鳟采自甘肃省临夏国家级鲑鳟鱼良种场，随机采集200尾（雌雄各半），剪尾鳍约0.5g，采用常规的酚氯仿法提取基因组DNA并测定其OD值，取100μL双蒸水溶解，再经1%琼脂糖凝胶电泳检测后确定纯度和浓度，检测完毕后取20uL基因组DNA保存于4℃的冰箱供使用，余80µL基因组DNA保存于-20℃的冰箱中备用。
主要试剂dNTP、Taq酶、10×TaqBuffer、Mg2+（购自大连宝生物公司）；引物合成（上海生工生物工程有限公司），蛋白酶K（ProteinaseK）购自MMERCK公司
1.2引物设计与合成
采用Primer5.0和oligo6.0引物设计软件，根据NCBI发表的虹鳟的的IGF-Ⅱ的cDNA序列分别设计4对引物用于甘肃金鳟IGF-ⅡSNP位点的查找。
表2-2甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因引物信息
Table.2-2TheprimersofIGF-ⅡgeneofGansugoldentrout
引物
Primer
上游/下游引物序列（5'-3'）
Primersequence（5'-3'）
产物长度（bp）
lengthofproducts
退火温度（℃）
annealingtemperature
用处
purpose
P5
F:
GCAACCTCTCCAACCAAA
R:
TCCACATAGCGTTTCTGCC
221bp
56.5℃
筛选SNPs位点
filterSNPssite
P6
F:
TATGTGGAGGAGAACTGGTGG
R:
TTGGCAGGTTTGGCACAG
181bp
59℃
筛选SNPs位点
filterSNPssite
P7
F:
GGTGCCCACAATCAAACAG
R:
TGGAACATCGCCTGCTCT
180bp
58.5℃
筛选SNPs位点
filterSNPssite
P8
F:
ATTTCTGTGGCAAGTCCTCGT
R:
TGTGTCGGTGAATGAAAGAGAGAG
224bp
59℃
筛选SNPs位点
filterSNPssite
注：
F是正向引物;R是反向引物。
1.3基因组DNA的提取
取0.5g尾鳍剪碎,加入500μL裂解液,37℃消化1h,之后加入蛋白酶K（20mg/mL）55℃消化12h,待冷却后加等体积酚饱和溶液缓慢转动混匀抽提,12000r/min离心5min,吸上清,用酚-氯仿-异戊醇（体积比25∶24∶1）抽提2次,最后用氯仿-异戊醇（体积比24∶1）抽提1次,将上清加入2倍体积的无水乙醇沉淀,12000r/min离心2min,再用无水乙醇洗涤2次,离心干燥机抽干,加入适量的1/10TE（10mmol/LTris-HCl,pH8.0;1mmol/LEDTA,pH8.0）缓冲液溶解,于-20℃保存备用.DNA浓度通过紫外分光光度计和电泳-EB染色的荧光强度双重测定.
1.4PCR扩增反应
采用优化后的PCR体系：
总体积25μL，含2.5μL5×buffer,d
NTP混合液0.5μL，taqE0.6μL，引物2μL，蒸馏水19μL,模版DNA1μL。
反应条件为：
94℃预变性4min,94℃变性45s，56.5℃、59℃、58.5℃、59℃复性50s、72℃延伸50s,共35个循环,最后72℃充分延伸7min.扩增反应物在1.4%琼脂糖凝胶中电泳,最后经EB染色,紫外透射仪上拍照.
注：
56.5℃、59℃、58.5℃、59℃复性50s分别对应引物P5、P6、P7、P8的复性温度。
1.5PCR变性
将扩增好的PCR产物2.5μL、变性buffer2.5μL混匀放入PCR仪进行PCR变性11分钟，变性温度为94℃。
1.6聚丙烯酰胺凝胶电泳
取PCR变性产物3μL滴于聚丙烯酰胺凝胶电泳加样孔，将电压设为80V，电流为60mA，进行电泳。
同时用冰袋围住电泳仪，直至电泳结束。
1.7电泳结果处理
电泳结束后，将制得的胶取出，先用固定液（40ml乙醇，360ml蒸馏水，2ml冰乙酸）固定8分钟，接着用染色液（硝酸银1g，无水乙醇50ml，乙酸2.5ml，定容至500ml）染色8分钟,再用显色液（氢氧化钠15g，定容至500ml）显色8分钟，显色前应在显色液里加2.5ml甲醛。
2结果与分析
2.1IGF-Ⅱ基因引物P5的SNPs分析
2.1.1PCR扩增结果
用引物P5对标记的甘肃金鳟所有个体进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度与预期的片段大小一致（221bp），且无非特异性扩增（见图3-10），可以直接进行SSCP检测。
500
300
200
100
图3-10引物P5对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因序列的扩增检测结果图
Fig.3-10ResultofthePCRfragmentsusingPrimersP5onGansuRainbowTrout
2.1.2SSCP检测结果
将PCR产物加变性上样缓冲液后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，4℃进行电泳，检测到IGF-Ⅱ第一外显子引物P5扩增片段中的突变点存在2种基因型AA和AC，未发现CC，结果（见图3-11）
图3-11引物P5对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因的PCR-SSCP检测结果
Fig.3-11DetectionofgeneIGF-ⅡinGansuRainbowTroutbyPCR-SSCP
2.2IGF-Ⅱ基因引物P6的SNPs分析
2.2.1PCR扩增结果
用引物P6对标记的甘肃金鳟所有个体进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度与预期的片段大小一致（181bp），扩增效果较为理想，目的条带明亮，且无非特异性扩增（见图3-12），可以直接进行SSCP检测。
500
300
200
100
图3-12引物P6对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因序列的扩增检测结果图
Fig.3-12ResultofthePCRfragmentsusingPrimersP6onGansuRainbowTrout
2.2.2SSCP检测结果
将PCR产物加变性上样缓冲液后用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶，4℃进行电泳，检测到IGF-Ⅱ外显子引物P6检测出了3种基因型CC、CD和DD，发现了突变位点（见图3-13）
图3-13引物P6对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因的PCR-SSCP检测结果
Fig.3-13DetectionofgeneIGF-ⅡinGansuRainbowTroutbyPCR-SSCP
2.3IGF-Ⅱ基因引物P7的SNPs分析
2.3.1PCR扩增结果
用引物P7对标记的甘肃金鳟所有个体进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度与预期的片段大小一致（180bp），且无非特异性扩增（见图3-14），可以直接进行SSCP检测。
500
300
200
100
图3-14引物P7对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因序列的扩增检测结果图
Fig.3-14ResultofthePCRfragmentsusingPrimersP7onGansuRainbowTrout
2.3.2SSCP检测结果
将PCR产物加变性上样缓冲液后经95℃变性骤冷后，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶在4℃冰箱中进行电泳，检测到IGF-Ⅱ外显子引物P7扩增的片段无多态性，结果如图3-15。
图3-15引物P7对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因的PCR-SSCP检测结果
Fig.3-15DetectionofgeneIGF-ⅡinGansuRainbowTroutbyPCR-SSCP
2.4IGF-Ⅱ基因物P8的SNPs分析
2.4.1PCR扩增结果
用引物P8对标记的甘肃金鳟所有个体进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段长度与预期的片段大小一致（180bp），且无非特异性扩增（见图3-16），可以直接进行SSCP检测。
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200
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图3-16引物P8对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因序列的扩增检测结果图
Fig.3-15ResultofthePCRfragmentsusingPrimersP8onGansuRainbowTrout
2.4.2SSCP检测结果
将PCR产物加变性上样缓冲液后经95℃变性骤冷后，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶在4℃冰箱中进行电泳，检测到IGF-Ⅱ外显子引物P8扩增的片段无多态性，见图（3-17）
图3-17引物P8对甘肃金鳟IGF-Ⅱ基因的PCR-SSCP检测结果
Fig.3-16DetectionofgeneIGF-ⅡinGansuRainbowTroutbyPCR-SSCP
3讨论
甘肃金鳟是虹鳟突变体选育而成的新品种，而利用DNA遗传标记进行辅助选育已经成为动物选育种的新方法[7]，因此开展其相关分子生物学的研究，能为种质资源的有效利用和种质创制提供理论基础和依据，但已知的对甘肃金鳟基因组DNA序列信息的研究目前报道很少[8]，因此对分子水平遗传背景了解不足的甘肃金鳟,PCR-SSCP就有很着很大的优势了。
通过PCR-SSCP研究甘肃金鳟的单核苷酸多态性，基因组DNA的质量是基本的要求，模板质量将影响酶切、连接等效果。
但选取甘肃金鳟的尾鳍组织，采用常规的方法，已有相关基因组的提取报道[9]，同时用分光光度计进行了质量及纯度鉴定和检验，确保了试验较好的效果，因而保证了实验结果的可靠性。
从不同引物的SSCP检测结果可以看出P7.P8引物没有扩增出具有多态性的片段，由此可见这两种引物对甘肃金鳟IGF-2基因组单核苷酸多态性的研究价值不大，而P5，P6分别出现了2种，3种基因型，可见P6引物对甘肃金鳟IGF-2基因组单核苷酸多态性的研究更具有价值，这就为甘肃金鳟的遗传改良、资源保护、开发利用和科学管理以及新品种的培育奠定了基础。
参考文献：
[1]杨树军,刘敬杰.甘肃金鳟的选育方法与生长性能比较[J].中国水产,2008,6:
42-43.
[2]张艳萍,王海芳,苏军虎,等.甘肃金鳟、日本金鳟和道氏虹鳟的随机扩增多态DNA分析[J].甘肃农业大学学报.2008,43（3）:
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[3]钱续.革丽靬金鳟形态学特性的初步研究[J].淡水渔业,2005,35（5）:
31-32.
[4]钱续,刘孝玉,敬培石,等.革丽靬金鳟血液学指标的测定[J].河北渔业,2006,3:
16-18.
[5]刘哲,张昌吉,王欣,等.革丽靬金鳟含肉率及肌肉营养成分分析[J].淡水渔业,2004,34（6）:
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[6]常怀普,欧江涛,钟金城,等五指山猪IGF2基因5'调控区单核苷酸多态性分析[J].HEREDITAS（Beijing），2007，29
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57-64
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[8]苏军虎，张艳萍，杨建宝，等甘肃金鳟AFLP体系建立及应用[9].中国农学通报,2011,27（7）:
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[9]ZabeauM,VosP.Selectiverestrictionfragmentamplification:
ageneralmethodforDNAfingerprinting[P],EuropeanPatentApplication924402629.7（Publicationno:
EP0534858）,EuropeanPatentOffic,Paris.
致谢
感谢苏军虎老师的关心，感谢杨建宝师兄的细心指导。
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