关于细胞凋亡的讨论.docx

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关于细胞凋亡的讨论

关于细胞凋亡的讨论

细胞调亡与坏死鉴别的简便方法midas

1、PI和Hoechst33342双标：

   PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。

但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。

正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。

我最近在作的试验就是用的这种方法，附上一张我染的PC12细胞的图片，请大家指教。

更精确的定量可以通过流式细胞仪来检测。

用PI和Hoechst33342双标鉴别调亡、坏死，这种方法简便易行，结果比较可靠。

（图片见

2、PI和Calcein-Am双标：

   Calcein-AM是一种绿色荧光标记物，可显示胞浆，为膜通透性的荧光染料。

Calcein-AM一旦进入胞内，便可被内源性酯酶水解成绿色荧光物质calcein,并保留在胞浆中。

细胞处于调亡时，由于核成碎片状，从而使此时的胞浆的calcein着色呈碎片状，但是PI为阴性。

细胞坏死时，胞浆的calcein染色基本上属于正常，但是PI为阳性，有时可以看到膜内有空泡。

但是晚期调亡细胞，胞浆有calcein着色并呈碎片状，而且PI为阳性。

3、PI和Annexin-V双标：

   Annexin-V（green）可以和胞膜内的磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。

正常细胞膜的磷脂双分子层排列整齐，但是如果细胞损伤时，酯脂双分子层的排列就会被打乱，内层的可能会翻转到外层，Annexin-V就可以检测到这种现象。

因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。

但是只有坏死的细胞PI是阳性。

可用confocal来进行双标观察计数或流式细胞仪定量检测。

4、Leukostat染色：

   活细胞Leukostat染色，核呈棕色，胞浆透明；调亡细胞核浓集，呈黑、褐色，变小，胞浆不可见；坏死细胞溶解呈空壳。

这种方法现在少用。

补充：

鉴别细胞调亡与坏死的方法挺多，但大多比较繁琐，我总结的这几种方法则是简便易行，最适合于经费比较紧张的研究生们。

针对朋友的提问，回答如下：

1、试剂来源：

PI和Hoechst33342都是sigma公司的粉剂，不是kit，

2、具体方法：

将PI和Hoechst33342的终浓度调到10μg/mg就行，用PBS，Hank's液、生理盐水或D液任何一种溶解都可以。

Hoechst33342染色37℃10min就达到饱和，PI在4℃10~20min就行。

3、文献出处：

A，《细胞实验指南》上册，p102－125，现代生物技术译从－－科学出版社，

B，有好几篇文献，只列出其中的一个：

HaHC,SnyderSH.

Poly（ADP-ribose）polymeraseisamediatorofnecroticcelldeathbyATPdepletion.

ProcNatlAcadSciUSA.1999Nov23;96（24）:

13978-82.

全文链接：

http:

//www.pnas.org/cgi/content/full/96/24/13978

4、鉴别晚期凋亡和坏死的方法我还没有找到，但是这两者要区别是比较困难的，sorry！

fang3326：

有什么实验技术可以区分凋亡和坏死啊？

hxc：

碘化丙啶（propidiumiodide,PI）检测。

早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与DNA结合的荧光染料（如PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如Hoechest3342或33258等）仍能被细胞摄取。

应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内DNA出现Hoechest3342标记而不出现PI标记的为凋亡细胞。

检测方法：

获取11×106细胞/ml的细胞悬液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，进行流式细胞仪分析或荧光显微镜观察。

PI及Hoechest3342均使用340nm紫外线激发，前者荧光为红色（620nm）,后者荧光为蓝色（480nm）。

正常细胞蓝色最强。

早期凋亡细胞由于DNA的漏出蓝色稍弱并有少量的红色荧光，晚期凋亡细胞红色荧光加强。

坏死细胞红色荧光最强。

膜联蛋白（annexin）V标记

正常细胞的细胞膜磷脂分布是不对称的，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）位于细胞膜内侧，在细胞凋亡时转至细胞膜外表面，这一改变被认为是特导性的，并且可作为凋亡细胞表面改变的标记。

PS表面化发生于凋早期，其机制尚不清，可能是一种导致机体吞噬凋亡细胞的信号。

膜联蛋白V是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力，荧光标记的膜联蛋白V与细胞表现PS结合，再用显微镜或流式细胞仪进行检测，可以观察凋亡过程中细胞膜PS的表面化。

结合PI染色进行双参数检测尚能区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞及坏死细胞。

正常细胞膜联蛋白V（-）PI（-），早期凋亡细胞膜联蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞膜联蛋白V（+）PI（+）。

有研究表明膜联蛋白V标记仅有不到三分之一的凋亡细胞出现阳性标记，其原因尚不明。

同时需注意度的是凋亡后期溶解阶段，细胞碎片也可出现明显的阳性着色。

mayar：

最简单的方法是使用PI染料流式细胞仪或者荧光显微镜检测，因为只有死细胞才可以被染上，而早期凋亡的细胞是不会被染上的。

如果只是检测的时候去除坏死细胞的干扰的话，比如使用AnnexinV检测凋亡的时候，只需要和PI进行双染就可以了。

只有AnnexinV阳性而PI阴性的细胞才是凋亡的细胞

hjjackie2004：

pcd形成凋亡小体，电泳检测能看出梯状带。

坏死是如线粒体肿大。

。

fflying：

几点供参考：

1、大部分凋亡细胞可能并不见得有非常典型的凋亡表型，如电镜的染色体边集、凋亡小体等，DNA电泳也不见得都有DNAladder，但对某些指标来说还算稳定，如PI染色及TUNEL法，所以如果某个方法效果不好，可以换用其他方法检测

2、坏死与凋亡的区分传统上认为是无序与有序的过程，楼上所说的线粒体肿大也是以前的一个传统认识，但现在有很多人认为坏死的发生也是有序发生的，因此也有了程序化坏死一说，在很大程度上，由于凋亡是时间依赖性的过程，细胞发生凋亡也并非同步化的，凋亡的晚期与坏死进行区分是困难的，而且我认为如果不是对于凋亡或是坏死本身通路进行研究的话，强行区分是没有意义的

178：

供参考：

1、可以测细胞的电解质透性,坏死的细胞他的细胞膜通透性增强,包内液体甚至一出来,通常所说的化脓就是这种情况的最好表现;而凋亡的细胞绝没有上述情况,他会出现皱缩,内部细胞器的分布也会发生一些变化一形成凋亡小体

2、可以测两中类型细胞的DNA,他们的总DNA电泳分离,凋亡的细胞会出现相差180NT的梯度条带,而坏死的细胞则没有

悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡

pljgirl:

请教悬浮细胞原位杂交合荧光标记检测凋亡的经验。

我现在想拿这些悬浮的细胞检测其凋亡情况和做原位杂交，不知道细胞如何贴到载波片上，应该用何固定液固定？

固定后如何保存？

XTYang:

用Cytospin甩到载玻片上。

固定用甲醇、乙醇、paraformaldehy都可以，要根据具体实验而定的。

pljgirl:

我的细胞是加了一种新药，不同的剂量，想看药物诱导细胞凋亡的情况，用cytospin时每组细胞要求甩的细胞数一样吗？

因为我收的时候，发现对照组的细胞很多，最大加药组的细胞少得很，如果用同样得体积，可能对照组的细胞重叠了，而加药组的确很稀疏。

所以甩细胞时要准确计数吗？

XTYang:

用cytospin时每样品的细胞数最好大致一样，不然照相时细胞少的那个样品就很难找到好视野。

太多细胞重叠也不行。

我印象里是10^4-10^5个,不过不很肯定，你做个试验看看镜检结果就知道了。

既然是大致，就不必准确计数。

pljgirl:

那这样的话，将来片子还用于统计吗？

我看到有些文献上说在对阳性部位进行分级，<25%为阴性，25%~50%（＋）>50％（＋＋）等，那如果不精确计数，甩的细胞数目不一致，怎么有可比性呢？

XTYang:

凋亡%可比

pljgirl:

你意思是说，用流式细胞仪检测凋亡率来比较，甩片只是为了获得形态学的标记，不用比较凋亡率吗？

XTYang:

不是。

镜检可以同时获得形态和凋亡率的数据（虽然数起来辛苦），因为不管你甩多少细胞上去，其中的凋亡细胞占总体细胞中的%是固定的，因此用CYTOSPIN时细胞计数不很准确也不要紧，应为%固定。

甩细胞时计数不必准确不等于镜检计算凋亡细胞%时计数不必准确。

后者尽量准确为好。

pljgirl:

再请教一下，我想做荧光标记凋亡和细胞的原位杂交，但现在还没选好试剂，可能会用promege的tunel，原位杂交也没想好要检测rna或dna，只是想甩片后固定，将细胞保存在－80度，做这两项内容的细胞都可以用4％的多聚甲醛在4度固定30分钟就行了？

听说做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配，又相关经验提供吗？

XTYang:

我没试过先保存一段时间然后再做的方法。

一般固定后就直接做了。

普通的用-20度甲醇或乙醇固定2-16小时，需要用多聚甲醛的话，可以在甲醇或乙醇固定后再进行。

做rna的原位杂交固定用的多聚甲醛要用DEPC水来配的说法我没听说过，希望你做了以后和大家分享成功经验。

pljgirl:

我也是在丁香园里看到别人建议的，其实也有点道理，DEPC水是去rna酶的，感觉做rna的实验就是要严格很多。

我在现代病理学技术中查到做原位杂交一般都是用4％的多聚甲醛固定，再用80％的乙醇后固定。

由于我的细胞已经收集好冻存了，解冻后马上要甩150多张片，现在急啊！

万一固定方法不对。

我的损失会很惨重！

悬浮细胞的固定是在率片前还是再率片后呢？

XTYang:

我学的做的都是先甩后固定。

关于凋亡率

sabc128：

我做的是药物作用于细胞一定时间后，计算细胞的凋亡率是多少？

有那些方法？

youngtiger：

可以通过以下三个方面着手：

（一）通过凋亡形态学：

常规染色（HE,Giemsa,Wright）的普通光学显微镜观察，随即选择视野进行凋亡细胞计数；透射电镜观察。

（二）通过凋亡的生化特征检测：

琼脂糖凝胶电泳末端标记定量检测；原位末端标记检测（TUNEL等）

（三）通过流式细胞仪：

PI单染色法；TUNEL的流式分析等

总之方法很多，这里不能一一详细介绍，你可查一下相关实验方法的文献，要根据你的具体情况而定，本人认为如果条件许可，最好通过流式检测，误差小。

sabc128：

假如用HE染色,凋亡细胞和整个细胞数目怎么确定?

youngtiger：

细胞爬片或涂片的HE染色结果判断：

凋亡细胞变圆、边笑，细胞核固缩、碎裂，染色体被染成深蓝色或蓝黑色，可见细胞膜皱折、卷曲，甚至芽生形成膜包裹的凋亡小体。

正常细胞经染色后仍保持细胞原有的生长形状，核规整，染成均一蓝色。

而坏死细胞肿胀，可见细胞膜的连续性破坏，核染色体染成很淡的蓝色甚至消失。

可用凋亡指数进行计数，即随即选择约10-20个视野，计数凋亡细胞百分率。

woodsword：

有一篇文章，可能对你有点用。

ActaPhysiologicaSinica,October25,2004,56（5）:

609-614

xdb86：

常规染色（HE,Giemsa,Wright）普通光学显微镜观察和透射电镜观察要计算凋亡率是很困难的，基本上不可行。

常规染色下要出现明确的凋亡小体你才可以说该细胞凋亡了，早期的和不出现凋亡小体的凋亡无法辨认。

透射电镜观察的细胞数太少，有时也不易与坏死区分，可以定性，也不宜计算凋亡率。

琼脂糖凝胶电泳可以比较不同组别的凋亡程度，但不能得出凋亡率。

TUNEL法太敏感，有DNA断裂的细胞应该都能着色，所以很多人做出的结果不是绝大部分阳性就是全部不着色（可能试剂问题或实验操作问题）。

PI单染色法流式分析：

多用于检测细胞周期分布。

早期凋亡细胞也可以检测到，表现为亚二倍体峰。

我觉得检测凋亡率最好的方法还是Annexin-V-FITC/PI双染色、流式细胞仪分析法，可以得出明确的凋亡率，并区分坏死细胞，其原理是：

在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。

在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。

Annexin-V是一种35－36KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。

细胞凋亡时，可以和外翻的PS结合，从而可以检测凋亡的细胞。

发生坏死的细胞其细胞膜上的PS也外翻，因而也会阳性。

因此，常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外，还会加一种DNA染料，常用的有PI和7－AAD，由于坏死的细胞膜通透性增高，染料可以进入细胞内和DNA结合，从而可以发荧光，区分出坏死细胞。

LXMSUNLIGHT：

1、流式细胞术检测细胞凋亡率

2、AO/EB荧光染色（WangCY,JamesE,JimL.SpontaneousapoptosisinhumancolontumorcelllinesandtherelationofWTP53toapoptosis.ChineseMedicalJournal,1996;109:

537-541）

方法略有改进：

将处于对数生长期的2株细胞制成细胞悬液，调成1×109/L细胞密度加入细胞培养瓶，待细胞贴壁后加入2mg/LAs2O3药物.置37℃50mL/LCO2孵箱培养，按预定时间，将细胞全部收集离心，弃上清加入PBS洗十次，制成细胞悬液，吸200μL，加入8ΜlAO/EB染液，充分混匀，滴于玻片上，分别计数.早期凋亡细胞（VA）核染色质着绿色，呈固缩状或圆珠状.晚期凋亡细胞（NVA）核染色质着桔红色，呈固缩状或破裂状.坏死细胞（NVN）核染色质着桔红色，呈正常细胞结构.活细胞（VN）核染色质着绿色，呈正常细胞结构.细胞凋亡率按以下公式计算：

细胞凋亡率%=VA+NVA/VN+NVN+VA+NVA×100%

如何检测石蜡包埋的组织切片标本的凋亡情况

sorry：

本人想检测石蜡包埋的组织切片标本的凋亡情况，除了传统的Tunel法以外，还有什么其他的方法吗？

xufei19750125：

也可以用免疫组化法检测Fas、Bcl-2等凋亡分子！

ljksbs：

对石蜡包埋的组织切片可以用HE染色来对组织切片中调亡细胞进行形态学观察，如果用免疫组化检测Fas、Bcl-2等调亡基因的蛋白表达，有助于解释其调亡机理，对检测调亡情况无多大帮助；流式仪对单个细胞悬液可以检测调亡，但是对组织切片是无法检测的，但是对还没做成组织切片的石蜡标本可以制成单细胞悬液来进行流式检测，但是过程比较复杂，不好制备，因此，不提倡用。

因此，检测石蜡包埋的组织切片最好的办法还是TUNEL法，还可以结合HE染色观察调亡细胞形态学改变，再结合免疫组化检测Fas、Bcl-2等调亡基因的蛋白表达来解释其调亡机理，已经足够了，

tjbone：

采用免疫荧光检测Fas、Bcl-2等凋亡的细胞也是可行的方法。

DEVELOPINGANEWMETHODFORDETECTINGISLETAPOPTOSIS

萧萧湖：

我要建立一个胰岛细胞凋亡模型，想请教一下可以用什么方法检测凋亡的细胞。

那一种比较好。

situTUNELtechnique的原理那里有详细的介绍啊？

jmtang：

DEVELOPINGANEWMETHODFORDETECTINGISLETAPOPTOSIS

MiamiNatureBiotechnologyShortReports

TheScientificWorld（2001）1,32SR

ISSN1532-2246

Al-Abdullah,I.H.*,Cabrera,O.,Inverardi,L.,Pileggi,A.,Pugliese,A.,andRicordi,C.

DiabetesResearchInstitute,UniversityofMiamiSchoolofMedicine,P.O.BOX016960（R134）,Miami,FL33101,USA

*iabdullah@med.miami.edu

INTRODUCTION.Currentisletcellisolationprocedurescanonlyretrieveaportionofthetotalnumberofisletspresentinthepancreas.Onefactoraffectingisletyieldisavariablelevelofapoptosisthatisassociatedwithmechanicalandchemicalisolationprocedures.Aquickandreliablemethodtoassessapoptosiswouldbethereforeusefultodeterminetheoverallqualityoffinalisletpreparations.WehavetestedPhiPhiLux,arecentlydevelopedmethodforearlydetectionofapoptosis,inisolatedpancreaticislets.

METHOD.Human（n=3）andporcine（n=2）isletswereisolatedbytheautomatedmethodanddensitygradientspurification

（1）.Aliquotsofhighlypurifiedislets（>95%）wereculturedat37°Cand5%CO2inCMRLmedium（Human）andcompleteTC199media（Porcine）.Viabilityandapoptosiswereassessedwithin24hrofisolation（freshislets）andafter7-14daysculture.Viabilitywasassessedusingfluoresceindiacetateandpropidiumiodide（FDA/PI）staining.PhiPhiLux（OncoImmunin,Inc）isafluorescentCaspasesubstratemorespecificforcaspase3likeactivities.Itisuptakenbylivecellsandcanbeusedtodetectearlyapoptoticeventsincelllinesandlymphocytepopulations

（2）.ThefluorescentsignalissimilartothatofFITC.200IEQfromthefreshandculturedcellswerestainedwithPhiPhiLux（50µland10%FCS）for45minat37°C,washedandmountedwithanantifadereagent（Molecularprobes）andexaminedusingafluorescencemicroscope.Theentirestainingproceduretakesabout90minutes.

RESULTS.IsletviabilityasassessedbyFDA/PIstainingappearedtobeverywellpreservedinbothfreshandculturedislets（90-95%）.SubjectiveevaluationofthePhiPhiLuxstainingrevealedthatlessthan1%offreshhumanandporcineisletpreparationsstained.Amongculturedislets,PhiPhiLuxstainedapproximately5%and10%ofporcineisletsafterculturefor7and14days,respectively,whileapproximately2%ofhumanisletswerestainedafter7daysormore.

DISCUSSION.OurresultsshowthatPhiPhiLuxcanbesuccessfullyusedtoassessapoptosisinfreshandculturedpancreaticislets.Thismethodisrapidandsimpleprovidingavaluablealternativetomorecumbersomemethods,suchasTUNELandAnnexin.Verylimitednumberofisletcellswasapoptoticafterisolationusingthemethodsreportedhere,butincreasedapoptosiswasdetectedinculturedporcineislets（5-10%）.TheabilitytodetectapoptosisinhumanandporcinepancreaticisletswiththismethodmustbefurtherverifiedbycomparingPhiPhiLuxstainingwithmoreconventionalapoptosisdetectionmethods（i.e.,TUNELandannexinstaining）.Thispreliminaryreportsimplyillustratesthetechnicalfeasibilityofarecentlydescr