IEF使用过程中常见问题及解决方法.docx

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IEF使用过程中常见问题及解决方法

IEF使用过程中常见问题及解决方法

以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。

如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上.同时系统的电源供应会在错误信息显示时自动切断。

问题

可能原因

解决方法

初始电流低或为零

•IPG胶条与电极接触不好.

•检查IPG胶条与电极的接触情况，确保聚焦槽的盖子正确地合上。

•PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极接触不完全。

•检查聚焦盘的放置位置，确保PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极正确接触。

•IPG胶条水化不完全

•确保IPG胶条完全并平均地进行水化。

检查水化液体积及水化时间。

在升压过程中电压不上升。

•盐浓度过高

•检查盐浓度并对样品进行除盐处理。

电压未能达到预设电压或达到极限电压过程非常缓慢

•Bio-Lyte浓度过高

•将Bio-Lyte浓度降至0。

2%（v/v）.

•对不同尺寸的IPG胶条和pH梯度电压设置过高.

•在聚焦时请用伏小时进行编程，以确保样品的完全聚焦。

•过多的样品在水化过程中未能进入胶条，或IPG胶条因过多的样品导致过度泡涨

•如果使用了超过了推荐的样品体积量，确保所有样品能进入胶条，或在聚焦前除去多余的样品液。

电压及电流波动很大。

（同时电阻错误信息会显示）

•IPG胶条中有水化较差的区域，或IPG胶条在运行过程中已经烧干。

•检查水化缓冲液体积及时间.确保在水化期间水化缓冲液平均地分配.

•限流过高。

•建议限流50μA/胶条。

确保输入正确的IPG胶条数目。

问题

可能原因

解决方法

烧胶条（这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示。

）

•限流过高.

•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.

•IPG胶条已经烧干.

•确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干

•电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液.

•确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态。

•水化缓冲液成份不合适，盐浓度过高.

•检查水化缓冲液浓度.必要时重新配制缓冲液.

双向电泳实验中常见问题

一、水平条纹

出现的问题：

胶上出现连续性横纹。

可能的原因：

蛋白质没有完全和稳定溶解。

推荐解决的方法:

∙用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。

因此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e。

g。

CHAPS,ASB—14），两性电解质和还原剂（DTTorTBP）非常重要。

每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。

为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液：

o8–9Murea,4％（w/v）CHAPS,2mMTBPor50mMDTT，40mMTris，0.2％（w/v）Bio—Lyte3/10Ampholyte

o7Murea，2Mthiourea,4%（w/v）CHAPS,2mMTBPor50mMDTT，40mMTris，0。

2％（w/v）Bio-Lyte3/10Ampholyte

∙样品须有充分的溶解时间和变性时间。

通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1小时左右。

∙进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（〉10,000rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。

推荐产品:

ReadyPrepproteinextractionkit（totalprotein/全蛋白）

出现的问题：

出现不连续的横纹。

可能的原因:

样品中含有干扰物质，比如盐类，离子去污剂（SDS）,肽类，核酸类（e.g。

DNA，RNA），脂类,多糖和酚类化合物。

推荐解决的方法:

以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。

更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）。

盐：

为确保IEF顺利完成，样品中的总盐类不得超过40mM。

样品中的盐类物质可以通过透析，凝胶过滤，蛋白浓缩，或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。

蛋白质沉淀可以选用10％TCA丙酮处理（Damervaletal.1986）,也可选用ReadyPrep2—Dcleanupkit。

沉淀后,可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品.注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。

阴离子去污剂:

SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。

SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。

但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。

如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。

最终，样品中SDS的含量须低于0.25%（w/v），样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：

1。

如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。

核酸：

处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率.核酸物质会增加样品的粘性,并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。

同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。

通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。

在样品中加入0。

1xsolutioncontaining1mg/mlDNaseI,0。

25mg/mlRNaseA，and50mMMgCl2而后冰浴（Blombergetal。

1995）.注意：

Mg2+离子是DNase活性所必须的。

多聚糖类:

同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF.此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷,因其所带的负电荷能和蛋白质作用,从而在2—D胶上形成横条纹.建议通过TCA/丙酮沉淀（Damervaletal.1986）；或者醋酸铵沉淀后酚抽提（HurkmanandTanaka1986）;或者使用ReadyPrep2—Dcleanupkit处理样品。

脂类：

蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。

在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶,也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。

一个破坏脂—蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前，须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物（WesselandFlugge1984）.

酚类化合物：

植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。

这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。

酚类化合物的影响,可以通过以下方法去除。

1。

酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone（PVP）orpolyvinylpolypyrrolidone（PVPP）吸附。

2.样品制备中加入DTT,抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。

3。

氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。

4。

裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮（Damervaletal.1986）。

，可以抑制酚氧化。

推荐产品:

ReadyPrep2—Dcleanupkit

Bio—Spin/MicroBio-Spin6columns

出现的问题:

出现不连续的横纹。

可能的原因：

样品中含有干扰物质，比如盐类,离子去污剂（SDS）,肽类,核酸类（e。

g.DNA，RNA），脂类,多糖和酚类化合物。

推荐解决的方法：

以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法.更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）。

盐：

为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM.样品中的盐类物质可以通过透析，凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去.蛋白质沉淀可以选用10％TCA丙酮处理（Damervaletal.1986），也可选用ReadyPrep2—Dcleanupkit.沉淀后,可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。

注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。

阴离子去污剂:

SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。

SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。

但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响.如果在样品制备中使用SDS,那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰.最终,样品中SDS的含量须低于0。

25％（w/v），样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：

1。

如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS,并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。

核酸：

处理培养细胞和从组织中分离的细胞时,往往造成很高的蛋白/核酸比率。

核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。

同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹.通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。

在样品中加入0。

1xsolutioncontaining1mg/mlDNaseI,0。

25mg/mlRNaseA,and50mMMgCl2而后冰浴（Blombergetal.1995）。

注意:

Mg2+离子是DNase活性所必须的。

多聚糖类：

同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF.此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。

建议通过TCA/丙酮沉淀（Damervaletal。

1986）;或者醋酸铵沉淀后酚抽提（HurkmanandTanaka1986）；或者使用ReadyPrep2-Dcleanupkit处理样品。

脂类：

蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2—D胶上造成假象。

在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。

一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前,须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物（WesselandFlugge1984）。

酚类化合物：

植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。

这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。

酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。

1.酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone（PVP）orpolyvinylpolypyrrolidone（PVPP）吸附。

2.样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。

3。

氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。

4.裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮（Damervaletal.1986）.，可以抑制酚氧化。

推荐产品:

ReadyPrep2—Dcleanupkit

Bio—Spin/MicroBio-Spin6columns

出现的问题：

胶部分出现横纹。

可能的原因:

蛋白上样量过高。

推荐解决的方法：

a）稀释样品，降低样品浓度.在进行IEF前,须对样品进行定量，以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度.蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定.

b）使用长IPG胶条,和更宽的PAGE胶可以增加蛋白样品上样量,详细请见下表：

IPGStripLength

7cm

11cm

17cm

18cm

24cm

Rehydration

volumeperstrip

125µl

185µl

300µl

315µl

410µl

Proteinload

Silverstain

5–20µg

20–50µg

50–80µg

50–80µg

80–150µg

SYPRORuby

5–20µg

20–50µg

50–80µg

50–80µg

80–150µg

Coomassie

BlueG—250

50–100µg

100–200µg

200–400µg

200–400µg

400–800µg

c）如果可能，可以减少样品中的高丰度蛋白含量。

例如在血清中，白蛋白占血清蛋白总量的70—90％。

如果上样蛋白中含有上述蛋白的话，将会掩盖对其他蛋白的观察.减少或除去样品中的高丰度蛋白可以相对增加其他蛋白的含量，减少条纹,有利于对低丰度蛋白的观察。

推荐产品：

a）RCDCproteinassay

b）PROTEANPlus（24cm）orPROTEANII（17cm）precastgels

c）AurumserumproteinandAurumAffi-GelBlueminikits

出现的问题：

胶部分出现横纹.

可能的原因:

蛋白上样量过高。

推荐解决的方法：

a）稀释样品，降低样品浓度。

在进行IEF前,须对样品进行定量,以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度。

蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定。

b）使用长IPG胶条，和更宽的PAGE胶可以增加蛋白样品上样量，详细请见下表：

IPGStripLength

7cm

11cm

17cm

18cm

24cm

Rehydration

volumeperstrip

125µl

185µl

300µl

315µl

410µl

Proteinload

Silverstain

5–20µg

20–50µg

50–80µg

50–80µg

80–150µg

SYPRORuby

5–20µg

20–50µg

50–80µg

50–80µg

80–150µg

Coomassie

BlueG—250

50–100µg

100–200µg

200–400µg

200–400µg

400–800µg

c）如果可能，可以减少样品中的高丰度蛋白含量。

例如在血清中，白蛋白占血清蛋白总量的70—90%。

如果上样蛋白中含有上述蛋白的话，将会掩盖其他蛋白的观察。

去处样品中的高丰度蛋白可以相对增加其他蛋白的含量，减少条纹,有利于低丰度蛋白的观察。

推荐产品:

a）RCDCproteinassay

b）PROTEANPlus（24cm）orPROTEANII（17cm）precastgels

c）AurumserumproteinandAurumAffi—GelBlueminikits

出现的问题:

胶上出现横条纹。

可能的原因:

IEF条件没有优化。

推荐解决的方法：

∙通过一系列聚焦时间实验，优化聚焦时间程序。

例如，可以在一个聚焦槽上，用同样一个样品走6根胶条，而后每隔一段时间取走一根胶条（20kV-hr，30kV—hr，40kV—hr，etc。

）。

∙确保所有的样品在同一个实验条件下进行IEF，通常IEF聚焦时设置一个总电流。

如果其中有一个样品的导电性高于其他的样品，那么电流大部分将经过该胶条，而降低其他胶条的通过电流.因此不同导电性质的样品，应该分别进行IEF。

出现的问题:

胶上出现横条纹

可能的原因:

IEF条件没有优化.

推荐解决的方法：

∙通过一系列聚焦时间实验,优化聚焦时间程序。

例如，可以在一个聚焦槽上，用同样一个样品走6根胶条，而后每隔一段时间取走一根胶条（20kV—hr,30kV—hr,40kV-hr,etc.）。

∙确保所有的样品在同一个实验条件下进行IEF,通常IEF聚焦时设置一个总电流.如果其中有一个样品的导电性高于其他的样品，那么电流大部分将经过该胶条，而降低其他胶条的通过电流。

因此不同导电性质的样品,应该分别进行IEF。

推荐产品：

PROTEANIEFcell

ReadyStripIPGstrips

出现的问题：

在碱性端附近出现横条纹。

可能的原因:

DTT含量不足，造成双硫键被氧化。

推荐解决的方法：

∙推荐解决的方法:

在样品进行等电聚焦前，用TBP/IAA烷基化还原样品（Herbertetal。

2001）。

在IEF中,必须解决碱性蛋白易在碱性环境中较易形成双硫键的问题，而TBP/IAA可以防止双硫键重新形成.通常而言，样品水化液和平衡缓冲液中的DTT是用于打开双硫键并保持其还原状态的。

但是DTT在碱性中去质子而带负电，并可从碱性端迁移出IPG胶条而使蛋白质中的硫醇键再氧化形成分子内的双硫键.为使实验方便起见，BIO-RAD公司提供了ReadyPrepreduction-alkylationkit以去除双硫键。

∙为增加碱性蛋白的分离，可以在IPG水化液水化胶条后，采用在阳极端杯上样的方法上样。

推荐产品：

ReadyPrepreduction-alkylationkit

Cuploadingtray

二、垂直条纹

出现的问题:

在加样电极一端出现垂直条纹。

可能的原因：

蛋白出现聚集或者沉淀。

推荐解决的方法：

∙稀释样品，在样品进行IEF前须对样品分析和定量,以确保正确的上样量.样品上样量通常和IEF时所选用的IPG胶条的长度和染色方法有关。

详细请见下表：

IPGStripLength

7cm

11cm

17cm

18cm

24cm

Rehydration

volumeperstrip

125µl

185µl

300µl

315µl

410µl

Proteinload

Silverstain

5–20µg

20–50µg

50–80µg

50–80µg

80–150µg

SYPRORuby

5–20µg

20–50µg

50–80µg

50–80µg

80–150µg

Coomassie

BlueG—250

50–100µg

100–200µg

200–400µg

200–400µg

400–800µg

∙延长起始阶段低电压的时程，并逐步升压。

详细见下表:

Step

Voltage

Time

1

150V

>3hr

2

300V

1hr

3

600V

1hr

4

1,200V

1hr

5

1,200V–10，000V

lineargradient

1hr

6

10,000V

steady-state

推荐产品：

RCDCproteinassay

PROTEANIEFcell

出现的问题：

出现垂直的点状条纹

可能的原因：

a）平衡时间过短

b）SDS—PAGE胶的pH值错误

c）在平衡液中，SDS的浓度过低。

推荐解决的方法：

a）延长胶条平衡时间，如有必要，可以平衡多达30分钟。

b）检查制SDS—PAGE胶时所用Tris—HCl的pH是否8。

8.如果Tris—HCl的pH错误，那么SDS—蛋白复合物的迁移速度就会降低,从而产生垂直的点状条纹。

c）保证平衡液中的SDS浓度至少为2％（w/v）

推荐产品：

Bio—Radprecastgels

ReadyPrep2—DstarterkitequilibrationbuffersIandII

Resolvinggelbuffer（1.5MTris-HCl，pH8.8）

出现的问题:

条纹沿胶的纵轴垂直分布.

可能的原因:

IPG胶条水化不充分，IPG水化液太少。

推荐解决的方法：

∙确保所选择IPG胶条的相应水化液的用量正确。

下表列出了不同长度胶条所需水化液的用量,但在实验中要按操作手册说明操作。

∙注意：

如果IPG胶条的上样水化液中已经含蛋白样品,那么上样量不能超过所推荐的加样量.另一方面，上样量不足会使IPG胶条总蛋白上样量不足。

IPGStripLength

7cm

11cm

17cm

18cm

24cm

Rehydration

volumeperstrip

125µl

185µl

300µl

315µl

410µl

∙如果样品仅仅部分润湿胶条，蛋白样品在胶条上就会分布不均匀.必须将聚胶槽中的胶条轻轻沿聚焦槽来回拖动几次,以使样品能完全润湿整根IPG胶条。

推荐产品:

ReadyStripIPGstrips

ReadyPrep2—Dstarterkitrehydration/samplebuffer

出现的问题：

胶上出现了单独垂直的空白条带.

可能的原因:

在IPG胶条和SDS—PAGE胶界面含有气泡

推荐解决的方法：

∙确保第二相SDS—PAGE胶的顶部为一直线，从而使IPG胶条和SDS-PAGE胶面完全紧贴。

∙在IPG胶条加到SDS-PAGE胶面上后，应用琼脂糖凝胶覆盖，以免胶条滑动.尽量避免在覆盖琼脂糖时产生气泡。

通常使用的琼脂糖浓度为0.5％或1%。

使用前须完全溶解。

推荐产品：

PROTEANPlusoverlayagarose（Catalog#163-2092）

ReadyPrepoverlayagarose（Catalog＃163-2111）

三、其它

出现的问题:

点弯曲。

可能的原因：

灌制SDS-PAGE胶时，没有用覆盖液（如水饱和正丁醇）.

推荐解决的方法：

在灌制SDS-PAGE胶后，须立即在胶面顶部加覆盖液，如水饱和的（n-butanol，l—butanol,ort—butanol）.水饱和正丁醇须纯净，并呈一直线平铺于胶顶部。

推荐产品:

Bio-Radprecastgels

出现的问题:

胶的部分区域的点发生扭曲。

可能的原因:

SDS—PAGE没有完全均匀地凝聚，电泳玻璃板没有被卡紧.

推荐解决的方法：

∙确保各配胶所需的试剂浓度正确，如TEMED，APS和其他试剂。

TEMED和APS的终浓度均为0。

05％，长度超过20cm的SDS-PAGE胶所须的TEMED的终浓度为0。

025%。

配胶所需的APS须新制,因为APS极易吸湿，在溶于水后就会分解,并会失活。

因此，应当确保APS在使用前新鲜配制。

∙聚丙烯酰氨凝胶过程和温度相关。

如果气温过低,那么凝胶就会失败。

因此须在室温时进行聚丙烯酰氨凝胶过程，如果温度过低,须对电泳玻璃板加热。

∙确保spacers，电泳玻璃板，和密封装置都紧密接触，并没有漏缝

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