HLA一DPBI基因rs9277535A 与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性的研究.docx

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HLA一DPBI基因rs9277535A与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性的研究

HLA一DPBI基因rs9277535A与慢性乙型肝炎病毒感染及肝癌的遗传易感性的研究

【立项依据】：

人类白细胞抗原（humanleueoeyteantigens，HLA）作为免疫应答的重要基因群，与抗HBV免疫反应及HCC的发生均有着极其密切的关系。

HBV感染已成为重要的全球性的公共卫生问题，预计全球1/3的人口曾感染过HBV。

感染HBV后机体会有不同的疾病转归，大部分自愈，其中约5%人群发展为慢性感染，如慢性乙型肝炎（chronichepatitisB,CHB），肝硬化（livercirrhosis,LC）及原发性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）。

HBV感染的致病机理比较复杂，遗传因素在HBV致病过程中起到重要的作用，而广泛存在于基因中的基因多态性，即单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）可导致机体对各种慢性损伤反应具有明显的个体差异，影响疾病的易感性和不同的转归。

HLA复合体是首度发现的与疾病有明确关系的遗传系统。

而HLA与疾病的关联取决于其丰富的基因多态性。

尤其是HLAll类基因多态性[1]。

尽管HBV持续慢性感染机制、与HCC的关系以及HCC自身发生机制尚未明确，但机体对病原微生物或肿瘤抗原的免疫反应无疑在疾病进展过程中起关键作用。

HLA的主要生物学功能为提呈蛋白质抗原。

主要与T细胞免疫有关，由于抗原须在细胞表面展示，才能被T细胞识别，HLA的作用就是将内源性或外源性抗原以HLA一肤复合物的形式，通过T细胞表面的TCR，传递给CD4+和CDS+T细胞，以激活T细胞产生免疫功能。

同时，它通过影响T细胞在胸腺内的发育而建造个体的细胞库（与免疫耐受有关），通过影响对抗原肤的选择性结合和提呈而控制适应性免疫应答[2-3]。

HLAI类分子主要参与内源性抗原的提呈，HLAll类分子主要参与外源性抗原的提呈，但也存在交叉提呈的现象。

而HLA与疾病的关联取决于其丰富的基因多态性。

HLA基因多态性一方面决定了HLA分子所能递呈抗原肤的基序，另一方面影响T细胞对抗原的识别作用。

从而造成不同HLA分子结合和提呈抗原肤能力之间的差异。

使得不同的HLA基因对疾病的易感性则不同，对同一抗原的免疫应答强度不同，进而导致疾病转归不同，使其成为可能影响HBV感染慢性化及HCC发生的主要因素之一，这也是HLA多态性参与调控对HBV及HCC免疫应答的重要机制。

最近的一篇报道来自Kamatani和其同事实施的一组针对日本和泰国人群的HBV持续感染和基因变异全基因组关联的研究，起始的基因体关联分析则比较慢性HBV感染日本病患（共179位）与健康个体（共934位），研究中P值最小的的单一核普酸基因多态性（SNPS），再进一步与607位独立的HBV感染个体与1267位对照组个体身上确认，找出显著与慢性HBV感染有关的SNPS（P值=3.62Xlo一8到1.16xlo一，3）。

这11个SNPS都位于或接近HLA一DPAI与HLA一DPBI基因。

重新检验以1300例患者和2100例对照者为研究对象的两项日本和一项泰国队列研究中，进一步确认了与慢性HBV感染有关的两个SNPS，HLA一DPAI基因rs3O77A/G与HLA一DPBI基因rs9277535A/G（复合P值分别为6.34x10一3，和2.31x10一38，OR=0.57和0.56）。

这两个区域的G等位基因与慢性感染有关，而A等位基因则与保护力有关[4-5]。

研究者推测这些基因可能会导致HLA一DP分子抗原提呈效应从而导致HBv持续感染。

2011年7月，一项来自日本的全基因组关联研究（genome-wideassociationstudy，GWAS）发现，HLA-DQ基因的SNP位点rs2856718与CHB有关；VinodKumar等，报道了一项GWAS研究结果，HLA-DQ基因的SNP位点rs9275572与丙型肝炎病毒相关性肝癌有关，该位点是否与HBV感染同样具有相关性，在中国人群中是否存在这种关联，是否与抗病毒药物治疗预后相关，尚未见相关报道。

此外，有实验研究发现：

1HLA-DQ多态性位rs2856718与HBV感染及其结局的关系在共显性模型下，携带rs2856718AGrs2856718GG基因型的个体感染HBV的风险现象降低，OR值分别为0.738和0.4（95%CI=0.571-0.954,P=0.020；95%CI=0.331-0.636,P＜0.001）；在显性模型（GG+AGvsAA）和隐性模型（GGvsAA+AG）条件下，OR值分别为0.641和0.541（95%CI=0.505-0.814,P＜0.001；95%CI=0.403-0.725,P＜0.001）；吸烟和饮酒则均为HBV感染的独立危险因素（OR=1.688,P=0.006；OR=1.507,P=0.001）；rs2856718与HBV自然清除相关，在共显性模型下，rs2856718与HBV自然清除有关系，携带rs2856718AG和rs2856718GG基因型的个体HBV自然清除能力较强（AGvsAA,OR=0.642,95%CI=0.479-0.773,P=0.003;GGvsAA,OR=0.528,95%CI=0.361-0.773,P=0.001）；在显性模型条件下，rs2856718GG+AG基因型携带者HBV自然清除能力更强，发展为HBV慢性感染的可能性为rs2856718AA基因型携带者的0.610倍（95%CI=0.463-0.805,P＜0.001）；在隐性模型条件下，rs2856718GG基因型携带者HBV自然清除能力强，发展为HBV慢性感染的可能性则为rs2856718AA+AG基因型携带者的0.688倍（95%CI=0.492-0.962,P=0.029）；吸烟为HBV感染的独立危险因素（OR=1.512,95%CI=1.009-2.264,P=0.045）。

2.HLA-DQ多态性位点rs9275572与HBV感染及其结局的关系和rs9275572与HBV易感性有关联。

在共显性模型下，携带rs9275572AG或rs9275572AA基因型的个体感染HBV的风险率降低，OR值分别为0.706和0.374（95%CI=0.553-0.903,P=0.006；95%CI=0.244-0.573,P＜0.001）；在显性模型（AA+AGvsGG）下和隐性模型（AAvsGG+AG）条件下，OR值分别为0.627和0.429（95%CI=0.498-0.790,P＜0.001；95%CI=0.283-0.650,P＜0.001），吸烟和饮酒都为HBV感染的独立危险因素（OR=1.635,P=0.002;OR=1.582,P=0.002）。

rs9275572与HBV的自然清除相关，在共显性模型条件下，携带rs9275572AG基因型的个体HBV自然清除率更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的0.719倍（95%CI=0.544-0.949,P=0.020）；在显性模型下，携带rs9275572AA+AG基因型的个体HBV自然清除率则更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs9275572GG基因型携带者的为0.714倍（95%CI=0.547-0.932,P=0.013）；吸烟是HBV自然清除的独立危险因素（OR=1.527,95%CI=1.022-2.282,P=0.039）。

3GSPT多态性位点rs33635和rs974285与HBV感染及其结局之间的关系。

3.研究尚未发现rs33635和rs974285两个SNP位点与HBV易感性、HBV自然清除及LC进展和HCC进展的相关性。

4KIF1B多态性位点rs17401966与HBV感染及其结局的关系。

4.研究发现rs17401966基因多态性与HBV自然清除有关联，携带rs17401966GG基因型的个体HBV自然清除的可能性则更高，发展为HBV慢性感染的可能性为rs17401966AA基因型携带者的0.568倍（95%CI=0.361-0.894,P=0.015）；rs17401966基因多态性与HBV的易感性、LC进展及HCC进展无关联。

5.基因-基因交互作用经MDR分析，在HBV易感性研究实验中，最佳因子模型现为HLA-DQ位点（rs2856718、rs9275572）、GSPT1位点（rs33635）和KIF1B位点（rs174019664）之间的交互作用（P=0.0010），高危组合易感风险是低危组合的2.643倍（95%CI=1.458-3.487）。

在HBV自然清除实验研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718、rs9275572）、GSPT1位点（rs33635）和KIF1B位点（rs174019664）之间的交互作用（P=0.023），与HBV自然清除的关联强度为2.024（95%CI=1.156-3.958）。

在LC进展和HCC进展研究中尚未发现基因-基因间的交互作用。

6.基因-环境交互作用经MDR分析，在HBV的易感性研究中，准确性和交叉检验一致性最高的因子模型为HLA-DQ位点（rs9275572）、吸烟和饮酒的交互作用（P=0.0010），高危组合易感风险为低危组合的3.014倍（95%CI=1.647-4.963）。

在HBV自然清除实验研究中，最佳因子模型为HLA-DQ位点（rs2856718）和饮酒的交互作用模型（P=0.0010），与HBV自然清除的关联强度为1.923（95%CI=1.185-4.032）。

在LC进展研究中，尚未发现有统计学意义的基因-环境交互作用模型。

在HCC进展研究中，最佳因子模型是HLA-DQ位点（rs2856718）、GSPT1位点（rs33635）、KIF1B位点（rs17401966）和吸烟间的交互作用（P=0.0110），高危组合易感风险是低危组合的1.847倍（95%CI=1.265-3.468）。

有实验研究探讨HLA-DQ（rs28567185和rs9275572）、GSPT（rs33635和rs974285）及KIF1B（rs17401966）五个候选基因与LAM治疗后不同结局的相关性。

结果显示：

1.rs2856718与DNA应答无关联，但与ALT应答具有相关性，rs2856718A等位基因更容易与ALT应答，在共显性模型下（GGvsAA），OR值为2.458（95%CI=1.277-4.730，P=0.007）；在显性模型（GG+AGvsAA）和隐性模型（GGvsAA+AG）中，OR值分别为1.691（95%CI=1.093-2.615，P=0.018）和2.040（95%CI=1.104-3.772，P=0.020）；性别是ALT应答的独立影响因素，男性ALT应答率比女性低，年龄、吸烟及饮酒与ALT应答无关。

2.HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答及ALT应答的关系rs9275572与DNA应答相关，rs9275572G等位基因更容易出DNA应答，共显性模型下（AGvsGG:

OR=2.062,95%CI=1.153-3.687，P=0.015;AAvsGG:

OR=5.553,95%CI=1.827-16.877，P=0.003）、在显性模型下（AA+AGvsGG:

OR=2.599,95%CI=1.525-4.428，P＜0.001）和隐性模型下（AAvsGG+AG:

OR=4.684,95%CI=1.552-14.133，P=0.006）均有相关性；男性患者拉米夫定治疗后DNA应答的可能性比女性低。

rs9275572基因多态性与ALT应答具有相关性，rs9275572G等位基因更容易出ALT应答，在共显性模型条件下（AGvsGG:

OR=2.037,95%CI=1.231-3.369,P=0.006;AAvsGG:

OR=3.245,95%CI=1.415-7.440,P=0.005）、在显性模型中（AA+AGvsGG:

OR=2.279,95%CI=1.442-3.602,P＜0.001）和隐性模型下（AAvsGG+AG:

OR=2.678,95%CI=1.182-6.068,P=0.018）都存在此关联；性别与ALT应答相关，男性LAM治疗后的ALT应答的可能性比女性底（OR=0.509,95%CI=0.297-0.872,P=0.014），年龄、吸烟和饮酒与ALT应答都无相关性。

3.GSPT1多态性位点rs33635与DNA应答及ALT应答的关系rs33635C等位基因携带者更容易发生DNA应答，在共显性模型下（CCvsTT），rs33635CC基因型携带者DNA应答的可能性是rs33635TT基因型携带者的2.449倍（95%CI=1.057-5.674,P=0.037）；在隐性模型下（CCvsTT+CT），rs33635CC基因型携带者DNA应答的可能性是rs33635TT+CT基因型携带者的2.551倍（95%CI=1.138-5.716,P=0.023）；性别是DNA应答的独立影响因素，男性DNA应答的可能性降低。

在共显性模型（CCvsTT）和隐性模型中（CCvsTT+TC），rs33635C等位基因携带者更易发生ALT应答（OR=3.587,95%CI=1.727-7.450,P=0.001;OR=3.840,95%CI=1.910-7.720,P＜0.001）；性别与ALT应答有关，男性患者ALT应答的可能性均降低。

4.尚未发现GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的关系。

5.rs17401966与DNA应答具有相关性，rs17401966G等位基因携带者更易发生DNA应答，在共显性模型下（AGvsAA），OR值为3.141（95%CI=1.826-5.403,P＜0.001），在显性模型中（GG+AGvsAA），OR值为3.483（95%CI=2.045-5.932,P＜0.001）；在隐性模型下（GGvsAA+AG），OR值为5.350（95%CI=1.176-24.347,P=0.030）；性别、年龄为DNA应答的独立影响因素，吸烟和饮酒对DNA应答无影响作用。

rs17401966G等位基因携带者更易发生ALT应答，在共显性模型（AGvsAA）和显性模型（GG+AGvsAA）下，rs17401966与ALT应答具有相关性（OR=1.941,95%CI=1.231-3.063,P=0.004;OR=1.687,95%CI=1.089-2.615,P=0.019）；性别是ALT应答的独立影响因素，年龄、吸烟及饮酒对ALT应答都无影响。

上述研究显示：

在中国北方汉族人群中，HLA-DQ的两个SNP位点（rs9275572和rs2856718）与HBV的易感性，HBV自然清除及HBV感染后的相关疾病进展有关系。

rs9275572A和rs2856718G是HBV感染的保护性因素，在HBV自然清除、LC进展及HCC的进展中起到保护作用。

KIF1Brs17401966基因多态性与HBV自然清除有关系，携带rs17401966GG基因型的个体HBV自然清除的可能性更高，与HBV易感性、LC进展和HCC进展无关联。

未发现GAPT1rs33635和GAPT2rs974285两个SNP位点与HBV易感性、HBV自然清除及LC和HCC进展的相关性。

吸烟和饮酒均为HBV感染、HBV自然清除的独立危险因素；年龄越大，越容易由HBV进展到LC和HCC；男性、高龄及饮酒为HCC进展的独立危险因素；在HBV易感性、HBV自然清除和HBV感染不同结局中，存在基因-基因和基因-环境的交互作用。

其次研究发现：

1.HLA-DQ多态性位点rs2856718与DNA应答无关联，与ALT应答却具有相关性，rs2856718G等位基因可能是ALT应答的保护性碱基。

性别是DNA应答和ALT应答的独立影响因素，女性更容易出现DNA应答及ALT应答。

2.HLA-DQ多态性位点rs9275572与DNA应答和ALT应答有关，rs9275572A等位基因携带者DNA应答及ALT应答的可能性增高，性别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别是你ALT应答的独立影响因素。

3.GSPT1rs33635C等位基因则是DNA应答和ALT应答的保护性因素，女性DNA应答和ALT应答的可能性更高。

4.尚未发现GSPT2多态性位点rs974285与DNA应答及ALT应答的相关关系。

5.KIF1Brs17401966G等位基因是DNA应答和ALT应答的保护性碱基，性别和年龄为DNA应答的独立影响因素，性别为ALT应答的独立影响因素[6-8]。

目前由于关于HLAll类基因单核甘酸多态性与HCC易感性的报道仍然比较缺乏。

但由于HBV持续感染和HCC有着明确的相关性，可以推测与HBV感染有关的多个SNP可能与HCC的发生也有相关性[9-11];另外，HCC一旦在机体内发生发展，机体的免疫系统可能通过多种途径参与抗肿瘤的免疫效应，以消除肿瘤细胞或控制肿瘤的生长，这其中也包括HLAll类分子所参与的对HCC细胞相关抗原的加工、处理和提呈及其他抗肿瘤机制，因此推测HLAll类基因的单核甘酸多态性同样对HCC的发生、发展以及转移有着至关重要的作用。

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【研究方案】：

1．【研究目标】：

通过大样本量的病例对照，以SNP为遗传标记，研究HLA一DPBI基因rs9277535A与慢性HBV感染及HCC的发病风险的关系。

２.【研究内容】：

1）.在中国人群中对rs9277535A与慢性乙型肝炎的遗传易感性进行验证;

2）.研究该多态与慢性HBV感染不同结局的关系;

3）.探讨该基因多态可能的作用机制；

4）.对该基因多态与HCC的遗传易感性进行分析。

3.【研究方法】:

1.选择符合条件的研究对象，问卷形式收集研究对象的一般情况，并收集外周血，提取DNA，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MatrixAssistedLaserDesorption/ionizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI-TOFMS）实验平台进行DNA的SNPs分型。

2.应用聚合酶连反应（polymerasechainreaction,PCR）和限制性片段长度多态性（restritionfragmenglengthpolymorphism,RFLP）,检测了417例慢性乙型肝炎患者、402例无症状慢性HBV携带者、453例肝癌患者以及表面抗原阴性的729例正常人群的rs9277535多态，比较不同基因型与上述疾病风险的关系。

【分析方法】：

先进行单因素分析，再用非条件Logistic回归分析校正混杂因素，分析SNP位点与HBV易感性及其感染结局的关联，并用多因子降维法进行基因-基因和基因-环境之间的交互作用分析，由SPSS16.0统计软件、MDR2.0及MDRPTV0.4.6完成数据分析。

４.【技术路线】：

　１.将所有研究对象分为四组：

正常对照组，无症状慢性HIV携带者组，慢性乙型肝炎组，肝癌组。

每个研究对象均捐献外周静脉血2ml以获取基因组DNA用于基因型分析。

　２.基因组DNA的提取（酚一氯仿抽提法）:

　　基因组DNA用蛋白酶K和饱和酚一氯仿常规方法提取。

将收集的抗凝血标本从－20oc取出，置室温融化后转入另一洁净离心管，于5000xg离心15min:

弃上清，在下层血细胞中加入适量DNA裂解缓冲液（含10mMpH8.0Tris一HCI，0.IMEDTA，20拼目mL胰RNA酶，0.5%SDS），充分混匀后置37℃水浴lh，加入蛋白酶K（终浓度为100协留mL），混匀后于