血凝操作规程.docx

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血凝操作规程

血

凝

项

目

标

准

操

作

规

程

1．一般注意事项

样品收集

●静脉抽血；

●穿刺要一针见血，避免淤血，气泡，溶血和组织液污染；

●若是利用真空收集管，以第二或第三管样品为佳；

若是从导管取样，则需用生理盐水冲洗管道，前面5ml血不能利用；

●采血后当即与抗凝剂充分混合，尽快送往实验室；

●采血量必需准确，若是少于计划量的90%，则不能利用；

●不能在静脉穿刺部位或周围部位采样。

样品处置

●利用%或%（W/V）枸橼酸钠溶液作为抗凝剂；

●血样与抗凝剂的比例为9：

1，若是血球压积﹤20%或﹥55%，则需调整这个比例，

方式是：

血液毫升数X（100-压积）=抗凝剂毫升数；

●血浆分离（若是不能当即测试，应尽快分离血浆）；

——采样后60分钟内进行；

——离心速度为1000g/10分钟

●盛血浆容器应加塞，避免PH改变；

●血浆应保留在2-8℃；

●血浆寄存时间不能太久；

温度

有效时间

室温

≤2hr

2-8℃

≤4hr

-20℃

≤2weeks

-70℃

≤6months

●低温保留的样品，要在37℃迅速解冻，减低凝血因子的消耗，并当即测试。

●与样品接触的所有器材（注射剂，样品管，检测杯等）必需采用塑料袋或硅化玻璃材质。

●全数器材均不得含去污剂或清洗液。

影响测定结果的几种因素

●抗凝剂：

草酸钠、EDTA、肝素不适于作抗凝剂；

●黄疸，脂血，重度溶血和冰冻血浆影响测定结果不准；

●利用纤溶药物，如双香豆素，链激酶，尿酶等可使凝固时间延长；

●超过医治试剂量的肝素使凝固时间延长；

●FDP增加使凝固时间延长；

●某些药物，如口服避孕药，雌激素，天门冬酰胺酶，钠络酮等影响测试结果；

●样本收集和处置不妥，都会使凝固时间缩短或延长；

●怀胎和急性炎症会影响某些测试结果。

干粉试剂及血浆溶解

●保证干粉完全溶解；

●溶解时，轻轻转动容器，避免猛烈震荡；

●确认溶剂种类，一般溶解液包括：

蒸馏水/生理盐水/缓冲液/厂家特定溶解液，按说明书选择；

复溶后，室温放置5-10分钟后方可利用

二．具体项目操作注意事项

凝血酶原时间

I.概述

凝血酶原时间（ProthrombinTime）测定用来作为外科手术前对某一凝血因子的评价，和用于监视抗凝医治，当进行凝血酶原时间测试时，对于正常结果需有二、3级所有因子。

因此，该实验对因子I、II、V、VII和X的量减少或不足是很灵敏的。

除因子IX，凝血酶原时间测试对于其它所有因子缺乏是灵敏的，它已被证明在监视抗凝医治是有效手腕。

凝血酶原时间测定也用于因子II、V、VII和X的定量分析（因子分析）。

II.试剂

干粉试剂需复溶，液体试剂直接利用，利用前轻轻混合，可利用一些备件如搅拌。

利用期间维持适当的悬浮液状态。

如质控结果在范围之外，或试剂颜色发生转变，可能表明产品变质。

但是，差的性能、结果也可能是由于其他因素包括实验系统引发的。

警告：

PT-DS试剂含有叠氮钠，勿服、勿接触皮肤和黏膜。

III.样本搜集

%（0.109M）枸橼钠做为抗凝剂。

避免溶血和其他组织液的污染。

样本体积不得少于所需体积的90%。

在3000×g下离心10分钟，如样本在22—24℃下，须在2小时内测定。

有关样本搜集和贮存的详细资料，请参见NCCLS文件。

IV.步骤

提供材料PT试剂

另需材料：

①纯化水

②适合的计时器

③精密移液管：

和

④正常和异样质控物，（凝血质控血浆三个水平）

PT适合于手工、仪器、光度计和其它凝固的测定方式。

手工方式

A：

在37℃预热PT试剂；

B：

加血浆到比色杯中，在37℃下预热；

C:

使劲加预热的PT试剂到血浆中凝结形成，并记录时间建议至少利用一正常和一异常对照血浆，每40份病人样品至少一次轮换，逐日测定对照血浆，建议每一个实验室应做好室内质控范围。

V.结果

用最近的秒报告每一个血浆的凝固时间，所得PT时间结果与正常参考范围值一路列入报告。

（勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人比值。

质控仅仅是为了保证明验系统的准确性。

）

VI.局限性

血凝生物化学包括一系列受许多预实验条件影响的反映。

这些变异性必需被控制，以取得好的结果：

样本搜集

勿延迟血液与抗凝剂的混合；

避免样本产生泡沫；

用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；

混浊、溶血、脂血或黄疸的样本，可能会引发错误结果；

冷冻和解冻包括残留细胞血浆，会裂解细胞膜而影响结果；

急性炎症反映由于纤维蛋白原的升高，会缩短PT结果；

红细胞压积在20—55%范围之外，所加抗凝剂需调整比例。

技术：

若是血浆暴露到空气中pH将升高；

PT工作要求37℃±0.5℃。

常常检查加热部份的温度。

在4—8℃维持的血浆可能会引发冷激活而致使PT缩短；

所有的实验器皿必需清洁，没有脏物痕迹；

依照仪器供给商的要求，保养仪器。

影响物质：

草酸钠，EDTA和肝素不适合做抗凝剂；

口服避孕药物、天门冬氨酰胺酶、皮质酮、EDTA、红霉素、酒精、四环素和抗凝剂如肝素和华法令可能引发PT延长。

抗组织胺药、布塔巴比妥、咖啡因、口服避孕药、苯巴比妥、维生素K.可能引发PT缩短。

VII.期望值

PT对正常人评估可取得以下结果

平均±2SD范围

仪器—

可见光度计—

这些值仅作为一个指导，每一个实验室应成立自己的正常参考范围。

试剂、仪器操作、血样搜集技术或抗凝剂的改变，都应从头成立新的正常参考范围。

有关性能特征、因子分析精密度等详见英文说明书。

测定试剂

I.概述

APTT（ActivatedpartialThromboplastintime）测试普遍应用已有数年，用作外科手术对某些凝结因子的评价，和监视肝素医治。

当测定APTT时，所有内途径因子对于正常结果是必需的。

但是它主腹地用于检测2级因子的不足，即因子VIII、IX、XI和XII，和Fletcher因子（4）。

APTT测试也用于监视肝素医治，测定结果显示延长单位以上（5）。

此实验也用在因子VIII、IX、XII和Fletcher因子的定量测度（因子分析）。

II.摘要与原理

APTT的延长直接与肝素量的增加成正比。

APTT时间测定就是加入APTT试剂混合物在此37℃孵育3分钟“激活”，再加CACl2计数凝块形成时间。

III.试剂

试剂在2—8℃保留，勿冷冻，开瓶后在2—8℃可稳定30天。

长时间贮存后，可能会出现黄色沉淀。

在利用前轻轻混合。

不稳定值、超出质控范围之外的值或产品颜色转变，可能表明试剂变质。

但是其它因素包括实验系统也可能引发这些误差。

IV.样本搜集

%（0.105M）或%（0.109M）柠檬酸作抗凝剂，避免溶血和其它组织液体污染。

样本体积不得少于所需体积的90%。

在3000×g离心10分钟，如样本放在22—24℃下，需在2小时内测定。

有关样本搜集和贮存的详细资料，请参见NCCLS文件。

V.步骤

提供材料：

APTT试剂。

另需材料：

①美创公司提供的CaCl2（0.025M），高纯度、高质量；

②适当的计时器（秒表和时间表）；

③精密移液管：

；

④正常和异样质控，（凝血质控血浆，1、2、3、三个水平）APTT是适用于手工、仪器、光度计和其它凝结测定的方式。

手工方式：

A：

在37℃预热CACL2（0.025M）；

B：

加测定血浆到比色杯中，在37℃预热；

C：

加预温过的APTT试剂入测定血浆中，混合；

D：

在37℃下孵育血浆试剂混合物3分钟。

（激活时间），为了实验的一致性，用一样的激活时间，测定所有血浆；

E：

使劲加预热的CACL2，凝结形成，注意凝块形成时间。

用正常、异样质控血浆（如美创公司的质控三个水平1、2、3）与病人血浆结合起来测定。

建议至少用一个正常和一个不正常血浆，至少每测20份病人样本轮换一次。

VI.结果

用最近的秒报告每一个血浆的凝结时间，所得APTT时间结果与正常参考范围值一路列入报告。

（勿报告相对于商业质控血浆凝结时间的病人的值。

质控仅仅是为了保证明验系统的准确性。

）

VII.局限性

血凝生物化学包括一系列受许多预实验条件影响的反映。

这些变异性必需被控制，以取得好的结果。

样本搜集：

勿延迟血液与抗凝剂的混合；

避免样本产生泡沫；

用塑料或硅硼酸盐玻璃容器；

混浊的溶血、脂血或黄疸的样本，可能引发错误结果；

反复冷冻和解冻血浆，会损伤细胞膜，会影响结果；

血胞压积在22—25%范围之外，所加抗凝剂需调整比例；

技术：

若是血浆暴露到空气中pH值将升高；

APTT工作要求37℃±0.5℃，常常检查所有加热部份的温度；

所有的实验器皿必需被清洁，没有赃物痕迹；

依照仪器供给商的要求，保养仪器。

影响物质：

草酸钠，EDTA和肝素不适合作抗凝剂；

口服避孕药物，雌激素，怀孕，氧杂萘邻酮类的药物，肝素，天门冬氨酰胺酶和naloxone已有报导报告会影响APTT结果。

VIII.期望值

APTT-LS正常人可取得下面结果：

平均±2SD范围

仪器24-38

可见光度计—

这些值仅作为一个指导，每一个实验室应成立自己的正常参考范围。

试剂、仪器操作、血样搜集技术或抗凝剂的改变，都应从头成立新的正常参考范围。

3.纤维蛋白原

采用clauss法，即在待检稀释血浆中加入高浓度的凝血酶，血浆凝固时间与血浆纤维蛋白原浓度成反比。

二、试剂及材料准备

1.冻干牛凝血酶（100NIHUnit/ml）干粉或液体

2.纤维蛋白原参比血浆

瓶，3瓶/盒

该制剂系人枸橼酸钠抗凝血浆，加入稳定剂缓和冲液后冻干而成。

利用前用蒸馏水溶解，轻轻摇动至完全溶解。

2—8℃寄存可以稳定一周，也可-20℃冻存，避免反复冻溶。

3.咪唑缓冲盐水±

135ml/瓶，1瓶/盒

该缓冲液以叠氮钠为防腐剂，叠氮钠如遇酸将产生有毒化合物，因此，含有该剂的容器、试管及抛弃的试剂均应用大量流水冲洗。

另外，亦应避免该试剂在金属管道内沉积。

4.塑料试管（自备）

5.移液器100μl、200μl（自备）

6.正常及异样质控血浆（自备）

7.双对数坐标纸

三、方式

（一）标准曲线的制备

1.稀释的纤维蛋白原参比血浆的制备

将已知浓度的纤维蛋白原参比保留浆用咪唑缓冲盐水稀释成1∶五、1∶10、1∶1五、1∶20、1∶40，5个浓度。

2.每稀释度各取、37℃预热5分钟，然后加入室温的凝血酶，记录各稀释度的血浆凝固时间。

每稀释度重复2—3次测定，取平均值。

3.以各稀释度纤维蛋白原的浓度为纵坐标，对应的血浆凝固时间的平均值为横坐标，在双对数坐标纸上绘制标准曲线，每条标准曲线至少应包括所做的5个稀释度中的持续3个以上的点。

不然结果不予接受，应从头绘制。

（二）标本的测定

1.标本收集：

%或%的枸橼酸钠1∶9抗凝全血，以RCF3000×g离心10分钟，分离血浆待检。

在室温条件下，标本寄存不该超过2小时，2小时不能完成检测，应冻存。

2.测定步骤

①待检标本用咪唑盐水1∶10稀释。

②取1∶10稀释的血浆、37℃预热5分钟，然后加入已预热的凝血酶试剂，记录血浆凝固时间。

③按照血浆凝固时间在标准曲线上查得标本的纤维蛋白原浓度。

④若血浆凝固时间超出标准曲线的范围，若太长将标本作1∶5稀释,太短改作1∶20稀释，从头测定凝固时间，如标本作1∶5稀释，将从曲线上查得结果除2，如标本作1∶20稀释，将从曲线上查得结果乘2，取得最终结果。

四、参考范围2.0g～4.0g/l（200～400mg/dl）

五、注意事项

1.分离的血浆中不该含有细胞成份；

2.纤维蛋白原含量低于1.5g/l，而血浆FDP含量明显增高时，可致标本的测定结果较实际结果低；

4.TT测定

一、样本搜集

A.抗凝细胞压积剂：

%枸橼酸钠血样与枸橼酸盐的比例为9∶1。

但是，对于个别病人血细胞压积低于20%或高于55%，须调整这个比例以保证取得结果。

下面公式用来计算调整抗凝剂的量。

×血液（ml）×（100-血细胞压积）=抗凝剂（ml）

B.样本搜集：

血样可用针刺或其它方式取得。

针刺是非损伤性的，避免溶血或其它组织液的污染。

C.样本处置：

血液搜集后当即用抗凝剂轻轻混合，用RCF3000×g离心10分钟，过量血小板污染的血浆可能会引发一些因子水平假性升高，包括纤维蛋白原（因子1），分离血浆勿使红细胞混入，或当即做实验。

盖好样品以避免样品pH值转变而影响实验结果。

样本在22—24℃下,可稳定2小时，在-20℃下稳定2周，在-70℃下稳定6个月，样本在37℃下快速解冻并当即测定。

二、试剂

TT试剂在2—8℃下保留。

三、凝血酶凝结时间步骤

37℃孵育未稀释的血浆3分钟，加TT试剂，测定凝结形成时间。

四、解释

像其它实验一样，正常范围按如实验室，和所利用的仪器的不同，会有所不同。

但是，当利用TT试剂如上面步骤三所提到的实验时，正常的个人将凝血酶原时间一般地约为10-18秒。

五、参考文献（略）

肝素可致本方式测定结果减低。