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英文文献翻译38634069

十溴联苯醚与四溴双酚A的复合物对土壤微生物和酶活性的毒性效应研究

张卫，陈磊，安帅,刘怐，林匡飞，赵丽

摘要:

十溴联苯醚和四溴双酚A是生态垃圾回收站点中主要的污染物,并且他们潜在的毒性效应已经引起广泛的关注。

然而,这两种物质的复合物对土壤可培养微生物种群以及酶活性的影响仍然是未知的。

因此,本文首次通过实验室孵化试验，将未污染的土壤样本与受土壤污染的样本在十溴联苯醚和四溴双酚A的复合作用下产生的毒理学效应进行对照。

结果证明，毒理学效应的产生是由于土壤长期暴露在一种或两种污染物中。

微生物种群的抑制率随着培养时间延长和污染物浓度增大而逐渐增大，并且表现出明显的剂量和时间效应关系。

反应灵敏度排序依次为：

真菌>细菌>放线菌。

这两种化学物质对土壤酶的影响达到峰值7天,这与对照组的观察有着显著的差异（P<0.01）。

对于这两种化学物质，脲酶比过氧化氢酶和蔗糖酶更敏感。

一般来说,这两种污染物的复合作用对土壤微生物、过氧化氢酶或蔗糖酶的活性产生相反的效果。

然而,对于脲酶的活性,四溴双酚A的影响占主导地位。

这样的观察结果为解决溴化火焰阻燃剂对生态环境的潜在污染提供了有用的信息。

关键词：

十溴联苯醚；四溴双酚A；土壤微生物；土壤酶；复合效应

1.引言

随着各种电器、电子设备的不断更新换代，电子垃圾的产生速度也越来越快，或者由于科学技术的快速和持续的改善,他们都将被更好的电子设备替代，更多的电子垃圾将被处理。

据估计,全球50%-80%的电子垃圾通过合法或非法的途径被输送到亚洲，其中90%的被运往中国。

然而,由于缺乏有效的回收技术和足够的设备处理大量的电子垃圾,在中国，许多的电子垃圾回收站点的土壤受到严重的污染。

大约75%的商用溴化火焰阻燃剂目前正用于全球范围生产耐火电子设备。

十溴联苯醚和四溴双酚A是溴化阻燃剂的主要成分,他们主要存在于预警雷达附近的土壤和沉积物中。

此外，从中国南部的东江河核心处收集的浓度分别从3.8到230ng/g蒸馏水的第15层表面沉积物及浓度从30到5700ng/g蒸馏水的第二层表面沉积物样品中都发现了四溴双酚A和十溴联苯醚。

十溴联苯醚在燃烧残渣和土壤样品中的浓度分别为33000至97400、2020至4250ng/g蒸馏水，并且十溴联苯醚毒性作用的影响仍然在同类污染物中占主导地位（35-82%）。

一些报道已经证明十溴联苯醚和四溴双酚A独自地存在于土壤中,它们的生物利用度虽然很低,却能产生负面影响。

还有少量的研究正探索溴联苯醚和重金属（比如镉和铜）的复合作用对土壤微生物的影响，并将这种复合作用引起的不同反应与仅接触十溴联苯醚的反应相比较。

然而,尽管四溴双酚A和十溴联苯醚都产生了很强的毒性作用，并且是许多预警雷达附近的主要有机污染物，但人们对它们的复合作用一直没有研究。

土壤是微生物之间的复杂交互的关系的生态系统。

大量的土壤微生物参数,特别是微生物数量、酶活性、微生物群落结构,一直是评价道路土壤环境质量的指标,并且在国家和国际的监控程序中扮演重要的角色。

为了提供这两种化学物质复合作用的影响的基础数据,本研究主要是探讨十溴联苯醚和四溴双酚A复合作用的毒理学效应对土壤可培养微生物的数量和酶活性的影响。

观测结果将建立在预警雷达附近土壤的生态风险评估基础上的一些有用的科学依据。

2．实验材料和方法

2.1实验试剂

试剂十溴联苯醚和四溴双酚A（纯度>99.0%）来自中国上海J&K科学有限公司。

甲苯、丙酮和其他试剂来自中国上海展云化工有限公司。

2.2孵化测试的实验设计

本实验所采用的土壤（粉砂质粘壤土,6.5%的有机物,pH值7.3）来自于中国浙江台州的预警雷达附近。

实验中,待土壤充分混合后，鹅卵石和大型植物残留物都将被移除,然后再使用一个2毫米筛土器进行细筛。

将四溴双酚A粉末倒入在丙酮溶液中，将十溴联苯醚粉末倒入在甲苯溶液中，充分摇匀且溶解。

在各个10ml的组织培养瓶中分别加入5g土壤样本,培养瓶中的土壤样本迅速暴露在污染物十溴联苯醚和四溴双酚A中。

为了确定暴露浓度,在以往关于这些化合物的毒性信息的基础上,我们进行了一些初步的实验。

如表一所示，分别对污染物/剂量做不同的处理,即进行低、中和高剂量暴露测试（低剂量:

1mg/kg十溴联苯醚，1mg/kg四溴双酚A；中等剂量:

10mg/kg十溴联苯醚，10mg/kg四溴双酚A；高剂量:

100mg/kg十溴联苯醚，100mg/kg四溴双酚A）。

在不同的处理方法中，这两种化学物质的水平表示方法分别如下：

1T（即表示1mg/kg四溴双酚A）,10T,100T,1B（即表示1mg/kg十溴联苯醚）,10B，100B,1T1B（即表示1mg/kg十溴联苯醚，1mg/kg四溴双酚A），1T10B，1T100B，10T1B，10T10B，10T100B，100T1B，100T10B和100T100B。

每个处理组都设计三个重复。

对照组（无污染物）用相同剂量的蒸馏水代替污染物。

所有处理方法都是在室温下进行,并且保存在完全黑暗的环境中。

在孵化实验进行至7、30、60天时分别采集土壤样本进行进一步分析。

表一：

污染物十溴联苯醚和四溴双酚A的不同水平处理

污染物

处理（mg/kg蒸馏水）

对照组1B10B100B1T10T100T

十溴联苯醚

0

110100110100

四溴双酚A0000110100

污染物处理（mg/kg蒸馏水）

1T1B1T10B1T100B10T1B10T10B10T100B100T1B100T10B100T100B

十溴联苯醚

110100110100110100

四溴双酚A111101010100100100

2.3微生物计数

本实验土壤微生物的计数运用传播板计数法。

土壤真菌菌落的培养用马丁氏培养基（1L）:

葡萄糖10g,蛋白胨10g,磷酸二氢钾1g,七水硫酸镁0.5g,琼脂18g,1/3000玫瑰红溶液100ml,0.03%链霉素溶液100ml,无菌水800ml;以10−1-10−3稀释土壤样本作为接种体，待菌落在30℃下孵化5天后进行计数。

土壤细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养（1L）:

牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化钠5g,琼脂18g,无菌水1L,在pH7.2-7.4下;以10−5-10−7稀释土壤样本作为接种体，在28℃下培养三天后，用细菌混合板法进行计数。

土壤放线菌的培养用高氏琼脂培养基（1L）:

可溶性淀粉10g,硫酸铵2g,磷酸二氢钾1g,七水硫酸镁1g,氯化钠7g,碳酸钙3g,琼脂18g,无菌水1L,在pH7.2-7.4下，以10−3-10−5稀释土壤样本作为接种体，待菌落在30℃下孵化5天后进行计数。

所有的培养基都要在120℃高压蒸汽罐中灭菌20min。

对照组中无悬浮土壤的培养基仍需进行比较。

2.4酶的活性分析

蔗糖酶是利用关博士描述的方法进行分析的。

将5g土壤样本添加到50ml锥形烧瓶中,然后再向瓶中添加15ml8%的蔗糖溶液、5ml的pH值5.5的磷酸缓冲溶液和5滴甲苯溶液。

将锥形瓶密封并摇匀,然后放置在37℃恒温培养箱中培养24h。

孵化实验后,将1ml的滤液投入50ml容量瓶中,再加入3ml的3,5-二硝基水杨酸,然后将容量瓶放置于100℃水浴锅中加热5min,水浴后立即置于自来水下冷却3min;最后用蒸馏水将其定容至50ml，再使用分光光度计508测量它的光吸收率。

在滴定中通过高锰酸钾的用量来分析过氧化氢酶的活性是十分必要的。

将5g土壤样品投入150ml锥形瓶中,再向瓶中添加40ml蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢溶液。

将锥形瓶密封并摇匀,然后轻轻地放在37℃水浴锅中加热30min。

随后,缓慢添加5ml3mol/l硫酸溶液直至反应终止。

25ml滤液中剩余的双氧水使用0.02mol/l的高锰酸钾滴定。

脲酶的活性是通过氨与苯酚-次氯酸钠反应生成蓝色的靛酚含量来表征的。

将添加了5ml10%的尿素和10ml柠檬酸缓冲液的5g的土壤样品置于37℃下培养24h,然后用50ml38℃蒸馏水稀释。

将1ml的过滤液投入50mL容量瓶中,然后用蒸馏水稀释至10ml,再加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液。

最后将锥形瓶密封并摇匀,20分钟后在578nm处测量光吸收值。

所有酶的活性分析使用的都是潮湿的土壤样本。

在反应停止后且过滤土壤悬浮液之前在空白组中加入基质。

所有情况下恢复率均>95%。

2.5数据评估及建模

微生物种群对十溴联苯醚和四溴双酚A的抑制率（IR）的计算如下式

（1）:

X表示被污染土壤的数值和Y表示对照组土壤的数值。

结果表示的是重复的三组混合土壤平行测定的平均值。

一般来说,多项式模型是解释不同的重要独立变量的复合效应的首选,因此它被认为是来描述选择的两个独立变量对酶活性和微生物种群的抑制率影响的一个模型（十溴联苯醚和四溴双酚A浓度）。

该模型表示为式

（2）:

Y是土壤微生物数量和酶活性的预测值；X是独立变量十溴联苯醚和四溴双酚A对应的浓度；ε是不规则误差；β0是一个常数，也可以称为截距；βij和βi是通过逐步回归方法推算出的回归系数，其置信区间是95%。

通过的βij正负可以表示污染物间的相互作用类型,为正时表明两污染物间的相互作用类型为协同作用,为负时表示拮抗作用,当βij=0时说明两污染物间的相互作用类型是相加作用,βij的大小则反映了污染物作用的强弱。

所有实验数据,意味着三个复制、线性回归和逐步线性回归的进行使用SPSS统计软件包（版本.15.0）。

多重比较是通过方差分析和图基测试来统计评估的。

3.结果

3.1十溴联苯醚和四溴双酚A对土壤可培养微生物种群的影响

表二阐述了土壤可培养微生物种群在十溴联苯醚和四溴双酚A中暴露60天后的影响。

一般来说,在整个孵化实验期间,这三种微生物种群的抑制率随着培养时间延长和十溴联苯醚和四溴双酚A的浓度增大而逐渐增大，并且表现出明显的剂量和时间效应关系。

在第一个7天内,单一或联合暴露在污染物中，都导致三种土壤微生物数量的增加,显示明显的刺激效应。

培养30天后，这两种溴化阻燃剂仍能促进可培养土壤细菌的数量增加,然而,100mg/kg四溴双酚A和所有水平十溴联苯醚的结合都抑制真菌生长；放线菌类暴露于100mg/kg的十溴联苯醚中或它与四溴双酚A的结合物中也显示抑制性影响。

培养60天后，真菌的生长显然受到各种化学物质的抑制作用,而只有高剂量的十溴联苯醚和四溴双酚A及其组合能减少细菌和放线菌的数量。

数据分析显示的土壤微生物的敏感性排序如下:

真菌>细菌>放线菌。

表二：

十溴联苯醚和四溴双酚A对土壤可培养微生物种群的影响

细菌种群的抑制率

处理

7天

30天

60天

1T−14.4012±0.1103−3.6429±0.0665−0.5260±0.0182

10T−12.5627±0.3141−2.5952±0.0646−0.4761±0.0164

100T−1.0316±0.0258−0.5011±0.06080.3105±0.0107

1B−16.9142±0.4229−2.0476±0.0109−0.5562±0.0192

10B−14.6444±0.3661−1.8143±0.0289−0.4533±0.0174

100B−4.2018±0.0551−1.0395±0.01250.2709±0.0103

1T1B−16.3131±0.4078−2.0667±0.0068−0.5688±0.0196

1T10B−14.6986±0.3675−0.9638±0.0011−0.5530±0.0191

1T100B−2.4662±0.0617−0.6290±0.00480.0306±0.0101

10T1B−14.9417±0.3735−1.9538±0.0212−0.5590±0.0193

10T10B−13.1791±0.3295−0.6243±0.0187−0.4879±0.0169

10T100B−1.7802±0.0445−0.3167±0.00680.0865±0.1032

100T1B−1.9875±0.0497−0.2714±0.1029−0.0515±0.0118

100T10B−1.4730±0.0326−0.0857±0.0116−0.0060±0.0122

100T100B−0.9176±0.3044−0.2524±0.01830.5409±0.0225

真菌种群的抑制率

处理

7天

30天

60天

1T−3.6901±0.0878−0.0486±0.02190.0607±0.0157

10T−1.6026±0.0381−0.0376±0.01040.1071±0.0161

100T−0.3537±0.0284−0.0201±0.01530.2998±0.0454

1B−0.5912±0.0116−0.2194±0.01950.3071±0.0174

10B−0.4509±0.0184−0.1782±0.01670.3714±0.0197

100B−0.3003±0.0199−0.1201±0.01590.4015±0.0243

1T1B−0.5365±0.1048−0.4022±0.01240.1285±0.0187

1T10B−0.4301±0.1063−0.2138±0.01810.2326±0.0173

1T100B−0.3932±0.0161−0.1219±0.10580.4856±0.0276

10T1B−0.5419±0.0146−0.1776±0.01670.2928±0.0166

10T10B−0.3635±0.0207−0.1411±0.20540.3071±0.0174

10T100B−0.1889±0.0085−0.0265±0.00670.4203±0.0121

100T1B−0.1897±0.01040.0727±0.01040.1357±0.0134

100T10B−0.1541±0.01010.0959±0.00740.2159±0.0232

100T100B−0.0863±0.01070.1858±0.01330.2871±0.0118

放线菌种群的抑制率

处理

7天

30天

60天

1T−6.5112±0.2331−1.1406±0.0648−0.4001±0.0086

10T−6.4688±0.2316−1.0302±0.0699−0.3636±0.0156

100T−5.3564±0.3707−0.3828±0.0217−0.2818±0.0250

1B−5.8575±0.2097−2.7240±0.1547−0.9091±0.0391

10B−5.6262±0.2014−2.3345±0.1326−0.8909±0.0383

100B−3.3354±0.11940.1318±0.03590.1800±0.0344

1T1B−5.8609±0.2098−2.7220±0.1546−0.8364±0.0359

1T10B−4.6084±0.2008−2.3362±0.1327−0.81015±0.0365

1T100B−2.2388±0.08020.4136±0.02920.6588±0.0323

10T1B−6.0053±0.2150−2.6495±0.1505−0.9269±0.0355

10T10B−5.7230±0.2049−2.3174±0.1316−0.8914±0.0325

10T100B−2.3829±0.08530.6821±0.03880.7636±0.0328

100T1B−4.9331±0.1766−2.0888±0.1186−0.6909±0.0297

100T10B−2.7309±0.2052−1.8775±0.1066−0.5364±0.0274

100T100B−1.5444±0.77120.5661±0.04350.8612±0.0266

多项模型被用来关联剂量和在这三个孵化期获得的数据。

如表3所示,βij值几乎对所有的处理组呈负面影响,表明这两种污染物的复合作用是敌对的。

然而孵化实验60天后显示，复合效应对真菌有额外的作用。

表三：

多元回归模型分别对三种土壤微生物的抑制率（Y）增长与暴露在四溴双酚A（X1）和十溴联苯醚（X2）浓度关系的总结

土壤种群

孵化时间

多元回归模型

R2

Sig.

7Y=0.144X1+0.129X2−0.001X1X2−15.8200.886<0.05

细菌30Y=0.018X1+0.014X2−7.9×10−5X1X2−2.1290.747<0.05

60Y=0.007X1+0.007X2−4.6×10−5X1X2−0.5830.944<0.05

7Y=0.04X1+0.01X2−5×10−5X1X2−0.4950.879<0.05

真菌30Y=0.005X1−0.001X2−3.2×10−5X1X2−0.1520.898<0.05

60Y=−0.006X1−0.006X2+0.2380.756<0.05

7Y=−0.005X1+0.041X2−0.002X1X2−6.0820.906<0.05

放线菌30Y=0.008X1+0.029X2−6.9×10−5X1X2−2.3240.798<0.05

60Y=0.001X1+0.016X2−2.8×10−5X1X2−0.7990.844<0.05

过氧化氢酶活性

ml高锰酸钾/g土壤

过氧化氢酶活性

ml高锰酸钾/g土壤

孵化时间

图一：

土壤样本中的过氧化氢酶的活性在单个或十溴联苯醚和四溴双酚A的复合作用下的影响

3.2十溴联苯醚和四溴双酚A对土壤酶活性的影响

总的来说,与对照组相比，这两种污染物对三种土壤酶的毒性效应在培养的第一个7天内达到高峰。

图1.展示了土壤样本中的过氧化氢酶的活性在单个或十溴联苯醚和四溴双酚A的复合作用下的影响。

孵化培养7天后,所有样本中的过氧化氢酶的活性都被促进,在暴露于单一的十溴联苯醚或高水平的四溴双酚A的处理中观察到了高度显著性差异（P<0.01）,并且在四溴双酚A和高浓度的十溴联苯醚的复合作用下也显示同样的趋势。

随着曝光时间的延长,这两种溴化阻燃剂几乎对所有处理组都有影响，然而这一现象也表明,它们并没有显著差异。

图2.的数据说明在培养7天后,与对照组相比，单一的十溴联苯醚或十溴联苯醚与四溴双酚A的复合作用极其显著地抑制土壤脲酶的活性。

此外,随着十溴联苯醚浓度的增加，暴露在这两种化学物质中的脲酶的活性降低。

在培养的第30天,处理组中除了单一的1mg/kg四溴双酚A和十溴联苯醚以及1mg/kg的四溴双酚A和十溴联苯醚的联合处理组,所有的样品都显示抑制效果。

从处理组1mg/kg的四溴双酚A、单一的100mg/kg的十溴联苯醚或它与10mg/kg及100mg/kg的四溴双酚A的联合处理组中观察到极其显著的差异。

培养60天后,100mg/kg的十溴联苯醚和它与100mg/kg的四溴双酚A及各水平的十溴联苯醚的处理组都显示显著的抑制效应（P<0.01）。

脲酶活性

ml氨态氮/g土壤

孵化时间

脲酶活性

ml氨态氮/g土壤

孵化时间

图二：

土壤样本中的脲酶在单个或十溴联苯醚和四溴双酚A的复合作用下的活性

图3.展示了土壤蔗糖酶在60天实验中的活性。

可以看出，短期的暴露引起更多的抑制，然后随着孵化期延长,抑制效应逐渐恢复。

在培养的前30天内，单一处理的100mg/kg的十溴联苯醚或四溴双酚A以及它们的联合作用处理组都显示显著差异,而且通常抑制作用随着浓度的增加而增加。

培养60天后,除了100mg/kg的十溴联苯醚和四溴双酚A联合处理组显示显著地抑制效应（P<0.01）,其他处理组的效应都与对照组相似。

蔗糖酶活性

ml葡萄糖/g土壤

孵化时间

蔗糖酶活性

ml葡萄糖/g土壤

孵化时间

图三：

土壤样本中的蔗糖酶在单个或十溴联苯醚和四溴双酚A的复合作用下的活性

从多元回归和逐步回归模型的结果分析，两种化学物质对三种土壤酶活性的联合效应如表4所示。

数据分析表明,十溴联苯醚可能比四溴双酚A发挥更重要的作用。

在整个60天曝光培养期间，除了在第七天观察的对蔗糖酶活性的协同作用，这两种溴化火焰阻燃剂对过氧化氢酶和蔗糖酶活性的联合毒性作用是相反的。

然而,这两种化学物质的联合作用对脲酶活性的影响表现出不同的趋势，并且毒性添加（第7天和第60天）或协同（第30天）作用占主导地位。

表四：

多元回归模型分别对三种土壤酶的抑制率（Y）增长与暴露在四溴双酚A（X1）和十溴联苯醚（X2）浓度关系的总结

土壤种群

孵化时间

多元回归模型

R2

Sig.

7Y=0.001X2−5.8×10−6X1X2+0.3020.768<0.05

过氧化氢酶30Y=7.85×10−6X2−1.4×10−6X1X2+0.3470.774<0.05

60Y=−1.4×10−6X1X2+0.2570.875<0.05

7Y=−0.002X1+0.064X2+12.1940.751<0.05

脲酶30Y=−0.017X1−0.034X2+4.28×10−5X1X2+13.890.748<0.05

60Y=−0.018X1−0.020X2+15.0350.742<0.05

7Y=−3.008X1−3.651X2+0.046X1X2+932.1340.803<0.05

蔗糖酶30Y=−0.305X1−1.35X2−0.011X1X2+1053.9770.814<0.05

60Y=−0.072X1+0.422X2−0.038X1X2+1086.5240.919<0.05

4.讨论

原则上，使用微生物属性作为检测土壤污染的指标的有许多可取之处。

微生物同时拥有数量和活性,，并且与土壤微环境亲密接触，所以在很多方面，它是理想的检测土壤污染的指标。

目前，各研究正探索单一的十溴联苯醚或四溴双酚A及它们的联合毒性作用对土壤可培养微生物种群和酶活性的影响。

结果表明，与对照组相比，在大多数样品处理后微生物种群增加。

有忍耐力的微生物在污染环境中丰度的增加可能是由于基因变化，生理适应性包括未改变基因型，或用对污染物高度适应的的物种