生物化学实验3.docx
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生物化学实验3
生物化学实验指导
实验一蛋白质的性质实验
（一）（呈色反应）
一、目的
1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要联接方式。
2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法
二、虽色反应：
（一）双缩脱反应：
1.原理：
尿素加热至180℃左右生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
一切蛋白质或二肽以上的多肽部有双纳脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2.试剂：
（1）尿索：
10克
（2）10%氢氧化钠溶液250毫升
（3）1%硫酸铜溶液60毫升
（4）2％卵清蛋白溶液80毫升
3.操作方法：
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10％氢氧化钠溶液约1毫升，振荡混匀，再加1％硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约l毫升和10％氢氧化钠溶液约2毫升，摇匀，再加1％硫酸铜溶液2滴，随加随摇，观察紫玫色的出现。
（二）茚三酮反应
1.原理：
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
该反应十分灵敏，1：
1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分于和氨缩合生成有色物质。
反应机理如下：
此反应的适宜pH为5—7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2.试剂：
（1）蛋白质溶液100毫升
2％卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：
水＝1：
9）
（2）0.5％甘氨酸溶液80毫升
（3）0.1％茚三酮水溶液50毫升
（4）0.1％茚三酮—乙醇溶液20毫升
3.操作方法：
（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
（2）在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
（三）黄色反应：
1.原理：
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。
反应式如下：
多数蛋白质分子台有带苯坏的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓
硫酸才有黄色反应。
2.试剂：
（1）鸡蛋清溶液100毫升
将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：
20混匀，然后用六层纱布过滤。
（2）大豆提取液100毫升
将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状用纱布过滤。
（3）头发
（4）指甲
（5）0.5％苯酚溶液50毫升
（6）浓硝酸200毫升
（7）0.3％色氨酸溶液10毫升
（8）0.3％酪氨酸溶液10毫升
（9）10％氢氧化钠溶液100毫升
3.操作方法：
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10％氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
（四）乙醛酸反应
1.原理：
在浓硫酸存在下，色氨酸与乙醛酸反应生成紫色物质,反应机理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸与两分子色氨酸脱水缩合形成与靛蓝相似的物质。
含有色氨酸的蛋白质也有此反应。
2.试剂：
（1）蛋白质溶液100毫升
鸡蛋清：
水＝1：
20
（2）0.03％色氨酸溶液10毫升
（3）冰醋酸200毫升
（4）浓硫酸（分析纯）100毫升
3.操作方法：
取3支试管。
编号。
分别按上表加入蛋白质溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升。
混匀后倾斜试试管，沿管壁分别缓缓加入浓硫酸约I毫升，静置。
观察各管液面间紫色环的出现。
若不明显，可于水浴中微热
实验二蛋白质的性质实验
（二）（沉淀反应）
一、蛋白质等电点的测定：
1.目的：
（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法
2.原理：
蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡：
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数日相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与酷酸钠（醋酸钠混
合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3.器材：
（1）水浴锅。
（2）温度计。
（3）200毫升锥形瓶。
（4）100毫升容量瓶。
（5）吸管。
（6）试管。
（7）试管架。
（8）乳钵。
4.试剂：
（1）0.4％酪蛋白醋酸钠溶液200毫升
取0.4克酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研6，将所得的蛋白质悬波移入200毫升锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10毫升1当量/升醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100毫升容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
（2）1.00当量／升醋酸溶液100毫升
（3）0.10当量／升醋酸溶液100毫升
（4）0.01当量／升醋酸溶液50毫升
5.操作方法：
（1）取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。
此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
二、蛋白厦的沉淀及变性：
1.目的：
（1）加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
（2）了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
（3）了解蛋白质变性与沉淀的关系。
2.原理：
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颖拉可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应：
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应：
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金届离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变性蛋白质并不一定部表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
3.试刘与材料：
（1）蛋白质溶液500毫升
5％卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液
（新鲜鸡蛋清：
水＝1：
9）
（2）pH4.7醋酸—醋酸钠的缓冲溶液100毫升
（3）3%硝酸银溶液10毫升
（4）5％三氯乙酸溶液50毫升
（5）95％乙醇250毫升
（6）饱和硫酸铵溶液250毫升
（7）硫酸铵结晶粉末1000克
（8）0.1当量／升盐酸溶液300毫升
（9）0.1当星／升氢氧化钠溶液100毫升
（10）0.1当员／升碳酸钠溶液100毫升
（11）0.1当量／升醋酸溶液100毫升
（12）甲基红溶液20毫升
（13）2％氯化钡溶液150毫升
4.操作方法：
（1）蛋白质的盐析。
无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）浓溶液能析出蛋白质。
盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加5％卵靖蛋白溶液5毫升于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。
倒出少量混蚀沉淀，加少量水，是否溶解，为什么？
将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，l此时析出的沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
（2）重金属离子沉淀蛋白质
重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加3％硝酸银溶液1～2滴，振荡试管，有沉淀产生。
放置片刻，倾出上消液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？
为什么？
（3）某些有机酸沉淀蛋白质
取一支试管，加入蛋白质溶液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。
放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
（4）有机溶剂沉淀蛋白质
取一支试管，加入2毫升蛋白质溶液，再加入2毫升95％乙醇。
混匀，观察沉淀的生成。
（5）乙醇引起的变性与沉淀
取3支试管，编号。
依下表顺序加入试剂：
振摇混匀后，观察各管有何变化。
放置片刻，向各管内加水8毫升，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红．再分别用0.1当量／升醋酸溶液及0.1当星／升碳酸钠溶液中和之。
观察各管颜色的变化和沉淀的生成。
每管再加0.1当量／升盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。
解释各管发生的全部现象。
实验二蛋白质的两性反应及等电点的测定
蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。
调节溶液的酸碱度达到一定的离子浓度时，
白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子
不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点（pI）。
当
+
液的pH值低于蛋白质等电点时，即在H较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为
—
离子，当溶液的pH值大于等电点时，即在OH较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成
阴离子。
本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定其等电点，在等电点
蛋白质溶解度最小，最容易沉淀析出。
（三）蛋白质的沉淀反应
蛋白质分子由于形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒。
但是，蛋白质胶体颗
粒的稳定性是有条件的、相对的。
在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷、脱水，甚至变性而丧失稳定因素，即以固态形式从溶液中析出，这种作用称为蛋白质的
沉淀反应。
该反应可分为以下两种类型:
1.可逆沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，
基本上保持原有的性质。
沉淀因素除去后，蛋白质沉淀可再溶于原来的溶剂中。
这种沉
淀反应称为可逆沉淀反应。
属于此类反应的有盐析作用；在低温下，乙醇或丙酮对蛋白
质的短时间作用以及等电点沉淀等。
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。
蛋白质是亲水
胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时，蛋白质分子所带
的电荷被中和，蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。
沉淀出的蛋白质仍保持其天
4然蛋白质的性质，若减低盐的浓度时，还能溶解。
沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度、种类不同，所以在不同条件下，采用不同浓
度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，这种方法称为蛋白质的分级盐
析。
它在酶的生产和制备等工作中被广泛应用。
2.不可逆的沉淀反应
在发生沉淀反应时，蛋白质的分子内部结构，空间构象遭到破坏，失去其天然蛋白
质的性质，这时蛋白质已发生变性。
变性后的蛋白质沉淀不能再溶解于原来的溶液中，
这种沉淀反应称为不可逆沉淀反应。
重金属盐、生物碱试剂、过酸、过碱、加热、震荡、超生波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。
重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。
蛋白质在水溶液中是酸碱两性电
解质，在碱性溶液中（对蛋白质等电点而言），蛋白质分子带负电荷，能与带正电荷的
2+2+2+2+3+
金属离子，如Zn、Cu、Hg、Pb、Fe结合成蛋白质盐。
在有机体内，蛋白质常以
其可溶性的钠盐或钾盐存在，当加入汞、铅、铜、银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的
盐类而沉淀。
经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解在水中，说明它已发生了变性。
重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全。
因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液
中的蛋白质;临床上则用蛋白质解除重金属盐食物性中毒。
但应注意，过量的醋酸铅或
硫酸铜可使沉淀的蛋白质再溶解。
蛋白质在有机酸的作用下带正电荷，与酸根的负电荷结合成为溶解度很小的盐类而
沉淀。
三氯乙酸和磺基水杨酸最有效，可将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此
得到广泛应用。
【实验试剂和器材】
（一）试剂
1.卵清蛋白溶液：
取5ml鸡蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—层
纱布过滤,新鲜配制。
2.0.5%酪蛋白（以0.01NNaOH作溶剂）
3.酪蛋白-醋酸钠溶液：
称取纯酪蛋白0.25克，加蒸馏水20ml及1.00NNaOH溶
液5ml（必须准确）。
摇荡使酪蛋白溶解。
然后加1.00N醋酸5ml（（必须准确），倒入50ml蒸馏瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，混匀，结果是酪蛋白溶于0.10N醋酸钠溶液内，酪蛋
白的浓度为0.5%。
4.蛋白质-NaCl溶液:
取20ml蛋清,加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充
分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。
5.0.5%甘氨酸，0.3%酪氨酸，0.5%色氨酸
6.尿素，双缩脲试剂，0.1%茚三酮乙醇
溶液，浓硝酸，10%NaOH
7.0.01%溴甲酚绿指示剂，0.02NHCl，0.02NNaOH，0.01NHAc，0.10NHAc，1.00N
HAc
8.饱和硫酸铵溶液,硫酸铵粉末,2%硝酸银,0.1%硫酸铜,饱和硫酸铜,10%三氯乙
酸,
（二）器材
试管及试管架，酒精灯，玻璃漏斗，滤纸，移液管，滴管，恒温水浴。
【实验方法】
1.双缩脲反应
取少量尿素结晶，加入干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化
时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后加入10滴双缩脲试剂，混匀,观察颜色变化。
另取1支试管，加入卵清蛋白溶液1ml再加入5滴双缩脲试剂，混匀，观察颜色
变化。
2.茚三酮反应
取2支试管，分别加入卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液4滴，再加入2滴0.1%茚三酮乙醇溶液，混匀，在沸水浴中加热1-2分钟，观察颜色变化，并比较蛋白质和氨
基酸呈色深浅。
3.黄色反应
按下表分别向6支试管中加入试剂，微火小心加热（不必沸腾），观察颜色变化。
再
滴加10%NaOH溶液使呈碱性，观察颜色变化。
管号123456
卵清蛋白0.3%酪氨酸0.3%色氨酸5%苯酚指甲头发
样品（滴）
4444少许少许
浓硝酸（滴）22222020
4.蛋白质的两性反应
（1）取1支试管，加入1ml0.5%酪蛋白和5-7滴0.01%溴甲酚绿指示剂（变色范围是pH3.8—5.4，在酸性溶液中为黄色，在碱性溶液中为蓝色），混匀，观察溶液的颜色。
（2）用滴管缓慢加入0.02NHCl溶液，随加随摇，直到有大量沉淀产生。
说明原因，并观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入0.02NHCl溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，说明原因。
（4）再缓慢滴入0.02NNaOH溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化过程，说明原因。
5.酪蛋白等电点的测定
取9试管编号后按下表顺序准确加入试剂。
加入每种试剂后应混匀。
（单位：
ml）
123456789123456789
管号
试剂
蒸馏水2.43.2—2.03.03.51.52.753.38
1.00NHAc1.60.8———————
0.10NHAc——4.02.01.00.5———
0.01NHAc——————2.51.250.62
酪蛋白-NaAc1.01.01.01.01.01.01.01.01.0
溶液的最终pH3.53.84.14.44.75.05.35.65.9
沉淀出现的情况
静置约20分钟,观察每支试管内的混浊度,以-,+,++,+++,++++符号表示沉淀的多少。
根据观察结果，指出哪个pH是酪蛋白的pI。
6.蛋白质的盐析作用（选做）
取1支试管，加入3ml蛋白质-NaCl溶液和3ml饱和硫酸铵溶液，混匀，静置
0分钟，球蛋白则沉淀析出。
过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻璃棒搅拌，
至粉末不再溶解，析出的沉淀为清蛋白。
静置，弃上部清液，取部分清蛋白沉淀加水稀
释，观察它是否溶解。
7.重金属沉淀蛋白质（选做）
取2支试管，各加入约1ml卵清蛋白质液，分别加入2%硝酸银溶液及0.1%硫
酸铜溶液1滴，观察沉淀的生成。
对第2支试管再加入过量的饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。
8.有机酸沉淀蛋白质（选做）
取1支试管，加入卵清蛋白质液约0.5ml，然后滴加10%三氯乙酸溶液数滴，观察沉淀的生成。
【思考题】
1.如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此作何结论?
2.茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调?
若不是，为什么?
3.在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低?
4.蛋白质分子中的哪些基团可以与
（1）重金属离子作用而使蛋白质沉淀?
（2）有机酸、无机酸作用而使蛋白质沉淀?
实验三糖类的性质实验
（一）
（糖的颜色反应）
一．目的要求
1、了解糖类某些颜色反应的原理。
２、学习应用糖的颜色反应鉴别糖类的方法。
二.原理
糖经浓无机酸处理，脱水产生糠醛或糠醛衍生物。
戊糖形成糠醛，己糖则形成羟甲基糠醛。
这些糠醛和糠醛衍生物在浓无机酸作用下，能与酚类化合物缩合生成有色物质。
与一元酚如α－萘酚作用，形成三芳香环甲基有色物质。
与多元酚如间苯二酚作用，则形成氧杂蒽有色物质，反应式如下：
通常使用的无机酸为硫酸。
如用盐酸，则必须加热。
常用的酚类为α－萘酚、甲基苯二酚、间苯二酚和间苯三酚等，有时也用芳香胺、胆酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶类化合物等。
有人认为，用浓硫酸作为脱水剂时，形成有颜色的产物与酚核的磺化有关，见如下反应式：
一、糖的呈色反应
1．Molish反应（α－萘酚反应）
本实验是鉴定糖类最常用的颜色反应。
糖在浓酸作用下形成的糠醛及其衍生物与α－萘酚作用，形成红紫色复合物。
在糖溶液与浓硫酸两液面间出现紫环，因此又称紫环反应。
自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。
此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈颜色近似的阳性反应。
因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。
２器材
（１）试管及试管架（２）滴管
３试剂
（１）莫氏试剂５％a-奈酚的酒精溶液１５００毫升
（２）１％葡萄糖溶液１００毫升（３）１％果糖溶液１００毫升
（４）１％蔗糖溶液１００毫升（５）１％淀粉溶液１００毫升（６）０．１％糠醛溶液１００毫升（７）浓硫酸５００毫升
４、取五支试管，分别加入１％葡萄糖溶液、１％果糖溶液、１％蔗糖溶液、１％淀粉溶液、０．１％糠醛溶液各一毫升。
再向五支试管中个加入２滴莫氏试剂，充分混合。
斜执试管，沿管壁慢慢加入浓硫酸约１毫升，慢慢立起试管，切勿摇动。
浓硫酸在试液下形成两层。
在二液分解出有紫红色环出现。
观察、记录各管的颜色。
２．Seliwanoff反应（间苯二酚反应）
该反应是鉴定酮糖的特殊反应。
在酸作用下，己酮糖脱水生成羟甲基糠醛。
后者与间苯二酚结合生成鲜红色的化合物，反应迅速，仅需20—30s。
在同样条件下，醛糖形成羟甲基糠醛较馒。
只有糖浓度较高时或需要较长时间的煮沸，才给出微弱的阳性反应。
蔗糖被盐酸水解生成的果糖也能给出阳性反应。
２、器材
（１）试管及试管架（２）滴管（３）水浴锅
３、试剂
（１）塞氏试剂１０００毫升
（２）１％葡萄糖溶液１００毫升（３）１％果糖溶液１００毫升
（４）１％蔗糖溶液１００毫升
４、操作
取三支试管，分别加入１％葡萄糖溶液、１％果糖溶液、１％蔗糖溶液各０．５毫升。
再向各管分别加入塞氏试剂５毫升，混匀。
将三支试管同时放入沸水浴中，注意观察、记录各管颜色
的变化及变化时间。
思考题
１、可用何种反应鉴别酮糖的存在？
２、a-奈酚反应的原理？
实验总结
（一）a-奈酚反应
试剂现象解释现象１％葡萄糖溶液
１％果糖溶液
１％蔗糖溶液
１％淀粉溶液
０、１％糠醛溶液
（二）间苯二酚反应
试剂现象解释现象１％葡萄糖溶液
１％果糖溶液
１％蔗糖溶液
实验四糖类的性质实验
（二）
（糖类的还原作用）
一、目的
学习几种常用的鉴定糖类还原性的方法及其原理。
二、原理
含有自由醛基或酮基的单糖和二糖为还原糖。
在碱性溶液中，还原糖能将金属离子（铜、铋、汞、银等）还原，糖本身被氧化成酸类化合物，此性质常用于检验糖的还原性，并且常成为测定还原糖含量的各种方法的依据。
1．Fehling反应
费林试剂是含有硫酸铜与酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。
硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。
若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。
上述反应可用下列方程式表示：
在碱性条件下，糖不仅发生烯醇化、异构化等作用。
也能发生糖分子的分解、氧化、还原或多聚作用等。
由这些作用所形成的复杂混合物具有强烈的还原作用，因此企图用简单的氧化还原作用来写出反应平衡式是不可能的。
为了防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehling试剂中加入酒石酸
钾钠，它与Cu2+形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。
平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。
费林试剂是一种弱的氧化剂，它不与酮和芳香醛发生反应．2．Benedict反应
Benedict试剂是Fehling试剂的改良。
它利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性比Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少，因而在实际应用中有更多的优点。
3．Barfoed反应
该反应的特点是在酸性条件下进行还原作用。
在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。
单糖在3min内就能还原Cu2+而还原二糖则需20min。
所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。
当加热时间过长，非还原性二糖被水解也能呈现阳性反应，如蔗糖在10min内水解而发生反应。
还原二糖浓度过高时，也会很快呈现阳性反应，若样品中含有少量氯化钠也会干扰此反应。
三.试剂和器材
1、测试糖液
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