04应力加载植物细胞后的基因表达的解析.docx

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04应力加载植物细胞后的基因表达的解析

（一）立项依据与研究内容

1、项目的立项依据（附主要的参考文献目录）

早在1881年Darwin[1]就曾经指出机械应力对植物的生长存在明显的作用。

其实验依据是发现接触豆科植物的根系可以改变其生长方向和数量。

由于CO2、O2、温度、光照、水分，以及矿质营养等是植物正常生活中不可替代的因素，缺少这些条件中任何一个，植物都不可能完成其生活史。

因此当时的研究主要集中在光合生理、水分生理、营养生理、抗逆性生理等几个方面。

使得应力对生长影响的存在一度受到冷落。

创导性的先驱工作是由Jaob[2]的研究开始的,他们观察到树木每天受短时间的风吹其纵向生长减弱，横向生长加强。

但对这一领域的深入认识是极其缓慢的，原因在于：

一.紫外线辐射、光照、温度变化等因素与机械刺激同时作用，往往修饰掩盖了植物对机械刺激的响应或者很难区别植物的生理变化到底是由那个因素引起或起主导作用，二.在野外很难找到无风环境作为对照。

近几十年来，人们大量的研究机械应力与植物生长的关系，这些研究不仅包括宏观上的应力影响植物的生长和发育，从组织、细胞和分子水平上为这些宏观上的变化找到了证据，而且从细胞水平上研究了植物感受应力的机理和力信号传递。

一、应力刺激从宏观上对植物生长和发育的影响

应力对植物生长和发育的影响首先表现在应力作用后，植物的生长呈现出促进或抑制现象。

Darwin[3]报道用4mg的棉线摩擦植物的卷须，可使其生长和发育发生变化。

Pfeffer[4]报道在攀缘植物卷须挂25μg重的东西也可影响其生长。

对pottedmarigoldplants每天进行一次短时间的摇晃，其花期比对照推迟一周，如果每天摇晃两次其花期比对照推迟两周[5]。

对豆科植物摇晃3-5天后，尽管其花期明显延迟，但其结实率却没有明显的变化[6]。

本实验室也在个体层次上研究了植物幼苗对声波刺激的响应：

研究发现应力刺激可以促进苗的生长和分化，采用强度为100dB、频率为1000Hz的声波刺激菊花幼苗15天后，结果刺激组比对照组的鲜重增加12.5%，干重增加9.8%，株高增加5.6%。

在人工气候室内对西红柿进行周期性的震荡处理，尽管延迟了花期，但却促进了结实率[7]。

王伯初首先提出了应力刺激对植物的生长具有双重效应，本室通过研究也发现声波、机械振荡对植物愈伤组织的生长具有双向作用，适当强度（最适宜声强和频率为100dB和800Hz、机械振荡的频率3Hz等）的应力刺激可以有效的促进植物的生长，细胞的分裂和分化能力都有所提高，低于这一条件其生长效果不明显，高于这一条件将抑制生长，充分的证明了这一观点。

另外，用流式细胞术分析强声波对植物细胞周期的影响后发现，交变应力作用下直接影响细胞或细胞分裂的同步化,促进S期的DNA合成,有助于细胞有丝分裂。

声波频率在400Hz至800Hz,强度在90dB到110dB内,随频率和强度的增加,交变应力使S期细胞明显增加,但频率或强度过大,反而使Ｓ期细胞大大减少[8]。

刘歆等用低频磁场处理洋葱根发现温度对洋葱根的生长有较大影响，而磁场与温度的叠加效应在一定范围内对洋葱根的生长及根尖细胞的增殖产生重要作用[9]。

外界应力对植物生长的影响还可以从植物的一些生理生化指标变化上找到证据。

如蔡素雯等用磁场或磁水处理番茄，结果表明,经磁处理的番茄幼苗MDH（（苹果酸脱氢酶）活性增高,同工酶谱发生改变[10]。

阳小成[11]等用强声波处理中华猕猴桃茎段的愈伤组织发现适度频率和强度的声波刺激（1000Hz、100dB）可促进猕猴桃愈伤组织的生长,使胞内可溶性蛋白质含量升高,SOD活性升高,而IAA氧化酶活性降低;但当声波刺激超过一定范围后,愈伤组织的生长受到明显的抑制,可溶性蛋白质含量下降,SOD活性降低而IAA氧化酶活性升高。

这表明植物对外界强声波刺激的应激效应是很明显的，与本实验室对草本植物非洲雏菊的研究有相似的结果。

清华大学孙克利[12]等人研究了交变应力对烟草愈伤组织细胞的影响，也得出一定频率和强度范围内的交变应力能使得植物细胞的相变温度有明显的降低,而过高频率的应力刺激则会使细胞相变温度升高。

应力影响植物生长的机理

（1）．激素参与了应力对植物生长的影响

细胞的生长和分裂离不开激素的调控。

在激素方面研究最早的是乙烯，故乙烯被称为应力激素。

Jaffe于1973年发现轻微摩擦番茄的节间引起了叶片偏上性生长，并且乙烯含量增加[13]。

扫描电镜观察发现摩擦或用乙烯处理豌豆的节间与对照相比，表皮细胞均变的不规则，宏观上表现为茎变短变粗[14]。

用Co2+、Li+、Ag2+或AVG（氨基乙烯甘氨酸）抑制乙烯的合成或者抑制乙烯合成酶的活性可以部分或完全抑制由接触或摩擦引起的茎变粗变短这种形态建成[15，16]。

如果用Co2+抑制由ACC合成酶转变成乙烯这一步骤，或用Li+抑制过氧化物酶（过氧化物酶催化由ACC转变为乙烯这一步骤，所以称其为乙烯形成酶）与细胞壁的结合可以完全消除由于摩擦而造成对Bryonsiadioica节间伸长的抑制[17，18]，AVG则可以抑制由于机械刺激而引起的横向膨大[19]。

可见，乙烯在应力影响生长过程中发挥着非常重要的作用。

GA（赤霉素）在茎的伸长生长中也起非常重要的作用。

Secge发现机械干扰引起豆科植物幼苗GA含量明显降低[20]。

用风作用水稻根系，当风速从1米/秒升高到2.5米/秒或5米/秒时游离GA的含量下降2/3到3/4[21]。

Beyel和Mitchell[22]用层析法来检测各种刺激引起GA的变化，发现摩擦和震荡都可以引起游离GA含量的大幅度下降。

表明游离GA含量的下降可能是植物对震荡和摩擦应力的共同响应。

施加外源GA可以防止由于摩擦而引起茎的矮化[23]。

施加GA4+7可以消除机械应力促进雌雄同体花黄瓜的分化[24]。

由以上论述可以看出GA参与了应力对植物生长和发育的调控，但应力引起游离GA含量下降，是由于生物合成受阻还是游离GA变成了结合态，尚需进一步研究。

还有另一种激素ABA（脱落酸），在植物干旱胁迫时其含量明显升高，以提高植物的抗逆性[25]，suge指出[26]豆科植物种苗经机械处理后也可以提高其抗性，这使人们想到ABA是否也在机械刺激植物生长中发挥重要的作用。

发现豆科植物的茎被摩擦后ABA含量升高3-4倍[27]。

外源ABA可以抑制节间伸长生长，这相似于机械作用和乙烯处理，与机械刺激不同的是ABA并不影响节间的直径[28]。

尽管有很多人在研究机械刺激引起激素变化，并且有许多发现，但是生长类激素与抑制性激素之间如何协调配合来响应机械刺激，目前还没有统一的说法。

（2）、应力对植物刺激信号的传导

机械刺激既可以引起激素含量的变化，那么植物细胞是怎么感受机械刺激的，这些机械信号又是怎么转化成化学信号呢？

激素介导植物对物理刺激的响应是信号转导的一个部分。

但并不是早期事件，早期信号事件是什么，这一领域的研究还不完善，现在正在研究中。

一些特殊植物响应于接触刺激的机理，如Mimosapudical的叶片迅速闭合，认为涉及到离子的进出，膨压的变化[29，30]。

普通植物感受应力的机理和这些应力敏感植物的响应机理被认为是相似的。

Jaffe和Telewski[31]指出摩擦应力诱导产生乙烯至少在作用后30分钟开始，2小时后达到高峰，5小时后下降到0。

显然乙烯不是构成摩擦引起快速抑制种苗生长的原因。

应力对生长的抑制在作用后几秒或几分钟就开始。

而在摩擦后几乎瞬间就引起胼胝质沉淀在豆科植物幼苗的细胞壁[32]，并推测胼胝质可能沉积在紧靠质膜外侧的细胞壁空间，这一位点被认为是乙烯合成位点[33]。

由于胼胝的沉淀引起质膜变形，可能激活乙烯复合物[32]。

一种蛋白质糖基化抑制剂-2-脱氧-D-葡萄糖，它可以抑制胼胝质沉淀，完全消除应力引起的形态建成。

这个结果表明应力作用引起的代谢物以某种方式介导趋触性形态建成。

Takahashi[34]和Jaffe[32]证实，被抚摸植物的细胞其胞壁有一种可溶性并可移动的寡糖含量升高。

这种寡糖可能是细胞壁聚合物的前体，也可能是细胞壁分解的产物（其中包括胼胝质）。

胼胝质被认为是乙烯形成和机械响应的诱发者。

植物在机械应力作用下其它寡糖是否起着非常重要的作用，现在尚不清楚。

另一个早期信号是Ca2+,研究发现机械接触可以使胞内Ca2+浓度瞬间增加。

本室也研究了声波对细胞膜的作用及其跨膜传递机制。

首先探索了PMH+-ATPase活性的调控机理，声波刺激可以提高PMH+-ATPase的活性，通过在体和离体分析表明声波刺激影响PMH+-ATPase的活性依赖于Ca2+，并且与磷酸化作用有关。

这提示PMH+-ATPase响应声波刺激也可能是通过依赖Ca2+的蛋白质激酶来实现。

应用膜片钳技术对离子通道研究的结果显示，在菊花愈伤组织质膜上存在对应力敏感的K+通道。

声波作用使钾通道开放频率明显增加，表明K+通道在响应声波刺激中发挥着非常重要的作用。

虽然应力对植物的生长和发育具有影响这已经被确认，而且也找到了确凿的生理和生化证据；然而应力作用后，植物基因是怎样变化及具有怎样的差异表达还仍然不清楚。

本课题研究就是在前面研究的基础上，从分子水平上阐明应力作用后植物基因表达差异及其机理，为进一步阐明应力加载植物细胞的作用机理提供直接的分子生物学证据，为以后进一步克隆特异性表达基因和对植物转基因研究做准备，本课题在筛选对应力刺激特敏感的、能促进植物生长、提高植物抗逆性等特征的某些特异反应基因，以及克隆这些特异反应基因，建立cDNA文库的研究等研究，具有原始创新性。

参考文献：

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7AkersS,CMitchell.Theminitronsystemforgrowthofsmallplantsundercontrolledenvironmentalconditions.JAmSocHortSci,1985,110:

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8李涛流式细胞术分析强声波对植物细胞周期的影响生物物理学报第十七卷第一期二○○一年三月

9刘歆低频磁场对洋葱根的生物学效应同济大学学报（医学版）第23卷第2期2002年4月

10蔡素雯　磁处理对番茄幼苗苹果酸脱氢酶的影响JournalofNorthwestUniversity（NaturalScienceEdition）Vol.28No.5

11阳小成声波刺激对猕猴桃愈伤组织的生理效应重庆大学学报　（自然科学版）　2002年4月第25卷第4期

12孙克利.交变应力作用下烟草细胞热力学相行为的研究生物物理学报第十五卷第三期一九九九年九月

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2项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题

（1）研究内容：

在本课题组已有成果的基础上，建立更完善的物理刺激植物的有效、稳定重复的加载系统及加载参数的数据库（植物的细胞、组织、个体层次），确保每次实验的统一和重复性，同时获得最佳的、最优的加载模式；用抑制消减杂交技术等分子生物学等研究方法进一步研究应力作用植物细胞后基因表达的变化，筛选出对应力刺激敏感的特异基因，并对其序列进行测定。

由此，阐明应力加载植物细胞的作用机理提供直接的分子生物学证据，初步建立应力－生长（植物）的理论体系，并为以后进一步克隆特异性表达基因和对植物转基因研究做准备，如果能找到某些特异反应基因，将尽可能用于基因工程改良农作物，提高某些植物的抗逆性；将克隆的特异性表达基因和合适的载体连接，运用转基因技术，还有可能实现在植物或微生物中的某些功能的人为调控，相当于在植物或微生物中装上一个“开关”，其实际应用价值将十分广泛。

同时本课题的研究将为植物分子生物学、植物基因工程提供最新的、具有原始创新性的研究成果，同时为工程学技术在生命科学中应用开拓一种全新的研究思路。

（2）研究目标

①利用多学科的有机交叉，用抑制消减杂交技术等分子生物学的分析方法和研究手段，探求物理刺激对植物细胞或器官响应的分子生物学机制及原理，寻求物理刺激作用下某些特异反应基因，以及克隆这些特异反应基因，建立cDNA文库，尽可能把这些特异反应基因用于基因工程改良农作物，研究内容未见报道、具有原始创新性；

②将建立一套有效控制植物细胞或器官生长物理刺激强度等参数的数据库，研究成果可直接应用于农业和林业的优质种苗快繁工厂化、种子的活化、转基因新品种的开发等方面；

（3）拟解决的关键问题

在已获得应力参数对植物生长有促进作用的研究基础上，本项目研究需解决的关键问题为：

1、建立物理刺激植物的有效、稳定重复的加载系统及加载参数的数据库，确保每次实验的统一和重复性；2、用分子生物学及基因工程等技术手段，寻求应力加载对植物细胞的分子作用机理的直接证据；3、筛选对应力敏感的特异基因片断、完成其测序和克隆，以及建立cDNA文库。

本研究将为调控植物的生长、提高植物抗逆性等方面，意义重大。

3拟采取的研究方案及可行性分析

（1）研究方案

1将受试材料的无菌试管苗分为两组，一组用一定频率和强度的应力刺激后作为刺激组，另一组不刺激作为对照组，刺激完毕后分别提取刺激组和对照组的总RNA；

②应用新发展的抑制消减杂交技术，以刺激组mRNA逆转录cDNA作为测试者，对照组mRNA逆转录成cDNA作为驱动者，进行消减杂交，筛选出刺激组差异cDNA片段；

声波刺激加载

③对未被杂交的刺激组差异cDNA片段扩增并纯化，得到差异cDNA片段的克隆，制备cDNA文库；

④对差异cDNA片段测序，经修饰后把它连接到合适的载体上，转入其它的植株基因组中，用应力刺激该植株后观察该基因的表达及对植株生长的影响。

技术路线（见下图）

（2）可行性分析

①实验室从事植物与