动物生化实验技术指导书.docx
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动物生化实验技术指导书
动物生化实验技术指导书
实验一底物浓度对酶活性的影响
——碱性磷酸酶米氏常数的测定
一、实验原理
⒈在温度、pH和酶浓度一定时，底物浓度对酶活性（V）的影响，可用米氏方程表示为：
V=
式中Vmax为最大反应速度，Km表示米氏常数，[S]表示底物浓度，当V=
Vmax时，Km＝[S]。
Km是酶的特征性常数，测定酶的Km值是研究酶性质的重要方法之一。
大多数酶的Km值在0.01－100mM之间。
对于不同的底物，酶有不同的Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定在不同底物浓度时酶活性的变化。
然后再分别以
为横座标，以
为纵座标作图，从图上可以方便地求出碱性磷酸酶的Km值。
⒉在本实验中，利用分光光度比色法测定酶的活性。
碱性磷酸酶可作用于多种底物。
当它作用于磷酸苯二钠时，释放出酚。
酚在碱性溶液中与4－氨基安替比林作用，并经铁氰化钾氰化生成红色的醌类化合物，该化合物在510nm处有显著光吸收。
与标准酚的溶液作对照或制作标准曲线，可计算出在不同底物浓度时酶的活性。
显色反应的原理如下：
二、试剂：
⒈酚贮存标准液：
溶解（AR）酚1g于0.1mol/L盐酸中，用0.1mol/L盐酸稀释至1L。
此酚溶液含量约为1mg/mL。
须进行标定。
标定方法见上海市医学化验所主编《临床生化检验》上册第十章，酚类测定。
⒉酚应用标准液（0.1mg/mL）：
使用前将酚贮存标准液用蒸馏水稀释10倍。
此液只能保存2～3天。
⒊0.1mol/L碳酸缓冲液（pH=10）：
溶解3.18g无水碳酸钠和1.68g碳酸氢钠于500mL蒸馏水中。
⒋0.5mol/LNaOH500mL。
溶解10gNaOH于500mL蒸馏水中。
⒌0.01mol/LTris-醋酸缓冲液（pH=8.8）：
配制0.1mol/LTris溶液100mL，另配制0.1mol/L的醋酸镁溶液100mL。
将二种溶液混合，加蒸馏水至900mL。
用1％醋酸调节pH至8.8，再用蒸馏水加至1L。
⒍0.5％铁氰化钾溶液：
分别溶解5g铁氰化钾和15g硼酸于二份400mL蒸馏水中，将二种溶液混合，加蒸馏水至1L，棕色瓶保存。
⒎0.3％4－氨基安替比林溶液：
溶解3g4－氨基安替比林和42g硫酸氢钠于1000mL蒸馏水中。
置棕色瓶中冰箱保存。
⒏0.04mol/L底物溶液：
溶解10.16g的磷酸苯二钠（含二个结晶水）于1000mL煮沸冷却的蒸馏水中，加氯仿数滴，贮于棕色瓶中，冰箱保存，可用一周。
⒐5mg/100mL碱性磷酸酶溶液：
溶解5mg碱性磷酸酶（Sigma,No.3877）于100mLpH=8.8Tris-醋酸缓冲液中，冰箱保存。
三、操作
⒈酶反应进程曲线的制作。
该曲线有助于找到合适的酶反应时间以测定初速度，以及估计出合适的酶量与底物浓度，为米氏常数测定作准备。
A．取五支试管，编号，依次加入0.4mL底物溶液，0.9mL碳酸缓冲液，0.6mL蒸馏水。
另取同样数量的试管，编号，作为空白对照管，用蒸馏水代替底物溶液。
B．充分混匀，置37℃水浴中，保温5分钟。
C．在各管中加入碱性磷酸酶溶液0.1mL，立即混匀，在37℃水浴中，分别准确反应5，10，15，20，25分钟。
D．反应用1.0mL0.5mol/L的NaOH终止，接着依次加入1.0mL4－氨基安替比林，2.0mL铁氰化钾溶液，充分混匀，10分钟后，测定OD510或A510。
E．分别以OD510为纵座标和反应时间为横座标，画出酶反应进程曲线。
⒉米氏常数的测定
取8支试管，编号，按下表操作，注意准确吸取酶和底物的量。
0
1
2
3
4
5
6
标准管
0.04mol/L底物（mL）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.8
1.0
0
pH10碳酸缓冲液（mL）
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
蒸馏水
（mL）
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.2
0
1.0
混匀，37℃保温5分钟
酚标准应用液（mL）
0
0
0
0
0
0
0
0.1
酶液（mL）
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0.1
0
充分混匀，37℃准确反应10分钟（勿超过37℃）
终止反应的方法，同操作
（1）中所述，以0号管为空白对照，测定各管的OD510，记录结果。
四、结果：
⒈计算出各管的底物浓度[S]，用mM表示。
⒉利用公式：
＝
C为浓度，计算出各管的酶活性U，用酶活力单位数表示。
本实验中，定义在37℃下，10分钟产生1mg酚为一个酶活力单位。
⒊将米氏方程式转化为Lineweaver-Burk方程式，得
=
·
＋
。
以
为横座标，以
为纵座标作图。
为直线斜率。
纵坐标的截距为
，直线与横座标相交于
，以求得Km值。
实验二蛋白质浓度测定――双缩脲法
目的要求
学习双缩脲法测定蛋白质的原理和方法。
原理
具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中，能与Cu2＋形成紫红色络合物，颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，故可用来测定蛋白质的浓度。
试剂和器材
一、测试样品
⒈标准蛋白溶液
10mg/mL牛血清白蛋白溶液或相同浓度的酪蛋白溶液（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）。
作为标准用的蛋白质要预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度称量、配制成标准溶液。
⒉测试样品液
犊牛（鸭）血清（稀释10倍）。
测定其它蛋白样品应稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。
二、试剂
双缩脲试剂：
将0.175g硫酸铜（CuSO4·5H2O）溶于15mL蒸馏水，置于100mL容量瓶中，加30mL浓氨水，30mL冰冷的蒸馏水和20mL饱和NaOH溶液，摇匀，室温放置1－2小时，再以蒸馏水定容至100mL后，摇匀，备用。
三、器材
试管、试管架、恒温水浴锅、752型分光光度计
操作方法
一、标准曲线的绘制
取6支干试管，按下表操作。
0
1
2
3
4
5
标准蛋白液（mL）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蛋白浓度
（mg/mL）
0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
蒸馏水
（mL）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
双缩脲试剂（mL）
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
4.0
充分混匀后，室温下（20－25℃）放置30分钟
测A540值
以A540为纵座标，蛋白质浓度为横座标，绘制标准曲线。
二、样品测定
取2支试管，按下表操作。
试管
0
1
血清稀释液（mL）
0
0.5
蒸馏水（mL）
1.0
0.5
双缩脲试剂（mL）
4.0
4.0
充分混匀后，室温下（20－25℃）放置30分钟
A540
三、计算
血清样品蛋白质含量（g/100mL血清）＝
×10－3×100
固体样品蛋白质含量（％）＝
×100％
其中，Y为标准曲线查得蛋白质的浓度（mg/mL），N为稀释倍数，V为血清样品所取的体积（mL），c为样品原浓度。
注意事项
（1）本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。
本实验测定范围1－10mg/100mL血清蛋白质。
（2）须于显色后30分钟内比色测定。
30分钟后，可有雾状沉淀发生。
各管由显色到比色的时间应尽可能一致。
（3）有大量脂肪性物质存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取清液再测定。
实验三糖的薄层层析
一、原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差别（如吸附力，溶解度，分子形状、大小和极性等），使各组分以不同的程度分布在两相中。
其中固定不动的称固定相，流过此固定相的液体或气体称流动相。
从而使各组分以不同的速度随流动相向前移动而达到分离的目的。
20世纪初发现植物中各种颜色的色素可以在吸附柱上流动后排列成色谱，从而可以分离提取植物色素，故称为色谱分离法。
后来无色物质也可利用吸附柱分离。
1944年开始用滤纸作为固定相出现了纸层析后，层析法不断发展，成为生物化学中最常用的方法之一。
根据其层析过程的机理不同，层析可分为以下几种：
（1）吸附层析：
利用吸附剂对各种物质吸附能力的不同，来达到分离的目的。
（2）分配层析：
利用各种不同的物质在二种不同溶剂中的分配系数的不同而达到分离的目的。
（3）离子交换层析：
是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力，而使其达到分离的目的。
（4）凝胶层析（分子筛层析）：
是根据混合物中各种分子的大小及形状不同，通过凝胶时，分子的扩散移动速率各异，而使大小不同的分子得到分离。
（5）亲和层析：
是利用高分子物质能与相应的配基特异性的可逆结合的原理而进行分离。
层析法又按操作的方式不同，可分为柱层析、纸层析和薄层层析等。
硅胶具有吸附其它物质的性能，而且它对各种糖的吸附能力是各不相同的。
本实验就利用这种吸附能力的差异，将硅胶在玻璃板上均匀地铺成薄层，而后将糖的混合液点在薄层上，再用乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸和水按一定比例构成的混合液为展开剂进行层析，能使混合的糖分离。
再用Molish氏反应使糖显色，其反应式如下：
糖
→糖醛（或糖醛的衍生物）
糖醛（或糖醛衍生物）＋α－萘酚（1-萘酚）→紫红色物质
层析的结果，可测得被测物质的Rf值。
Rf值是用来表示物质被分离后位置的数值，即物质的迁移率。
它是被测物质的移动距离与溶剂移动距离之比。
一般应用同一吸附剂和同一溶剂系统展开时，其Rf值应相对恒定。
因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
但是被测物质Rf值尚与所用的操作方法、吸附剂的性质、薄层的厚度、溶剂的质量、滴加样品的数量、以及层析缸中蒸汽的饱和度等条件有关。
为了避免上述因素的影响，一般都使用已知样品与被测样品在同一薄层上，在相同条件下层析，对照所得的Rf值而进行定性鉴定。
二、试剂
（1）硅胶G
（2）2％乳糖溶液
（4）2％葡萄糖溶液
（5）2％乳糖、2％葡萄糖等体积的混合液
（7）展开剂：
乙酸乙酯－甲醇－冰醋酸—水（12：
3：
3：
2）
（8）α－萘酚－硫酸试剂（Molish试剂）：
15％α－萘酚乙醇溶液21mL，加浓硫酸13mL，再加乙醇81mL及水8mL混匀置棕色瓶中。
要新鲜配制。
（9）0.5％羧甲基纤维素钠（CMC）溶液
三、操作
（1）薄板制备：
称取硅胶G1g于烧杯中，加3mL0.5％羧甲基纤维素钠（CMC）溶液，用玻璃棒调成均匀糊状，铺于载波片上。
晃动载波片，使之均匀分布。
置室温20分钟凝固后，置110℃干燥箱烘半小时备用。
（2）点样：
用毛细管分别吸取乳糖、葡萄糖、以及二者的混合液各少许，在距载波片一端1.5cm的起点线处，三等分分别点样。
点样的直径应小于3mm，待样品干燥后展开。
（3）展开：
慢慢沿缸壁注入展开剂约0.5cm高度（注意展开剂的高度必须在薄板的起点线以下），展开剂其体积比为乙酸乙酯：
甲醇：
冰醋酸：
水＝12：
3：
3：
2。
将薄板60°倾斜放置于层析缸中，密闭层析缸，让其展开。
当溶剂的前沿升高到距薄层顶端1cm处，取出薄板，用铅笔在展开剂前沿划线，用电吹风将展开剂吹干。
（4）显色：
将薄板全部浸于α－萘酚－硫酸试剂中，迅速取出，用电吹风（高温档）均匀吹至斑点出现为止。
（5）求出各点的Rf值。
附注
（1）Rf值求法：
Rf＝
（2）薄层层析法的优点是：
①设备简单，操作容易。
②层析展开时间短，只需数分钟到几小时，即可获得结果。
③分离时几乎不受温度的影响。
④可采用腐蚀性的显色剂，而且可以在高温下显色。
⑤分离效率高。
实验四凝胶渗透层析法
一、原理
凝胶渗透层析是按照溶质分子的大小不同而进行分离的一种层析技术。
当大小不同的溶质分子通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛效应，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
分子量大的因不易渗入网络，被排阻在凝胶颗粒之外，因而所受到的阻滞作用小，先流出层析床，分子量小的因能渗透到网络内部，洗脱流程长，所受到的阻滞作用大，后流出层析床，这样就可以达到分级分离的目的。
二、目的与要求
利用SephadexG-25凝胶层析，分离一含有溶质分子大小不同的样品，并测出洗脱曲线，通过实验了解并熟悉凝胶渗透层析的原理和实际应用。
三、仪器与试剂
层析柱；恒流泵（或恒压瓶）；自动部分收集器
吸管；刻度试管；752型分光光度计
样品：
血红蛋白、核黄素（1mg/mL）
洗脱液：
0.05mol/L、pH4.3磷酸缓冲液（或蒸馏水）
四、操作
⒈凝胶的处理
①溶涨与浮选：
将凝胶放入过量的水中浸泡六小时（沸水浴中为两小时）。
浸泡后搅动凝胶再静置，待凝胶沉淀后，用倾泌法去除上层清细粒悬液，如此反复数次。
②平衡：
将浸泡后的凝胶抽干，用十倍量的洗脱液处理约一小时，搅拌后继续去除上层细悬浮液。
⒉装柱：
将层析柱垂直装好，加适量洗脱液除气泡，待气泡赶完后，使洗脱液在底端留至约1cm高即可关闭开关。
将处理好的凝胶在烧杯内用1倍的溶液搅调成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。
待底部凝胶沉积至1～2cm时，缓缓打开底端出口管，随之继续添加凝胶悬浮液直至床体积沉积至20cm（据层析柱高度而定）高度为止（操作中应注意防止产生气泡与节痕）。
⒊平衡：
柱装好后，使层析床稳定5～10分钟，然后接上恒流泵打开出口，用2倍于床体积的洗脱液平衡，使层析床稳定。
恒流泵要预先调好流速，流速为10～15滴/分（以下均同）。
注意：
在洗脱时要将恒流泵至层析柱的连接管内气泡全部排除，以免影响流速。
此外如果需要温度平衡则同时在层析柱夹套内通入恒温冷却水。
⒋层析床校正：
为了取得良好的层析效果，在层析前需要对所装的层析柱进行检查。
检查方法如下：
首先用肉眼观察层析床是否均匀，有没有“纹路”和气泡，床表面是否平整，然后再用兰葡聚糖2000进行层析行为的检查，在层析柱内加进1mL（2mg/mL）兰葡聚糖2000，然后用洗脱液进行洗脱（洗脱的流速同前），在层析中当移动的指示剂色带狭窄均一则说明装柱良好。
检查后再经洗脱液平衡即重复步骤3即可使用（一般不用校正）。
⒌加样与洗脱：
打开平衡好的层析柱底部出口，使柱内溶液流至床表面时关闭，将吸取0.5mL样品的加样滴管在距床表面上1mm处沿管壁轻轻转动加进样品，加完后，再打开底端出口使样品流至床表面，用少量洗脱液同样小心清洗表面1～2次，使洗脱液流至床表面，然后将洗脱液在柱内约加至4cm高，接上恒流泵或恒压洗脱瓶并调好流速即开始洗脱（注意在加样和洗涤过程中防止冲坏床表面）。
⒍收集与测定：
收集时可用自动部分收集器按每管2mL收集或手工操作分管收集15管，收集后用752型分光光度计在451nm波长处以洗脱液为空白管溶液对每管收集液进行光吸收测定。
测定后以收集管数（或mL数）为横座标，光密度为纵座标对应作图。
注：
市售的凝胶如需彻底处理，可在溶涨后再用0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液在室温中浸泡半小时，但注意必须避免在酸或碱中加热。
另外用过的凝胶柱如需再生时，可用0.1mol/LNaOH-0.1mol/LNaCl，洗涤以去掉堵住凝胶网孔的杂质，然后用蒸馏水洗至中性备用，一般使用几次后就需再生。
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶
同工酶（活性染色鉴定法）
目的要求
（1）复习有关同工酶的知识。
（2）掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶、底物染色技术及有关原理。
原理
1959年Markert等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称LDH1，靠近阴极一端的称为LDH5，其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH2,LDH3,及LDH4。
它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶（isoenzyme）的概念。
目前，已知LDH同工酶是由H亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H4（LDH1）,H3M（LDH2）,H2M2（LDH3）,HM3（LDH4）及M4（LDH5）5种，这些LDH同工酶广泛分布于动物的各种组织以及微生物和植物中。
心肌中以LDH1含量高，骨骼肌及肝中LDH5含量高。
LDH同工酶底物染色显色反应如下：
乳酸NAD+PMSH2NBT
LDH
丙酮酸NADH（H+）PMSNBTH2（蓝紫色甲臜）
反应式中PMS为甲硫吩嗪（phenazinemethosulfate），NBT为氯化硝基四氮唑蓝（nitro-bluetetrazoliumchloride）的缩写，它们都是接受电子的染料。
LDH与底物染色液在37℃温浴中脱下的氢最后传递给NBT生成蓝紫色的NBTH2称为甲臜，此物不溶于水，有利于显色后区带的保存，但可溶于氯仿及95％乙醇（9：
1）的混合液。
因此，电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出，于560nm处比色，也可用光吸收扫描仪扫描得出LDH同工酶各成分的相对百分含量。
目前，LDH及同工酶检测已广泛应用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的依据，常用醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖电泳及聚丙烯酰胺电泳分离LDH及同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全相同，但灵敏度不同。
因而正常值不完全相同。
本实验用连续PAGE法分离LDH及同工酶。
试剂与器材
一、材料
人（动物）未溶血新鲜血清，{动物组织提取液[组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1：
5或1：
10（g/mL）]}。
二、试剂
1．PAGE有关试剂
①凝胶贮液（28％Acr-0.735％Bis）：
丙烯酰胺（Acr）28.0g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.735g,加重蒸馏水使其溶解后定容至100mL。
②凝胶缓冲液（pH8.9Tris-HCl）：
量取1mol/LHCl48mL，称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.6g，TEMED（N,N,N`,N`-四甲基乙二胺）0.23mL，加重蒸馏水至80mL使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水使其溶解后定容至100mL置棕色瓶，4℃保存。
③电极缓冲液（pH8.3Tris-甘氨酸）：
称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水至900mL，调pH8.3后，用重蒸馏水定容至1000mL，置试剂瓶中，4℃保存，临用前稀释10倍。
④AP溶液：
分析纯过硫酸胺（AP）0.14g，加重蒸馏水至100mL，置棕色瓶，4℃贮存，仅能用一周，最好当天配制。
（也可不用配，直接加AP晶体适量）。
⑤脱色液：
7％乙酸溶液。
（⑥保存液：
甘油10mL，冰乙酸7mL,加蒸馏水至100mL。
）（一般不用配制）
2．LDH同工酶染色贮存液
（1）5mg/mL氧化型辅酶Ⅰ溶液：
称50mgNAD+，加蒸馏水10mL，置棕色瓶，4℃贮存可稳定两周。
（2）1mol/L乳酸钠溶液：
取60％乳酸钠9.25mL，加蒸馏水定容至50mL。
置棕色瓶，4℃贮存。
（3）0.1mol/L氯化钠溶液：
称0.584gNaCl，加蒸馏水溶解并定容至100mL。
（4）1mg/mL甲硫吩嗪（PMS）溶液：
称5mgPMS，加蒸馏水5mL使其溶解。
（5）1mg/mL氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液：
称20mgNBT，加蒸馏水20mL使其溶解。
PMS及NBT溶液遇光不稳定，应置于棕色瓶中，4℃贮存，若黄色溶液变绿，则不能使用，需要重新配制。
（6）0.5mol/LpH7.5磷酸盐缓冲溶液（或Tris-HCl）。
（3．制备组织匀浆缓冲液,0.01mol/LpH6.5磷酸钾盐缓冲液。
）
三、器材
稳压、稳流电泳仪（100mA，600V），夹芯式垂直板电泳槽，吸量管（1，5，10mL），微量注射器（50μL），烧杯（25，50mL），培养皿（φ12cm）,生化培养箱（37℃），可见分光光度计或光密度扫描仪，窄滤纸条，玻璃纸。
操作方法
一、安装及配制
1．夹心式垂直板电泳槽的安装
（1）装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。
（2）将长、短玻璃板分别插到凹形硅胶框的凹形槽中。
注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。
（4）将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
（5）竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1％琼脂（糖）。
其目的是封住空隙，凝固后的琼脂（糖）中应避免有气泡。
2．配制pH8.9，7%凝胶混合液（20mL）
本实验采用28％Acr-0.735%Bis凝胶贮液。
取出各种贮液，平衡至室温后，按凝胶缓冲液：
凝胶贮液：
水：
AP溶液＝1：
2：
1：
4（各2.5，5.0，2.5，10mL）的配比配制20mL,7.0％凝胶混合液。
前3种溶液混合在一小烧杯内，AP溶液单独置另一小烧杯。
准备灌胶。
二、灌胶
本实验采用连续PAGE，灌胶方法如下：
将配制好的两小烧杯溶液，（抽气后）轻轻混匀，立即（用细长头的滴管）将凝胶混合液倒（加）到凝胶模长、短玻璃板间的狭缝内，当加至距离玻璃板上缘约0.5cm时，停止加胶，轻轻将样品槽模板插入。
在上下贮槽中倒入蒸馏水，液面不能超过上贮槽的短玻璃板，防止蒸馏水进入凝胶中。
其作用是增加压力，防止凝胶液渗漏。
凝胶液在混合后15分钟开始聚合，约0.5－1小时，完成聚合作用。
聚合后，在样品槽模板梳齿下缘与凝胶界面间有折射率不同的透明带。
看到透明带后继续放置30分钟。
待凝胶聚合后，小心取出样品模板，用窄滤纸条吸去样品槽中的液体。
放掉上下贮槽中的蒸馏水。
倒入电极缓冲液至电极槽中，并浸没过短玻璃板。
三、预电泳
为防止LDH及其同工酶受凝胶聚合后残留物（如AP等）的影响，引起酶的钝化或其它人为效应，在加样前，应进行预电泳，电泳条件为10mA，1小时。
关闭电源后准备加样。
四、加样
取10～15μl血清（或组织匀浆），加等体积40％蔗糖（内含少许1％溴酚蓝）混合后，用微量注射器吸取20－30μl样品，小心加到凹形样品槽内。
五．电泳
加样品后，打开电源，将电流调至10mA，待样品进入分离胶后，改为20－25mA，当溴酚蓝前沿距离硅胶框下缘1－2cm时，将电流调回零，关闭电源。
六、染色、脱色（与制干板）
按表的顺序，在临用前将有关试剂混合配制25mLLDH活性染色液。
LDH活性染色液的配制
贮存液
NAD+
乳酸钠
NaCl
NBT
PMS
pH7.5磷酸缓冲液
用量/mL
4.0
2.5
2.5
10.0
1.0
5.0
电泳结束后，取下凝胶模，剥下硅胶框，撬开玻璃板，在凝胶右下角切除一小角作为标记，小心取出凝胶板，将其放在盛有染色液的培养皿中，置37℃生化培养箱中保温20－30分钟，待LDH同工酶呈现蓝紫色区带，即可用蒸馏水洗去染色剂，加脱色液终止酶反应并使底色脱净，（将凝胶板放在保存液中浸泡2－3小时。
按PAGE法将凝胶板放置在二层玻璃纸中间，自然干燥制成干板。
干板经扫描可得知LDH同工酶相对含量）。
注意事项
（1）组织匀浆制备时，一般用0.01mol/LpH6.5磷酸盐缓冲液，此溶液需4℃预冷。
组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为1：
5或1：
10。
用玻璃匀浆器在冰浴中匀浆，将匀浆液置离心管中10000r/min，离心10－15分钟（4℃），取上清液进行电泳。
（2）电泳时，电流不要太高，应防止热效应引起LDH同工酶失活。
（3）LDH同工酶活性染色时间不要太长，一般以15－30分
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