大学论文 头孢氨苄的生产及工艺优化.docx

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大学论文头孢氨苄的生产及工艺优化

毕业论文

头孢氨苄的生产及工艺优化

学生姓名杨琪

班级G15

专业名称生物制药

系部名称生物工程学院

指导教师

提交日期2017年1月

答辩日期2017年1月

天津现代职业技术学院

目录

摘要……………………………………………………………………1

第1章绪论……………………………………………………………2

第2章头孢氨苄的生产现状…………………………………………3

2.1头孢氨苄的合成方法………………………………………3

2.2酶法合成的优点…………………………………………4

第3章青霉素酰化酶的发展…………………………………………5

第4章头孢氨苄酶法缩合技术………………………………………6

4.1酶催化缩合反应……………………………………………6

4.2产品的分离与纯化…………………………………………7

4.3过量原料的回收……………………………………………8

4.4酶反应器的选择……………………………………………8

第5章结论……………………………………………………………11

参考文献………………………………………………………………12

致谢……………………………………………………………………13

头孢氨苄的生产及工艺优化

摘要

头孢氨苄是第一代长效口服头孢类抗生素，广泛应用于用于敏感菌所致的呼吸道感染、泌尿道感染、妇产科感染、皮肤及软组织感染、淋病等疾病的治疗，在体内的作用时间长，稳定性优良，价格适宜，因此在国内外深受医生与患者的好评，该药用量在欧美各国也一直高居头孢菌素类榜首,近年来消费量仍持续上升，成为近年来口服抗生素中发展较快的品种之一。

本文要介绍了头孢氨苄生产现状和合成方法及工艺优化。

关键词：

头孢氨苄，头孢类抗生素，工艺优化，发展前景

第1章绪论

头孢氨苄属第一代头孢菌素，抗菌谱与头孢噻吩相仿，但其抗菌活性较后者为差。

除肠球菌属、甲氧西林耐药葡萄球菌外，肺炎链球菌、溶血性链球菌、产或不产青霉素酶葡萄球菌的大部分菌株对本品敏感。

本品对奈瑟菌属有较好抗菌作用，但流感嗜血杆菌对本品的敏感性较差；本品对部分大肠埃希菌、奇异变形杆菌、沙门菌和志贺菌有一定抗菌作用。

其余肠杆菌科细菌、不动杆菌、铜绿假单胞菌、脆弱拟杆菌均对本品呈现耐药。

梭杆菌属和韦容球菌一般对本品敏感，厌氧革兰阳性球菌对本品中度敏感。

本品通过抑制细胞壁的合成，使细胞内容物膨胀至破裂溶解，从而达到杀菌作用。

本品对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抗菌作用，注射后吸收迅速而完全，生物利用率高。

特别加入增效抗炎因子，使本品具有标本兼治得效果，其杀菌能力比青霉素类大20倍，比磺胺类大10倍、比喹诺酮类大5倍。

本品的特点是耐酸，口服吸收良好。

主要用于敏感菌所致的呼吸道感染、泌尿道感染、妇产科感染、皮肤及软组织感染、淋病等。

头孢氨苄（头孢立新、头孢菌素Ⅳ,cephalexin）经过多年的发展,已成为头孢类抗生素中的一个主要品种。

1998年头孢氨苄的世界年产量已经达到2450吨,在头孢类抗生素产量中占有绝对优势。

预计2000年后世界头孢氨苄的产量还会以2.5%的速度增长,也仍将是世界上消费量最大的头孢菌素。

2000年我国头孢氨苄产量为250吨左右,消费量在600吨以上。

虽然近几年因价格因素其销售额没有明显增加，但全球对头孢菌素的消费量有增无减。

第2章　头孢氨苄的生产现状

2.1头孢氨苄的合成方法

头孢氨苄的传统合成方法是从苯甲醛开始经化学合成制得侧链;从青霉菌发酵得到青霉素G（或青霉素V）,经化学扩环、裂解制得母核7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸（7-ADCA）;把母核和侧链经过化学方法结合而得到头孢氨苄。

现在世界上绝大多数生产头孢氨苄的企业（包括我国的生产企业）仍是沿用这一方法,整个生产过程大约需要10步化学反应,最终1kg产品所产生的三废高达30kg以上。

头孢氨苄的合成有2种方法,即化学半合成法（简称化学法,包括混酐法和酰氯法）和生物酶半合成法（简称酶法）,见图1。

近期利用DNA重组技术改造的微生物发酵直接制备7-ADCA的技术已经得到了较快的发展。

荷兰DSM公司于1998年开始投资25000万荷兰盾兴建发酵法生产7-ADCA的工厂,2001年已经开始批量工业化生产7-ADCA产品。

该发酵方法的主要优点是:

生产成本显著下降,产品更纯净,能耗更低和完全不使用有机溶剂。

头孢氨苄的酶法合成技术起始于20世纪70年代。

日本东洋酿造公司采用巨大芽孢杆菌B-400和无色杆菌B-402产生的青霉素酰化酶（青霉素酰基转移酶、青霉素酰胺酶、青霉素乙酰化酶,PenicillinAcylase）为催化剂,缩合制得头孢氨苄,并于1973年开始进行工业化研究。

利用青霉素酰化酶制备头孢氨苄的反应是在水溶液中进行,所用有机溶剂极少,反应条件温和,因此该技术得到了广泛的重视,但由于当时酶的性能差,把反应产物和未反应的原料从反应混合物中分离的技术也一直未能得到很好地解决,因此多年来酶法合成头孢氨苄的技术仍处于研究和试生产阶段。

国内外对该方面的综述已介绍得较为详细。

2.2　酶法合成的优点

我国从20世纪80年代开始介入生物转化β-内酰胺类抗生素方面的研究,并取得了一些成绩,但由于在酰化酶的提取、分离和固定化技术及产物、原料的分离回收技术等方面没有得到实质性突破,难以形成技术及经济优势,因此也难以在生产中得到实际应用。

荷兰DSM公司在酶法合成头孢氨苄的生产技术上已经取得重大突破,目前该公司在西班牙一工厂已于1998年开始用酶法合成头孢氨苄,设计生产能力达到每年500吨的规模,其收率已经超过化学法水平,达到90%以上。

另外美国礼来公司的酶法合成头孢氨苄的技术也已经达到同等的水平。

迄今为止,酶法合成头孢氨苄工艺技术的发展,已经达到使排放废水中仅含有一些简单的无机盐的程度,对人类生存环境已不构成危害,因此被誉为“绿色路线”（GreenRoute）。

然而采用传统的化学法合成头孢氨苄则需要用到二氯甲烷及其他溶剂、必须的化学计算量的硅烷化剂或其他羧基保护剂,如1,8-二氮杂二环（5,4,0）-7-烯（DBU）、四甲基胍（TMG）等、邓氏盐的侧链保护剂和乙酰化反应的激活剂（如特戊酰氯）等,最终都会形成大量的三废。

第3章青霉素酰化酶的发展

青霉素酰化酶是从微生物或其代谢产物中发现的一类具有特定活性的蛋白质。

能够产生青霉素酰化酶的微生物广泛分布于细菌、放线菌、真菌和酵母中,如:

醋酸杆菌、假单胞菌、粪产碱菌、黄单胞菌、产气单胞菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、枝状杆菌、克氏梭菌（Kluyvera）等,其中常用的有巴氏醋酸杆菌、粪产碱菌、巨大芽孢杆菌、柑橘黄单胞菌和大肠杆菌,尤以大肠杆菌最为常用。

为了获得廉价高效的青霉素酰化酶,人们对大肠杆菌等进行了选育和基因改造,用获得的大肠杆菌天然或工程菌株进行工业化生产而得到所需要的酶。

从大肠杆菌或其他微生物获得的酶可以以游离的形式使用,也可以被固定在载体上制成固定化酶（ImmobilizedEnzyme）使用。

与液体酶（酶溶液）相比,固定化酶的主要优点是:

①酶和反应液易于分离,酶可重复使用。

②稳定性高于天然酶。

③有利于反应过程的连续化和自动化控制。

④反应液中残留杂质少,有利于产品质量控制。

⑤产品的生产成本低廉。

从微生物发酵提纯的酶溶液制备固定化酶的方法大致可分为吸附法、包埋法和共价结合法三大类。

共价结合法具有酶与载体结合牢固、不易脱离等优点,因此应用较多。

其工艺过程为:

浓缩酶溶液在缓冲溶液中与交联剂（如戊二醛）和高分子载体进行振荡偶合,然后过滤洗涤得到固定化酶,所得固定化酶因其载体形态不同大致分为纤维状和颗粒状2种。

近年来使用颗粒状固定化酶比较普遍。

用做固定化酶载体的高分子材料有:

聚丙烯纤维、醋酸纤维、聚氨酯泡沫树脂、环氧树脂、丫内酯树脂等。

早期的固定化酶性能有很多缺陷,易失活和破碎。

近年来,随着生物工程技术和酶固定化技术的快速发展,青霉素酰化酶的固定化技术也取得了突破性进展,已经有性能稳定可靠的工业用固定化酶制品在生产中得到广泛的应用,如德国BoehringeMannheim公司生产的Enzygel,PGA-150和PGA-450、意大利米兰Recordati公司生产的固定化酶、德国RohmPharma公司生产的Eupergit和荷兰DSM公司（原Gist-Brocades公司）生产的Assem-blaseTM等。

第4章头孢氨苄酶法缩合技术

酶法制备β-内酰胺类抗生素的技术经过30多年的发展,在酶缩合反应技术、产品分离、过量反应原料的回收、酶反应器以及固定化酶技术等方面都有了很大的发展和提高,有关配套技术也日臻成熟与完善。

酶法制备β-内酰胺类抗生素的研究已经涉及头孢氨苄、阿莫西林、氨苄西林、头孢克洛、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢噻肟、头孢唑啉等品种。

下面对头孢氨苄酶法缩合的工艺技术的有关问题进行一些探讨。

4.1　酶催化缩合反应

在头孢氨苄酶法缩合反应中,所使用的酶基本上是采用固定化技术处理得到的固定化青霉素酰化酶,而早期使用的固定化细胞（细菌）等形态的酶,因其形态结构和性能方面的缺陷,已逐步被淘汰。

目前所使用的固定化酶,在生物工程菌的选育、发酵、酶的提取、固定化载体的选择和固定化技术等方面都有了长足的进步,已经较好地解决了早期固定化酶在形态结构和性能方面的缺陷;同时由于对固定化酶催化反应机制和反应动力学方面的深入研究,因此,在头孢氨苄酶法合成中,固定化酶的使用寿命已经大大延长,半数失活（half-life）批次已经达到50~100批以上。

在酶法制备头孢氨苄的缩合反应过程中,影响正反应进行程度的因素非常复杂,不仅取决于反应热力学,而且还取决于反应动力学。

酶法缩合过程是一个非常复杂的动力学过程,它既可以发生底物间的缩合反应,同时又使产物发生酶解反应,此种可逆反应过程又由同一种酶来催化完成。

除了酶本身的因素外,反应体系中的其他条件都会对反应程度有不同的影响,如:

反应体系温度、pH值,反应底物的纯度及浓度,反应原料带入的杂质和反应过程中产生的副产物及反应体系电解质浓度,反应产物的浓度等等。

为了克服酶缩合反应的逆反应———酶解反应对提高正反应产率的不利影响,人们进行了多方面的研究和探索。

为了提高酶缩合反应的产率,在反应中,侧链的投料量往往大大超过母核的投料量,有的甚至过量4~6倍（分子比）,才能得到工业上可以接受的产率,但同时也造成了侧链的过高消耗和在产品中引入不需要的杂质,对生产来说仍是不经济的。

目前人们已发现通过控制酶缩合反应体系中无机盐的浓度,可以降低酶解反应发生的程度。

另外向反应体系中加入少量的酶抑制剂（0.01mol·L-1左右）也可以降低酶解作用,同时又不会对酶催化缩合作用产生太大的影响,从而不仅可以得到较高的反应产率,而且还可以大大降低侧链的投料量,使侧链与母核的投料比例降到2∶1以内,就可得到工业上比较满意的结果。

用作酶抑制剂的物质有苯乙酸、苯氧乙酸、苦杏仁酸或其酰胺及酯的衍生物等。

为了降低酶解作用,人们还对固定化酶的载体进行了特别的研究,发现使用一种叫丫内酯的聚合物（EmphazeTM）的载体制成的固定化酶,可以降低苯甘氨酰胺（或其衍生物）和终产品（头孢氨苄）30%的水解,从而有助于提高产品的纯度和降低成本。

头孢氨苄的酶催化缩合技术近年来的发展水平已相当令人满意。

其中侧链与母核7-ADCA的投料比例已经降低到1∶1~2∶1（分子比）之间;反应底物的浓度可以达到300~600mmol·L-1;7-ADCA的转化率可以达到93%以上;反应温度控制在5~35℃。

4.2产品的分离与纯化

在酶法制备头孢氨苄技术中,产品分离与纯化的方法是一项关键性技术,由于所用的原料（苯甘氨酸衍生物、7-ADCA）和产物头孢氨苄的理化性质相近,采用普通的方法难以达到分离提纯的目的,因此该问题一直成为酶法合成头孢氨苄工业化生产的一大障碍。

目前已进行研究开发的头孢氨苄回收纯化方法有多种,如:

酸碱结晶法、浓缩结晶法、化学法（如萘酚复合物法）、柱层析法、纳滤等。

这些方法虽然都能达到分离纯化产品的目的,但各有其优缺点,还需要进一步的改进和完善。

采用酸碱结晶法分离产品,可以不用有机溶剂,从而避免对环境的损害,但是此方法并不能把产品一次性分离干净,母液中残留的产品仍需通过浓缩结晶或其他方法加以回收处理,而且产品纯度也不够理想,需要进一步的精制处理。

头孢氨苄与β-萘酚形成复合物的方法是一个比较简单可行的分离方法,反应体系中的头孢氨苄可以定量地与β-萘酚形成复合物而得到完全分离。

采用β-萘酚作为复合剂（complexingagent）,其非常适合有酶存在的反应体系,几乎是定量地产生头孢氨苄β-萘酚复合物。

另外,从化学合成的观点来看,一旦我们解决好从头孢氨苄β-萘酚复合物中分离纯化头孢氨苄和回收β-萘酚的问题,那么这将是一个非常好的分离纯化工艺,酶法合成头孢氨苄路线见图2。

采用柱层析的方法分离提纯头孢氨苄,可以得到高纯度、高回收率的头孢氨苄产品,同时也可以得到其他所需要回收利用的原料;但此方法的生产能力会受到一定的限制,同时还会产生大量的废水,这对环境保护来说是很不利的。

4.3　过量原料的回收

在酶法制备头孢氨苄的工艺中,使用的侧链可以有多种形态存在,但它们均是D-苯甘氨酸及其衍生物,主要有:

苯甘氨酸、苯甘氨酸酯（甲酯、乙酯等）及其盐、苯甘氨酰胺及其盐（硫酸盐、盐酸盐等）。

为了提高7-ADCA的转化率,侧链化合物往往要比7-ADCA过量50%~100%或者更多。

要保障头孢氨苄产品的质量和降低生产成本,就必须对未反应的侧链进行回收和利用。

由于在反应中加入的侧链形态不同,回收方法也就不同,目前比较成熟的可以运用于生产的回收方法是:

侧链采用苯甘氨酰胺或其无机酸盐投料,反应完毕后加入适当的醛类物质（如苯甲醛等）,使未反应的苯甘氨酰胺与醛反应,生成苯甘氨酰胺西夫碱（D-phenylglycineamideSchiffbase）结晶,从而使未反应的苯甘氨酰胺得到分离回收,回收率可以达到85%。

4.4　酶反应器的选择

在头孢氨苄酶法缩合反应中,反应器的选择依据酶的形态和特性以及对反应过程的控制和处理方法而不同,早期使用液体酶基本采用单个反应器间歇生产;随着固定化酶和产品分离控制技术的发展,酶反应器的选择逐步向连续化和自动控制方向发展。

根据前人的经验,提出以下酶缩合反应流程,根据该流程选择配备反应器,可以作为酶法缩合工艺产业化的一种方法,见图3。

在图3中,配制好的底物和固定化酶加入酶反应罐a中,通过夹层传温介质控制反应体系的温度,通过罐上配备的pH自动控制系统自动调节反应体系的pH值;酶反应液通过罐底的滤网b由泵通过管路c打入产品分离反应罐f中。

反应罐f中加入粉碎的β-萘酚,β-萘酚与酶反应液中的头孢氨苄反应生成头孢氨苄β-萘酚复合物沉淀,处理后的反应液经罐底滤网e经管路d泵入反应罐a中。

在本体系中,反应过程中生成的头孢氨苄可及时地被β-萘酚沉淀,使酶反应罐中产物浓度降低,有利于反应底物的完全转化,同时固定化酶对β-萘酚的存在不敏感,因此β-萘酚不会对酶缩合反应造成不利影响。

第5章结论

综合生物催化剂在合成β-内酰胺类抗生素（如头孢氨苄）方面的应用来看,该方法不仅可以大大减少化学合成反应步骤,而且还可以大大减少有机废弃物的产生乃至不产生有机废弃物,从而更有利于环境的保护和生产成本的降低。

因此21世纪头孢菌素的酶法合成应是一个发展的必然趋势。

当然,这还有许多工作要做,如在分子水平上更多地了解酶的作用机制,合理地设计出高的生物催化活性的酶（包括酶的固定化技术）,使其具有高专一性、高活性、低成本、低失活和高耐受性等;以及对酶法合成工艺的下游工序（包括通过现代分子学技术寻找选择吸附终产品的试剂等）的研究,均需要达到一个更高的水平。

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[10]顾觉奋.大孔网状吸附剂在抗生素分离纯化中的应用[J].中国抗生素杂志,1991,16（3）:

220-230.

致谢

岁月如梭，两年的大学学习生活很快就过去了，回头想一下，感觉逝去的一切就在眼前，时间真的过的太快了，还来不及回味就已结束，我的大学就这样结束。

在论文完成之际，我的心情万分激动。

从论文的选题、资料的收集到论文的撰写编排整个过程中，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意！

我首先要感谢闫雪冰老师，在我写论文的过程中，闫老师给了我耐心的指导和无私的帮助。

为了指导我的毕业论文，她放弃了自己的休息时间，她的这种无私奉献的敬业精神令人钦佩，在此我向她表示我诚挚的谢意。

是她将我领入了信息安全的大门，并对我的研究提出了很多宝贵的意见，使我的研究工作有了目标和方向。

同时，闫老师渊博的学识、严谨的治学态度也令我十分敬佩，是我以后学习和工作的榜样，她循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。

同时，感谢所有任课老师和所有同学在这两年来给自己的指导和帮助，是他们教会了我专业知识，教会了我如何学习，教会了我如何做人。

正是由于他们，我才能在各方面取得显著的进步，在此向他们表示我由衷的谢意，并祝所有的老师培养出越来越多的优秀人才，桃李满天下！

还要再次感谢闫老师对我的关心和照顾，在此表示最诚挚的谢意。

感谢生物制药技术系的各位同学，与他们的交流使我受益颇多。

感谢我的家人以及我的朋友们对我的理解、支持、鼓励和帮助，正是因为有了他们，我所做的一切才更有意义；也正是因为有了他们，我才有了追求进步的勇气和信心。

最后，感谢所有关心我、帮助过我的老师、同学和朋友！

写作毕业论文是一次再系统学习的过程，毕业论文的完成，同样也意味着新的学习生活的开始。

由于时间的仓促及自身专业水平的不足，整篇论文肯定存在尚未发现的缺点和错误。

恳请阅读此篇论文的老师、同学，多予指正，不胜感激！