蛋白质浓度的测定精华.docx
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蛋白质浓度的测定精华
蛋白质浓度的测定
一．紫外吸收法
1.近紫外吸收光谱法（280nm）
原理：
蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280nm附近。
某些蛋白质含有二硫键，也会在280nm附近吸收紫外光。
近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。
因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。
比如，当蛋白质浓度为1mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。
但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。
该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。
这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。
该方法的缺点是：
其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。
同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。
蛋白质浓度的计算：
朗伯比尔定律：
A（absorbance）=εcl，因此：
c（mg/ml）=A/εl（cm）。
消光系数：
当蛋白质浓度为1mg/ml，光径为1cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。
蛋白质的消光系数计算公式：
A280（1mg/mL）=（5690nw+1280ny+120nc）/M。
其中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。
2.远紫外吸收光谱法
在190-210nm范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。
此波长范围内，肽键在190nm处的吸收值是其在205nm的2倍，而且在190nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205nm处的吸收值对蛋白质进行定量。
对于1mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。
对于不同的蛋白质，其消光系数差别很小。
该方法的优点是操作简单，灵敏度高，样品可以回收。
缺点：
在使用前，必须对分光光度计进行准确校正，多种buffer，hemeorpyridoxalgroups在该波长具有很强的吸收紫外光的能力。
测定：
1.用生理盐水溶解蛋白质样品，确保其在215nm处的吸收值小于1.5。
2.磷酸钾buffer不影响吸收值的测定。
3.计算公式：
A2051mg/mL=27+120（A280/A205）或Proteinconcentration（µg/mL）=144（A215–A225）。
Notes:
1.使用这两个方法进行蛋白质定量时，最佳的吸收值范围为0.05-1，当吸收值为0.3时，测定的结果最精确。
2.如果样品浑浊，可以扣除310nm处的吸收值。
3.当蛋白质浓度很低时，蛋白质可能会吸附在石英杯内壁，从而影响蛋白质浓度的测定，在溶液中提高离子强度或者添加非离子型去垢剂可以防止这种现象的发生。
4.1mg/ml的BSA的吸收值为0.06，通常作为蛋白标准品。
5.当溶液中存在核酸时，可以用下列公式计算蛋白质浓度：
Protein（mg/mL）=（A235–A280）/2.51
Protein（mg/mL）=（A235–A280）/2.51
Protein（mg/mL）=0.183A230–0.0758A260
6.当吸收值小于2时，在215nm处测定的吸收值符合朗伯比尔定律。
7.在215nm处进行测定时，sodiumchloride,ammoniumsulfate,borate,phosphate,andTris不会影响吸收值的测定，但是0.1Macetate,succinate,citrate,phthalate,andbarbiturate具有很强的吸收值。
8.在pH4-8的范围内，215–225nm的吸收值没有变化。
9.当蛋白质中存在核酸时，也可以这样计算：
proteinconcentration（inmg/ml）=F×A280（assumingthecuvetteis1cmwide）.
二．Lowry法与BCA法
Lowry法与BCA法测定蛋白的浓度的原理包括两个步骤。
第一步，基于双缩脲反应。
在碱性溶液中，肽键中的N原子结合二价铜离子，将Cu2+还原成Cu+，并形成一种铜离子络合物，反应后的溶液呈紫色，溶液在540nm处有明显的吸收峰，根据朗伯比尔定律，可以测定蛋白质的浓度。
双缩脲反应
但是，直接测定肽键与铜离子络合物的吸收值灵敏度低，所以通常继续进行第二步反应增加灵敏度。
在Lowry法中，Cu+在第二步反应中会与Folin–酚试剂反应。
该试剂是一种钼磷酸盐与磷钨酸盐的混合物。
反应的本质是Mo6+还原成钼蓝（Mo4+），此反应依赖于Cu+催化的芳香族氨基酸（酪氨酸与色氨酸）的氧化。
因此，与近紫外吸收光谱法一样，Lowry法测定的蛋白质浓度也只是一个近似值，不同的蛋白质所含有的色氨酸与酪氨酸数目的差异会导致所测浓度值存在误差。
实验材料：
1.络合物生成试剂：
在实验开始前，以100:
1:
1的体积比混合下列溶液。
溶液A：
2%（w/v）Na2CO3;
溶液B：
1%（w/v）CuSO4·5H2O;
溶液C：
2%（w/v）酒石酸钾。
2.2MNaOH。
3.Folin试剂。
使用时为1当量浓度（N）。
4.标准：
将2mg/ml的BSA按照下表进行稀释。
方法：
1.取0.1ml样品溶液或者标准溶液，加入0.1ml1M氢氧化钠，在100℃水解反应10分钟。
2.冷却水解产物至室温，加入1ml新鲜混合的络合物生成试剂，混匀后室温静置10分钟。
3.加入0.1mlFolin酚试剂，迅速震荡混匀，室温静置30-60分钟，不要超过60分钟。
4.当蛋白浓度小于0.5mg/ml时，读取750nm处吸收值。
当蛋白浓度0.1-2.0mg/ml时，读取550nm处吸收值。
5.绘制标准溶液浓度曲线，根据比对此曲线吸收值对应的浓度，确定位置蛋白质的浓度。
Notes:
1.当蛋白质样品以沉淀存在时，用2M氢氧化钠溶液溶解样品，然后按照步骤一进行水解。
然后取0.2ml水解产物进入步骤二。
2.全细胞或复合物样品需要预处理。
处理方法见TheProteinProtocolsHandbook,secondedition,Page29.
3.确保水解反应在pH10-10.5。
4.反应孵育时间可以从10分钟到几个小时，影响不大。
5.涡旋振荡步骤是该方法可重复的关键。
因为Folin酚试剂很容易失效，因此加入后要迅速充分的震荡混匀。
6.高浓度时标准溶液曲线可能不是线性的，因此最佳测定范围：
0.01-1mg/ml。
7.因为不同的蛋白质所含有的色氨酸与酪氨酸的数目不同，为了浓度的准确性，可以采用多种标准蛋白质溶液绘制曲线，求得多个浓度值，最后取平均浓度值。
8.Buffer，药物，还原糖，核酸等物质都会干扰蛋白质浓度的测定。
9.分两次加入Folin酚试剂，每次加入后充分混匀，可以提高20%的灵敏度。
加入Folin酚试剂后3分钟时加入二硫苏糖醇，可以将反应灵敏度提高50%。
10.升高温度可以加快反应的进行，对反应结果影响不大。
与Lowry法一致，BCA法基于二价铜离子还原成一价铜离子的反应测定蛋白质的浓度。
第二步，每两分子的BCA螯合一分子一价铜离子，形成在562nm具有强吸收峰的紫色复合物。
此反应依赖于半胱氨酸、胱氨酸、酪氨酸与色氨酸侧链，高温下肽键可以参与铜离子的还原，因此高温反应可以降低不同蛋白质之间因氨基酸组成差异而造成的结果差异。
与Folin试剂相比较，BCA在碱性条件下很稳定，也没有那么容易受到其他物质的干扰，因此，BCA法目前基本上取代了Lowry法。
实验材料
标准实验：
试剂A：
sodiumbicinchoninate（0.1g）,Na2CO3·H2O（2.0g）,sodiumtartrate（dihydrate）（0.16g）,NaOH（0.4g）,NaHCO3（0.95g）,madeupto100mL.Ifnecessary,adjustthepHto11.25withNaHCO3orNaOH。
试剂B：
ReagentB:
CuSO4·5H2O（0.4g）in10mLofwater
Standardworkingreagent（SWR）:
混合100体积regentA与2体积reagentB.溶液呈苹果绿色，室温下可以稳定保存1周。
微量测定：
ReagentA:
Na2CO3·H2O（0.8g）,NaOH（1.6g）,sodiumtartrate（dihydrate）（1.6g）,madeupto100mLwithwater,andadjustedtopH11.25with10MNaOH.
ReagentB:
BCA（4.0g）in100mLofwater.
ReagentC:
CuSO4·5H2O（0.4g）in10mLofwater.
Standardworkingreagent（SWR）:
Mix1volofreagentCwith25volofreagentB,thenadd26volofreagentA.
方法：
见TheProteinProtocolsHandbook,Page31。
Notes:
1.试剂A与B非常稳定，可以购买。
2.延长样品孵育时间可以增强灵敏度。
注意要保持标准品孵育时间与样品孵育时间一致。
3.加热后，溶液颜色在1小时内都是非常稳定的。
4.样品中含有干扰物质时，可以将样品结合到尼龙膜上，然后洗掉杂质，BCA可以与膜上的蛋白质反应。
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