安徽养殖鱼类病原细菌药敏试验和耐药性检测技术规范.docx

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安徽养殖鱼类病原细菌药敏试验和耐药性检测技术规范

安徽省质量技术监督局发布

2018-××-××实施

2018-××-××发布

安徽养殖鱼类病原细菌药敏试验和耐药性检测技术规范

StandardforDrugsensitivitytestanddrugresistancetestofpathogenicbacteriafromculturedfishesinAnhuiProvince

（征求意见稿）

DB34/TXXX-2017

DB34

安徽省地方标准

1前言

本标准规范按照GB/T1.1-2009编写。

本标准由安徽农业大学动物科技学院提出。

本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：

安徽农业大学动物科技学院、安徽省水产技术推广总站、安徽海辉水产养殖有限公司

本标准主要起草人：

彭开松，吴敏，唐庆权，樊慧敏，许晓牧，魏泽能，蒋军，朱若琳，姜守松，王黎明，贾俊威，檀基良，曹学志

安徽养殖鱼类病原细菌药敏试验和耐药性检测技术规范

1范围

本标准适用于安徽省境内增养殖淡水鱼类病原细菌的药敏试验和耐药性检测。

主要包括以下技术内容：

（1）样品采集；

（2）病菌的分离和鉴定；（3）抑菌圈直径测定；（4）最小抑菌浓度测定；（5）耐药性检测。

本标准适用于水生动物疾病的诊疗、教学、科研、服务单位及有关管理部门从事相关工作参考。

2规范性引用文件

下列文件中的条款，通过本部分的引用而成为本部分的条款。

凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分。

鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。

GBT27623.1-2011渔用抗菌药物药效试验技术规范第1部分：

常量肉汤稀释法药物敏感性试验

WS/T125-1999中华人民共和国卫生行业标准纸片法抗菌药物敏感试验标准

中华人民共和国兽药典（一部）

中华人民共和国兽药典兽药使用指南（化学药品卷）

EUCAST欧盟药敏试验标准（李玉庆等编译，中国标准出版社，2016年3月）

GB4789.2-2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定

3定义

下述定义适用于本标准

3.1活鱼：

具有典型症状和大体病变的活鱼或濒死鱼。

3.2冻鱼：

活鱼断头处死后装入新塑料自封袋，在-20℃冻存6～12小时的鱼。

3.3冰鱼：

活鱼断头处死后装入新干净塑料自封袋，在湿冰中存放6～12小时的鱼。

3.4死鱼:

死后在养殖水体中留存6～12h的鱼。

3.5病菌：

从患鱼病变组织、脏器（如肾脏、脾脏、肝胰腺）或血液中分离的鱼类致病菌，人工感染本动物可复制出自然病例所表现的部分或全部症状和病变。

3.6系统感染性疾病：

病菌突破消化道、鳃、皮肤等屏障，经血液循环引起全身感染，表现出败血症、脏器变性坏死或炎症等，可从血液和脏器中分离到该病菌。

3.7抗菌药物：

本标准中所指抗菌药物是我国药典或农业部规范性文件中允许使用的具有抗菌活性的内服药物，不包括生物制品、中草药和消毒剂等。

3.8纸片扩散法:

也称为K-B法，将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的固体培养基表面上，培养后测定纸片周围透明抑菌圈直径，定性判断测试菌对该药物的敏感性。

3.9微量肉汤稀释法：

通过在微量培养板中测定倍比稀释的抗菌药物对测试菌的生长抑制情况，定量测定药物对细菌的最小抑菌浓度。

3.10最小抑菌浓度（MIC）：

肉汤稀释法中测定抗菌药物抑制某一种细菌可见生长的最低浓度。

3.11最小杀菌浓度（MBC）：

指杀死99.9%（使得细菌密度降低3个数量级）的供试细菌所需的最低药物浓度。

4材料

样品采集需要解剖器械（剪刀和镊子等）、无菌棉试子、塑料自封袋、保温采样箱、乳胶手套、网具等。

纸片法所需材料同WS/T125-1999。

微量肉汤稀释法所需材料同EUCAST欧盟药敏试验标准。

5样品采集

5.1样品质量

分离病菌的样品质量依次为：

活鱼＞冰鱼＞冻鱼＞死鱼。

无法获得前三种样品时，才考虑死鱼。

样品数量多或动物个体大，用无菌棉试子充分吸收样品中的体液或直接蘸取小块组织，保存于采样管。

将棉试子、组织或整条鱼等样品在4℃保温箱或冰盒中运送。

5.2样品数量

典型症状和大体病变的患鱼或濒死鱼3～5尾作为分离病菌样品。

行为正常和外观健康的3～5尾鱼作为对照。

如果症状和大体病变复杂，可以适当增加样品数量。

6病菌的分离和鉴定

送检样品到达实验室后应立即处理，不能过夜存放。

以下均要求无菌操作。

6.1培养基

根据临床资料所提示的疑似病菌的特性，选择和制备培养基（见附录一和附录二）。

6.2病菌分离方法

根据样品大小和感染类型，选择以下某种接种方法。

样品接种平板后，采用划线法，分离病菌。

（1）腹腔肝脾肾接种法：

适合体长大于5cm的鱼。

75%酒精体表消毒后，剪除腹壁，暴露腹腔脏器。

摘下肝胰腺或脾脏，剪一断面接种平板；或者在体肾（或肝胰腺）中部剪开供接种环插入的切口，蘸取样品接种平板。

（2）背部体肾接种法：

适合体长3～5cm的鱼。

75%酒精体表消毒后，剪除背鳍。

从背鳍后基部纵向剪开肌肉，并暴露体肾，用接种环或棉签沾取样品接种平板。

（3）体表损伤组织接种法：

选新鲜病灶，在损伤与健康组织的交界处,无菌采集约1μL的样品，接种平板。

6.3病菌的鉴定

利用形态学、生理生化特性和16SrDNA测序等鉴定分离菌。

6.4致病性鉴定

经毒力基因检测和本动物回归攻毒试验，确定分离菌的致病性。

7抑菌圈直径测定

根据细菌鉴定结果，选择进行纸片法药敏试验的培养基（附录四）。

在水平的超净台上倾倒平板。

固体培养基厚度为4mm±0.5mm。

培养基凝固后，在37℃温箱中除去明水，放在超净台中备用。

如制备好的培养基可用塑料自封袋密封后，在4～8℃存放7～14天，用前在37℃温箱中除去明水。

灭菌生理盐水稀释过夜培养的待测菌，使菌液浓度为0.5麦氏浊度（或108cfu/mL）。

制备的菌悬液在15～60min内使用完。

灭菌棉试子蘸取菌悬液，在管壁内侧挤去多余水，将菌均匀涂布在琼脂表面。

15min之内，将药敏纸片（药敏纸片含药标准见附录三）均匀平坦紧贴到平板上。

内径9cm和15cm的平板，最多可分别均匀放置6个和12个药敏纸片，纸片中心之间距离至少2cm。

药敏纸片贴好后，倒置平板并在15min内将培养皿（最高叠放5层）放到相应温度的培养箱（附录四）中培养16～20h。

取出培养皿，放在眼前30cm处，测量抑菌圈直径（单位mm）。

根据附录六所列的折点值，判断敏感性。

对结果判定为敏感的菌株，孵育时间满24h后，再测一次抑菌圈直径。

如果在培养皿表面仅见单菌落，说明接种量不够，要重新进行试验。

8最小抑菌浓度测定

最小抑菌浓度测定采用微量肉汤稀释法。

根据细菌鉴定结果，选择进行纸片法药敏试验的培养基（附录五）。

抗菌药物批号、效价、有效期和存储条件，必须明确，并按要求存放在4～8℃的干燥器内。

抗菌药物储存液：

使用储存液配制溶剂（附录三）溶解抗菌药物，且使储存液中抗菌药物的浓度高于1g/L。

配制储存液的溶剂根据需要采用过滤除菌或高压蒸汽灭菌。

抗菌药物工作液：

抗菌药物工作液的浓度必须覆盖菌株的所有MIC终点。

使用配制抗菌药物工作液的溶剂（附录三）稀释储存液制备工作液，其最高浓度应为MIC上限值的4倍，然后采用倍比稀释法稀释。

工作液一般在一天内使用完毕。

在微量培养板中加入倍比稀释后的工作液，每孔加100μl，做2个重复。

用生理盐水调整过夜培养的新肉汤培养物使其浓度为0.5麦氏浊度（浓度约为108cfu/毫升）。

再用肉汤稀释1000倍，使接种菌工作液浓度为5×105cfu/毫升。

接种菌悬液最好在30min内用完，否则应存放在冰上。

在测试孔和阳性对照孔中，每孔加待测菌工作液100μL。

阴性对照孔，只加不含药物的肉汤100μL，作为评判无菌操作质控的阴性对照。

微量培养板布好后加盖，使用塑料自封袋密封后，放入培养箱中孵育。

微孔板的叠层不超过5层。

培养16～20h，当阳性对照孔变浑浊，而阴性对照孔仍然清亮，才能读取试验结果。

将测试孔与阴性孔和阳性孔，进行比对，读取最小抑菌浓度。

8耐药性检测

8.1纸片法

抑菌圈直径小于耐药性折点直径，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。

8.2最小抑菌浓度法

最小抑菌浓度大于耐药性折点浓度，可初步判定该细菌对该药物具有耐药性。

8.3MBC/MIC比值法

最小抑菌浓度（MIC）结果读取结束后，取药物浓度高于MIC值的各孔中的培养物进行细菌计数。

同时，取阳性对照孔菌液进行计数。

细菌计数方法同GB4789.2-2016。

当阳性对照孔细菌浓度/清亮孔细菌浓度=1000时，该清亮孔所对应的药物浓度就是最小杀菌浓度（MBC）。

MBC孔一般是在MIC孔之前。

当MBC/MIC≥32时，可判定该菌对某种药物有耐药性。

资料性附录

附录一：

试剂和培养基

1.生理盐水

8.5克氯化钠加入1升水，121℃15分钟高压蒸汽灭菌，备用。

2.牛心脑浸出液琼脂（BHIA）

胰蛋白胨20克，氯化钠10克，牛心浸粉10克，葡萄糖4克，磷酸氢二钠5克，琼脂15克，1升水，pH7.4,121℃15分钟高压蒸汽灭菌，倾倒平板。

3.水解酪蛋白（Meller-Hinton）肉汤（MHB）

牛肉粉1克，可溶性淀粉1.5克，酸水解酪蛋白17.5克，琼脂15克，1升水，pH7.4,121℃15分钟高压蒸汽灭菌。

在MHB基础上添加1.5%琼脂为MHA。

4.TYEA

胰蛋白胨1.4克，酵母膏0.4克，MgSO4•7H2O0.5克，CaCl2•H2O0.5克，琼脂10克，pH7.2，121℃、15分钟高压蒸汽灭菌。

5.Cytophaga琼脂

胰蛋白胨0.5克，酵母膏0.5克，醋酸钠0.5克，牛肉膏0.2克，琼脂10克，1升水，pH7.2~7.4，121℃、15分钟高压蒸汽灭菌。

6.Middle-brook-ADH-enrichment-addedMiddlebrook7H11

硫酸铵0.5g、磷酸二氢钾1.6g、磷酸氢二钠1.4g、柠檬酸钠0.4g、硫酸镁0.05g、胰酪蛋白胨1.0g、硫酸锌0.001g、硫酸铜0.001g、L-谷氨酸钠0.5g、柠檬酸铁铵0.04g、盐酸吡哆醇0.001g、生物素0.5mg、孔雀石绿0.25mg。

取本品5.5克，加5毫升甘油，加900毫升蒸馏水，121℃高压灭菌10分钟。

冷却50-55℃时，加入过滤除菌的OADC添加剂100毫升，混匀；然后按说明书添加ADH（精氨酸双水解酶氯化钠肉汤）,混匀备用。

如果在高压蒸汽灭菌前，加入13.5克琼脂，后面操作相同，制备得对应固体培养基。

OADC添加剂：

，牛白蛋白（V组分）5克、油酸0.06毫升、葡萄糖2克、触酶0.003克、氯化钠0.85克、蒸馏水100毫升，过滤除菌。

附录二：

淡水鱼常见致病菌分离用培养基及其培养条件

表1淡水鱼常见致病菌分离用培养基及其培养条件

病原细菌

培养基

温度a

时间

革

兰

氏

阴

性

菌

气单胞菌属（Aeromonas）

BHIA

25℃或15℃

24~48h

弧菌属（Vibrio）（非专性嗜盐菌株）

BHIA

15~25℃

24~48h

假单胞菌属（Pseudomonas）

BHIA

15~25℃

24~48h

邻单胞菌属（Plesiomonas）

BHIA

15~25℃

24~48h

爱德华菌属（Edwardsiella）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）、耶尔森菌属（Yersinia）等肠杆菌科

BHIA

15~25℃