生化技术实验.docx

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生化技术实验

石河子大学

本科生课程论文封面

（课程名称：

生物技术试验）

学院生命科学学院

年级生物技术2009级

（2）班

姓名冯敬磊

学号2009061685

生物技术实验结题报告

冯敬磊

生命科学学院生技2班

【摘要】基因工程是指通过将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，从而使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。

本实验以基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性。

实验设置内容包括：

质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定、目的基因的获得和重组载体的构建、感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定、目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定。

【关键词】基因工程；DNA重组；PCR扩增；感受态细胞；转化；

前言基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术，广泛应用于农业、医学、食品工业等。

基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。

本生物技术大实验以基因工程的研究程序为主线，综合了质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定、目的基因的获得和重组载体的构建、感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定、目的基因在原核细胞中表达与SDS-PAGE鉴定等实验，整个实验基本上就是一个连续的过程。

本实验的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA重组实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。

1实验主要材料、试剂和仪器

1.1实验主要材料和试剂

1.1.1质粒的提取：

大肠杆菌DH5a菌株、LB培养基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、酚氯仿抽提液、无水乙醇

1.1.2酶切反应：

DNABL21质粒，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，λDNA。

1.1.3连接反应：

酶切后的DNABL21质粒、PCR扩增回收目的片段和λDNA，连接10×buffer，T4连接酶，重蒸水。

1.1.4感受态细胞的制备：

大肠杆菌DH5a菌株、LB培养基、0.1MCaCl2

1.1.5转化：

连接液和感受态细胞、LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、X—gal

1.1.6菌落PCR法鉴定：

重组质粒DNA菌落、dntp、TaqDNA聚合酶、引物、10*buffer、ddH2O、琼脂糖，TAE、GoldView核酸染液

1.1.7蓝白斑检测：

酶切后的DNAPUC19质粒，试剂盒抽提的DNA，酶切10×buffer，HindⅢ,重蒸水，琼脂糖，TAE缓冲液。

上样缓冲液，GoldView核酸染液

1.2实验仪器培养、三角瓶、接种环、酒精灯、玻璃涂棒、无菌牙签、吸水纸、火柴、移液枪和20、200、1000ul的枪头、离心管（6ml、1.5ml、200ul）超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、涡旋振荡器、制冰机、水浴锅、冰箱、离心机、电泳槽、电泳仪、紫外透射仪、PCR扩增仪等

2实验主要内容

2.1质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定

2.1.1质粒DNA的小量制备

2.1.1.1原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。

在pH12.012.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。

尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。

2.1.1.2步骤

（1）在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。

（2）从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pMD-18T-NK的菌种，在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。

（3）取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液，留沉淀备用。

在沉淀中加入100l溶液I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（4）加入200l溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（5）加入150l溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（6）15000rpm离心5min，小心吸取400l上清液于另一个干净的1.5ml离心管中，加入800l95%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（7）15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。

15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净

（8）再加入500l70%乙醇，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。

15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净

（9）离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥30min，保存在-20℃的冰箱中。

2.1.2质粒DNA电泳鉴定

2.1.2.1原理DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。

不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。

2.1.2.2步骤

（1）称取0.2g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入20mlTAE电泳缓冲液

（1），放入微波炉中烧开（1min）。

（2）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60C）。

（3）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。

在桌面上静置20-40分钟待胶完全凝固。

（4）小心拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，加缓冲液。

（5）取5l质粒DNA及2l加样缓冲液均匀上样。

（6）80-100V电泳约30min。

（7）紫外透射仪观察结果。

2.1.3质粒DNA的酶切

2.1.3.1原理II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。

2.1.3.2步骤

（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：

pET-hisDNA（或pUCm-T-NK）6μL

10×酶切缓冲液（用EcoRI的缓冲液）2μL

ddwater30μL

EcoRI1μL

BamHI1μL

总体积40μL

（2）从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。

（3）小心地吸取1μL限制性内切酶。

（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后，轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。

再在离心机中1000rpm离心10秒。

取出后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育1-3h（一般是37℃）。

（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。

2.2目的基因的获得和重组载体的构建

2.2.1PCR扩增制备目的基因

2.2.1.1原理是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。

再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。

2.2.1.2步骤

（1）在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。

ddwater18.7μl

10×PCRbuffer（含MgCl2）2.5μl

2.5mmol/LdNTP1μl

10μmol/LPrimer11μl

10μmol/Lprimer21μl

模板质粒0.5μl

2.5U/μlTaq酶0.3μl

总体积25μl

（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：

①94℃4min

②94℃30sec

③55℃30sec

④72℃40sec

⑤goto30times

⑥72℃8min

（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。

观察胶上是否有预计的主要产物带。

2.2.2目的基因片段与载体连接

2.2.2.1原理在Mg2+和ATP存在下，T4DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。

2.2.2.2步骤

（1）事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在14～16C。

（2）取一个灭菌的1.5ml微量离心管，加入：

5lPCR产物混合液

1lpGM-T载体

1lT4DNA连接酶

1l连接酶缓冲液

2lddWater

总量10l体系

（3）述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14C水中保温过夜。

2.3感受肽细胞的制备和转化及筛选鉴定

2.3.1感受态菌的制备

2.3.1.1原理细菌在0CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为容易吸收外源DNA的状态。

2.3.1.2步骤

（1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2mlLB培养基。

（2）从超低温冰柜中取出DH5菌种和BL21（DE3）菌种，放置在冰上。

在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含2mlLB培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。

（3）取0.5ml上述菌液转接到含有50mLLB培养基的三角烧瓶中，37℃下250r/min摇床培养23h，测定OD590为0.375。

以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。

（4）将菌液分装到1.5mL预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min。

（5）将离心管倒置以倒尽上清液，加入1ml冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置30min。

（6）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用1mL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，插入冰中放置30min。

（7）4℃，5000rpm离心10min，弃上清液后，用200μL冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管100L分装到1.5mL离心管中。

可以直接用作转化实验，或立即放入-70℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。

2.3.2连接产物转化感受态细胞

2.3.2.1原理质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42C短时间的热击处理，促进吸收DNA。

然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

2.3.2.2步骤

（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。

（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μL）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。

（3）加入5μL连接好的质粒混合液，轻轻震荡后放置冰上20min。

（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中12min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置35min。

（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μLLB培养基轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

（6）在超净工作台中取上述转化混合液100300μL，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀

（7）在涂好的培养皿上做上标记，先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜，直至长出单菌落。

2.3.3白斑菌落的PCR鉴定

2.3.3.1原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。

再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。

2.3.3.2步骤

（1）在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻璃背面画圈做标记编号。

（2）在0.2mlPCR微量离心管中配制25μl反应体系。

ddwater16μl

10×PCRbuffer（不含MgCl2）2.5μl

25mMMgCl21.5μl

2.5mmol/LdNTP2μl

10μmol/LPrimer11μl

10μmol/Lprimer21μl

Taq酶0.5μl

总体积25μl

（2）根据厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：

①94℃5min

②94℃30sec

③55℃30sec

④72℃40sec

⑤goto30times

⑥72℃8min

（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。

观察胶上是否有预计的主要产物带。

按照编号找到培养皿中的原菌斑。

2.3.4外源基因的诱导表达

2.3.4.1原理外源基因克隆在含有lac启动子的表达系统中。

先让宿主菌生长，lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合抑制下游的外源基因转录。

向培养基中加入诱导物IPTG（异丙基硫代--D-半乳糖），解除抑制使外源基因大量表达。

表达的蛋白可经SDS-PAGE或Western-blotting检测。

2.3.4.2步骤

（1）在超净工作台中接种含有pET-hisNK重组载体的菌株，培养于两个三角烧瓶各20mlLB-葡萄糖培养基（含抗菌素Amp120μg/ml）的摇菌管中，慢速70--90转/分钟30C摇菌过夜。

（2）至第二天上午8：

30OD600约为0.5，加IPTG至100μg/ml，150--170转/分钟37C诱导1.5-3h。

同时做不加IPTG诱导和非转化的空菌诱导的对照培养。

（3）4000rpm离心15min弃掉上清液，收获菌体，走SDS—PAGE电泳分析。

菌体也可放在-20C以下保存备用。

（4）配制10%分离胶。

按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（Tris为pH8.8）：

Acrylamide-bis3.96mL

1MTrisPH8.84.38mL

d.dWater3.432mL

10%SDS118.8L

TEMED9.9L

10%APS118.8L

（5）配支持胶。

按顺序和量取下列溶液混在一个50mL的小烧杯中（Tris为pH6.8）：

Acrylamide-bis0.675mL

0.5MTrispH6.80.563mL

ddwater3.165mL

10%SDS45L

TEMED7.5L

10%APS45L

（6）样品处理。

将表达后的菌体与2上样缓冲液按1：

1混匀于微量离心管中，用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。

中间间隔时放入冰中降温。

将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮35min。

然后立即插入冰中。

（可在-20C冰柜中保存）。

（7）电泳。

接好电极，将电流调至10mA，待溴酚蓝移到分离胶后，在将电流调至18mA，电泳约23h，期间随时观察电泳槽上部的液体是否有泄漏（泄漏导致液面下降，电流中断）！

当溴酚蓝移到玻璃距底部0.5cm时切断电源。

（8）染色。

考马斯亮蓝染色液染色4-8h。

（9）观察脱色后胶里的蓝色带纹，与对照比较或寻找异常粗的带纹，并比较其分子量（NK蛋白约33kDa），判断是否是预期的基因产物。

3实验结果及分析

3.1质粒提取过程中所观察到的现象

加入溶液Ⅰ：

混匀后呈浑浊乳白色

加入溶液Ⅱ：

加溶液Ⅱ几分钟后溶液变粘稠、变澄清。

加入溶液Ⅲ：

染色体DNA与蛋白质开始形成白色沉淀。

离心后质粒DNA留在上清液中，染色体DNA与蛋白质作为沉淀而留在管底。

加等体积酚/氯仿：

分层，上层澄清水相，中层白色浑浊为蛋白质，下层微黄澄清为有机溶剂

加入等体积氯仿/异戊醇：

下层水相上层为有机物

图2加入裂解液Ⅲ

图1加入裂解液Ⅰ

图3加氯仿：

异戊醇

3.2质粒提取的琼脂糖凝胶电泳

质粒DNA在琼脂糖凝胶中一般为三条带，最前面的条带为超螺旋构型，中间为线型，最后为单链有缺刻的构型。

如提取过程中有机械损伤，可能在胶上出现弥散

3.3质粒的酶切与回收

图4图5

3.4蓝白斑检测

主要是利用a互补现象，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色

3.5目的基因的表达检测

目的基因中插入了绿色荧光蛋白基因，在菌体中复制并表达，当把重组菌进行PCR扩增时目的基因也进行了扩增，在紫外光的照射下，产物发出绿的的荧光。

图中为不同时间段进行的扩增，即每次相隔一个小时。

由图中的编号可看出表达产物随时间递增，荧光的亮度也一次增加。

4实验总结本次试验是我们大部分同学第一次进行完整的基因重组技术实践。

以前学习的相关理论上的知识，在试验中发挥了很大的作用，而基础知识不够扎实的我也发现了自身的很多问题，不能将所学知识运用于实践就不算是掌握了这些知识。

4.1做实验前应准备充分。

课前要提前预习实验内容、弄懂实验设计的原理、理清实验顺序、懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验，以免造成实验失败或不必要的损失。

4.2实验过程中须操作严格。

实验过程中要严肃认真地按操作规程进行实验，并及时记录实验结果。

4.3实验中应注意节约。

使用仪器、药品、试剂和各种实验物品必须节约，使用仪器时应小心谨慎。

4.4实验后桌面、仪器等应保持实验前的状态。

实验台应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐，公共试剂用毕，应立即放回原处。

4.5实验要实事求是。

实验数据及结果应如实、完整地记录在实验记录本上，文字简练、准确，养成良好的实事求是的工作作风和求真务实的科学态度，不能伪造实验结果。

最后，感谢何大俊老师的辛勤指导，研究生师哥无私的帮助。

还有，同组同学协力合作使得实验进行的比较顺利，如期完成。

参考文献

1朱新霞,何大俊.生物技术实验讲义[M].石河子:

石河子大学生命科学学院,2012:

38

2魏群.分子生物学指导[M].第二版.北京:

高等教育出版社，2007:

171

3郝福英.分子生物学实验技术[M].北京:

北京大学出版社，2001:

130