胎盘间充质干细胞的分离和培养0721.docx
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胎盘间充质干细胞的分离和培养0721
胎盘间充质干细胞的分离，原代与继代培养及鉴定
刘亭
2016.7.21
前言2
1分离制备PMSC组织的选取3
2脐带，胎盘MSC的分离与纯化5
2.1胎盘组织的获取，存储与清洗5
2-2脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法6
3原代培养和继代培养10
3-1培养基10
3-2培养密度11
3-3培养条件11
3-4换液11
3-5传代培养12
3-6细胞形态与生长速度12
3-7MSC的冻存与复苏：
12
4细胞表面抗原检测13
5生长曲线13
6细胞周期13
7分化潜能13
参考文献13
附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法15
脐带血15
脐带15
羊膜17
绒毛膜18
蜕膜层18
胎盘19
整体灌注法20
附件2背景知识20
附件3PMSC实验所需试剂21
1
前言
干细胞（Stemcell，SC）是一种能够自我更新且未分化并可分化成两个或
两个以上其它品系的细胞。
在一定的条件下，干细胞能够分化成为多种成熟细胞
类型。
按照来源和分化潜能不同，干细胞可分为胚胎干细胞（Embryonicstemcell，
ESC）和成体干细胞（Adultstemcell，ASC）两类。
胚胎干细胞来源于早期的胚
泡和胚胎内层的细胞群，并且具有向3个胚层细胞分化的能力。
但是胚胎干细胞
应用时产生的免疫排斥、体内实验中引发肿瘤生成以及所涉及的伦理问题等影响
并制约了临床应用。
成体干细胞形成于原肠胚形成后的胎儿和成体组织，早期研
究认为，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。
然而，近几年来的很多
研究表明，成体干细胞具有能够分化成为除来源以外的其他胚层组织的能力。
间充质干细胞（Mesenchymalstemcell,MSC）又称为基质干细胞，是属于
成体干细胞的一种，最早从骨髓中分离而来。
MSC是由早期中胚层发育而来的非造血成体干细胞，该细胞在体外可以贴壁生长，并呈现梭状。
胞质丰富，细胞核呈圆形，1-3个核仁。
在适当的条件下可以大量扩增，并转化为间充质祖细胞，进而分化成包括三个胚层的各种组织细胞，如脂肪、骨、软骨、内皮细胞、成纤维细胞等。
MSC具有低的免疫原性、能向肿瘤迁移、具有免疫调节和造血支持等功能，而且易于外源基因导入表达，是基因治疗中重要的载体细胞。
此外，一些研究学者还发现，MSC具有类似免疫抑制剂作用，可抑制T淋巴细胞在混合淋巴细胞中的免疫反应，并同时抑制T细胞的异基因增殖反应。
所以，MSC在治疗组织缺损、器官退行性疾病、肿瘤及免疫疾病具有相当广泛的应用前景。
近年来MSC已逐步成为干细胞研究的热点（张慧娟等，2014）。
目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。
虽然分离方法简便，但供者取骨髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，
每105-106个单个核细胞中大约只有1个；而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。
其他组织中，如动员的外周血、乳牙、脐带、脐血也存在间充质干
2
细胞，然而，从这些组织中获得的细胞数量较为有限。
以上因素，都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的运用。
目前胎盘或脐带属于临床废弃物，容易获得，并且无污染，取材研究和应用基本无伦理学争议，研究表明胎盘或脐带含有丰富的MSC。
有研究表明PMSC比骨髓间充质干细胞更容易分离培养，细胞活性更好，还可诱导分化成脂肪，成骨等多种细胞。
并且这些胎盘源的间充质干细胞（placenta-derivedmesenchymalstemcells，PMSCs）具有极低的免疫原性，大多数患者对于胎盘或脐带间充质
干细胞具有天然的免疫耐受，因此，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中，即便是人-动物模型间的异种间移植，由于存在天然的免疫耐受，对实验研究的结果影响甚小，这对于很多疾病研究的模型建立具有很好的作用。
目前MSC主要临床应用于抑制移植物抗宿主反应。
动物模型研究结果表明PMSC对子宫内膜损伤（刘芳，2013），大鼠肝组织损伤（宫黎明等，2011），APP+
转基因鼠阿尔茨海默病（郭亚男等，2009）均有疗效，也可以用于构建组织工程
皮肤（徐彪等，2013）。
所以，综合充分利用胎盘和脐带作为间充质干细胞新来
源，优化分离纯化以及传代培养条件，加快细胞繁殖速度，降低培养成本以高
效率获取大量的PMSC对于的各种疾病实验研究及医院各个科室的临床应用，
都具有重要意义。
1分离制备PMSC组织的选取
胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，人足月娩出的胎盘由羊膜层、绒毛膜层和蜕膜层组成。
从脐带血（于海微等，2009；管英华等，2011），脐带（徐燕等，2009；韩之波等，2012；管英华等，2011；李艳琪等，2014；赵琳等，2016），整个胎盘（陆琰等，2009；沙文琼等，2010；刘洋等，2015；赖平等，2016），胎盘的羊膜层（宫黎明等，2011；徐彪等，2013；张慧娟等，2014；丛姗等，2015），绒毛膜层（洪艳等，2014；韩之波等，2012）和蜕膜层（韩之波等，2013）分离培养MSC均有报道。
目前大多数研究者取胎盘小叶（包括绒毛层和绒毛滋养层）
进行分离（洪艳等，2014）。
胎盘的细胞成分较复杂，既有滋养细胞，也有间质细胞、血管内皮细胞和Hofbauer细胞（沙文琼等，2010）。
由胎盘组织分离制备
3
MSC时不可避免会有其它细胞的干扰（苗宗宁等，2009），其中以数量最多的血
细胞干扰为主。
分离MSC选取组织时需要考虑哪个部位的组织可能含有最多的
MSC，并且尽可能降低其它种类细胞的干扰，以获得纯度高，活力强的MSC。
对于人脐带血来源的MSC（humanumbilicalcordbloodMSC,hUCB-MSC）
的存在及能否稳定传代扩增，曾有一定争议，后来的实验结果证实脐带血中存在
MSC，并表明脐带血来源MSC与骨髓来源MSC具有相同的生物学特性及功能特征（于海微等，2009）。
但是脐带血中也存在多能成体干/祖细胞，分离间充质
干细胞的过程以丢失造血干细胞为代价，而且个体差异大（徐燕等，2009）。
脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是Wharton’sJelly，外层由羊膜来源的
上皮包裹，从发育角度来说，脐带是干细胞形成及所经通路（管英华等，2011）。
不同研究机构均从人脐带组织中分离到MSC（humanumbilicalcordMSC,hUC-MSC）。
已有研究表明人脐带的结缔组织是间充质干细胞丰富的组织来源
（徐燕等，2009），故制备hUC-MSC一般剥离脐带动静脉和外层上皮。
管英华等（2011）比较了脐血和脐带两种来源的MSC原代培养过程，结果表明脐血中细胞成分复杂，原代培养多见成纤维样和大圆形破骨样两种形态的贴壁细胞，随着换液和传代破骨样细胞逐渐减少和消失，剩下形态较为单一的呈漩涡样的细胞集落;脐带来源培养的贴壁细胞不会随换液丢失，且细胞形态以成纤维样细胞为主，种类单一。
hUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培养的时间短，培养成功率明显增高。
羊膜是胎膜最内层，胎盘包裹胎儿面的一层薄而半透明的膜，由胚胎羊膜囊
壁发育而成，在胎盘面与绒毛膜相贴，由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组
成，其表面没有神经、血管、肌肉和淋巴等组织。
人羊膜间充质细胞来源于原条
期的胚胎中胚层，而人羊膜上皮细胞来源于胚胎外胚层。
越来越多的研究已证实，
人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞都具有干细胞的特征。
其中人胎盘羊膜来源
的间充质干细胞（humanamnion-derivedmesenchymalcells,hAD-MSCs）不但表
达成体干细胞特性中的间充质干细胞特性也表达部分胚胎干细胞特性，相关研究
表明人羊膜间充质干细胞表达胚胎干细胞全能型标志转录因子基因OCT4、SOX2
和NANOG（张惠娟等，2014）以及SSEA-3、SSEA-4、Oct-4等胚性标志（宫黎明等，2011），近年来发现hAD-MSCs在体外诱导培养条件下，可分化成来自3个
4
胚层的所有细胞（宫黎明等，2011）。
有研究比较人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖能力，发现培养人羊膜间充质干细胞的细胞数量在各时间点均明显高于骨髓间充质干细胞（徐彪等，2013）。
洪艳等（2014）分别从绒毛膜和绒毛滋养层分离并培养MSC，发现在分离过程中，从绒毛膜和绒毛滋养层得到的细胞量都很多，绒毛滋养层的细胞量甚至会超越绒毛膜的细胞量。
但是在接种后培养时，由于绒毛滋养层血细胞较多，血细胞难以处理，影响间充质干细胞的贴壁，无法贴壁就无法继续生长，由此导致后期细胞生长慢，收获细胞少。
韩之波等（2013）的研究表明来自母体的底蜕膜组织也可以分离制备MSC。
苗宗宁等（2009）将胎盘组织分为3组，分别是中央带组即脐带附着处，边缘带组即距脐带附着点最远处和中间带组即两者之间中点处。
分别全层连续切片，以抗CD166、抗CD44、抗CD29分别做免疫荧光和免疫组织化学染色，显微镜下观察阳性细胞表达及分布分布区域，结果表明中间层的阳性细胞数量与表达水平强于绒毛板层和底板层；同为中间层，中央带较中间带及边缘带表达更强。
由此推测，在接近血管丰富的脐带附着部的胎盘中间层取材易于获得较丰富的PMSCs。
2脐带，胎盘MSC的分离与纯化
2.1胎盘组织的获取，存储与清洗
母血检测HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性。
产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病。
临床足月正常剖宫产后胎盘，大小及质量在正常范围内，胎盘脐带附着点均在胎盘中央稍偏位。
经与产妇及其家属签署知情同意书，实验方案经并经医院伦理委员会批准。
在产房无菌条件下获取脐带，胎盘。
文献报道中取组织后有如下处理方法：
立即浸入胎盘储存袋（加拿大LABPLAS公司的无菌采样袋，含99%低糖DMEM，1%双抗即青链霉素的组织保护液），在48h内转移至实验室。
脐带静置于４℃冰箱12h，观察保存脐带的PBS液，若无浑浊说明无感染。
脐带采集后在6h内进行处理，切除双侧带夹痕及淤血的部分。
5
无菌采集健康足月剖宫产羊膜，冰盒中2h内运达实验室进入试验流程。
无菌采集健康足月剖宫产胎盘，并立即进入分离提取程序。
文献报道中组织块的用量及获得：
胎盘组织约50g
3~5个胎盘小叶
剪取胎儿侧的绒毛膜层组织10mL
眼科手术剪将组织剪碎（细碎小块；1mm3大小；呈肉糜状，以能用吸管吸
取为标准；约3mm；5mm3大小的碎块）
组织绞碎分离机（近似肉糜）
文献中的组织浸泡液/清洗液：
#生理盐水
#D-Hank’s平衡液
#磷酸缓冲液（PBS）
#杜氏磷酸缓冲液（D-PBS）
#含肝素的PBS
#含有双抗生素的PBS（0.1%的青链霉素，1%的青链霉素,100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素）
#含有青霉素和链霉素的无血清DMEM/F12培养基
2-2脐带，胎盘MSC的分离及纯化方法
已报道脐带，胎盘MSC的分离方法有组织块贴壁法，酶消化法以及整体灌
注法。
组织贴壁培养法得到的细胞纯度较高，对细胞伤害小，操作相对简单，将
组织块剪碎、贴壁后加培养基培养即可，但原代培养所需周期较长、获得细胞数
量相对有限。
李艳琪等（2014）在首次组织块贴壁培养获得MSC后，将组织块
转移到新的培瓶中继续培养，两三天后仍可见到贴壁细胞，第5天可形成明显的细胞克隆。
这种改进的组织块二次贴壁方法可在较短时间内获得大量原代细胞。
酶消化法可直接将消化得到原代细胞，但是获得的细胞纯度略低、状态不均一，由于消化时间不易掌握，消化时间过短不能得到足量细胞，消化时间过长会对细胞造成伤害，损伤细胞膜成分，导致无法贴壁生长，影响细胞的成活率和增
6
殖能力，甚至导致细胞死亡，给后续培养带来困难（李艳琪等，2014）；对于某
些组织如脐带Wharton’s胶经酶消化后的胶体黏稠，不易离心。
徐燕等2009比
较，植块法培养6~10d可见成纤维样细胞从植块边缘爬出，在原代细胞克隆数、
细胞产率、传代时间及扩增倍数上明显好于胶原酶消化法（1g/L胶原酶Ⅱ3.0~5.0
mL，置于含双抗的PBS中，37℃孵育0.5h）比较存在差异；而胶原酶与胰酶
联合消化法（1g/L胶原酶Ⅱ于37℃孵育16h，以PBS洗涤后加入25g/L胰酶
于37℃孵育0.5h）接种后未见明显贴壁细胞。
常用的酶包括胰蛋白酶，胶原蛋白酶Ⅰ，Ⅱ和Ⅳ。
胰蛋白酶消化能力强，Ⅱ型胶原酶消化能力相对较弱，但对细
胞膜损害较小。
很多研究者对酶的浓度，消化时间，消化方式，多种消化酶联合
消化做了大量探索。
寻求既能充分的分离细胞，又能避免细胞的损伤的方法（赖平等，2016）
组织经酶消化后需要用筛网/多层纱布过滤（100目，200目，300目，100μm的滤器），除去未被消化的大组织块。
滤出的细胞成分复杂，常含有大量的血细
胞。
现阶段用于分离纯化方法间充质干细胞的方法主要有以下几种：
一般离心、
密度梯度离心法、贴壁筛选法、红细胞裂解液法、淋巴细胞分离液（Ficoll）、羟乙基淀粉沉淀、流式细胞仪分选法或磁珠分选法。
因为间充质干细胞没有特异的表面标志，应用流式细胞仪分选法或磁珠分选法会损失大量细胞，且成本高。
每种方法各有优缺点，使用红细胞裂解液对于间充质干细胞的损伤大，使用淋巴细胞分离液进行分离的可重复性较差，技术不稳定（洪艳等，2014）。
文献中报道的消化酶的浓度，消化时间，次数及组合消化：
机械剥离胎盘羊膜组织，PBS反复冲洗，将羊膜组织剪成细碎小块，0.25%胰酶37℃消化10min，过100目筛网过滤获得细胞液。
经胰酶消化后的组织块，继续经0.1%Ⅳ型胶原酶37℃消化15min。
含体积分数为10%胎牛血清的
L-DMEM终止反应后，过100目筛网获得细胞液。
两次收集的细胞液1000r/min离心10min，弃上清液（徐彪等，2013）。
将胎盘组织碎片置于200mL无菌离心管中，联合应用0.25%胰蛋白酶和0.1%
Ⅰ型胶原酶消化胎盘组织碎片。
37℃摇床消化30min，去除组织留取消化液，
经1500r/min离心5min，收集离心获得的细胞沉淀。
将离心后收集到的细胞重悬于含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基（刘洋等，2015）。
7
剪碎羊膜，加入0.5g/L胰蛋白酶-0.02%EDTA-2Na消化液，37℃，200r/min旋转消化10min，弃上清，再加入消化液，37℃旋转消化30min，弃上清，按同样的程序再重复消化2次。
经胰酶消化后剩余的组织用D-PBS液冲洗，加
入0.75g/LⅡ型胶原酶-0.075g/LDNaseI消化液，37℃、
200r/min旋转消化2.0~3.0h，直至组织完全消化，经300目不锈钢网过滤，收集细胞滤液，1500r/min，离心10min，弃上清，细胞沉淀悬浮于LG-DMEM培养基（宫黎明等，2011）。
张慧娟等（2014）无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片，分别
通过7种消化方法，发现用0.05g/L的胰蛋白酶连续消化2次每次消化30min，然后用1g/L的胶原酶消化60min是最合适的人羊膜间充质干细胞体外分离培养条件。
0.05g/L胰蛋白酶消化10min后，再加0.75g/L胶原酶Ⅰ消化60min
0.75g/L胶原酶Ⅰ直接消化120min
0.05g/L胰蛋白酶与0.75g/L胶原酶Ⅰ同时消化60min
0.05g/L的胰酶消化30min后，再加0.75g/L胶原酶Ⅰ消化30min
0.05g/L的胰蛋白酶连续两次消化30min后，再加入0.75g/L的Ⅰ型胶原酶
消化60min
0.05g/L的胰酶连续2次消化40min后，再加0.75g/L胶原酶Ⅰ消化60min
0.05g/L的胰酶连续2次消化30min后，再加1g/L的Ⅰ型胶原酶消化60min取前处理的样品在37℃下，用0.05g/L的胰蛋白酶连续2次消化30min，
用含体积分数5%的胎牛血清DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，筛中组织经PBS冲洗后装入培养皿中，然后加入1g/L的Ⅰ型胶原酶，在37℃下消化60min，之后用含体积分数5%的胎牛血清DMEM终止消化，轻柔
吹打混匀后200目细胞筛过滤，滤液在1500r/min的离心机中离心5min，去上
清液，换DMEM/F12培养基混悬细胞并接种于培养皿中（张慧娟等，2014）。
用眼科手术剪将羊膜剪碎约1mm×1mm组织块，加入等体积的0.05%
trypsin-EDTA，37℃水浴震荡消化30min后加入含血清的培养液，离心去上
清，如此反复消化两次，再用PBS洗2~3次，尽可能去除上皮细胞。
用细胞
筛过滤后剩余的羊膜组织加入不同浓度Ⅰ型胶原酶（0.75、1.00和2.00mg/mL），
8
37℃水浴震荡消化60min，加入含血清的培养液终止消化，混匀后用200目细胞筛过滤，再将滤液1500r/min离心5min收集细胞（丛珊等，2015）。
按体积比约1∶6加入Ⅱ型胶原酶（0.1%），置于37℃恒温水浴箱中消
化30min，间隔5min适当混匀组织与消化液。
之后纱布过滤，上淋巴细胞分离液（赖平等，2016）。
使用pH7.4、含25mmol/LHEPES的D-Hank’s作为消化缓冲液，加入终浓
度为2.5g/L胰酶和300U/mLDNaseⅠ组成消化液，冲洗后的胎盘组织分阶段消
化，每个阶段在恒温气浴摇床中37℃、180r/min消化20min（沙文琼等，2010）。
用手术剪分别将绒毛膜层组织块剪成约5mm3大小的碎块Ⅱ型胶原酶10
mL（酶消化终浓度0.1%），置于摇床内37℃、250r/min振荡，约90min后
终止消化（洪艳等，2014）。
文献中报道的纯化方法：
将细胞悬液缓慢加至已配好的淋巴细胞分离液中。
1500r·min-1，4℃离心
20min，离心后可见“白膜层”，小心吸取该区域细胞，并加入4倍于该体积的PBS稀释，1000r·min-1，常温下离心5min。
重复一次，弃上清（赖平等，2016）
Percoll梯度密度分离：
在50mL离心管中逐层铺入7个密度的Percoll分离液，每个密度5mL。
再缓缓加入5mL细胞悬液，使用水平离心机室温下1200g离心20min。
小心弃除离心管20mL刻度以上的液体，收集12.5~20.0mL刻度的细胞层（滋养细胞）和12.5~7.5mL刻度（胎盘间充质干细胞）的液体，分别放入不同离心管里，用D-Hank’s液稀释5倍后，室温下1000g离心15min（沙文琼等，
2010）。
陆琰等（2009）比较了四种胎盘组织分离纯化从MSC的方法：
胶原酶Ⅳ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组、胶原酶Ⅱ+淋巴细胞分层液分离组、胶原酶Ⅱ+氯化铵裂解红细胞组。
与胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组比较，其余3组获取的细胞数均明显减少（t=2.92~8.16，P<0.05）。
在其他条件相同的情况下，胶原酶Ⅱ+羟乙基淀粉沉淀组培养成功率为100%，其余3组分
别为80%，80%，20%。
剪碎的胎盘组织与1g/L胶原酶Ⅱ中，37℃消化45min。
然后过细胞筛网，
收集各组细胞悬液，分别于室温以1000r/min离心5min，弃上清。
用PBS重悬
9
细胞，加入60g/L羟乙基淀粉（体积比为4:
1）充分混匀，室温静置45min，小心吸取上清，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤2次。
以完全培养基重悬，制成单细胞悬液，锥虫蓝染色计数活细胞数。
按1.5×109L-1密度接种于T-25塑料培养瓶中（陆琰等，2009）。
3原代培养和继代培养
3-1培养基
从文献报道可以看出，需要10%胎牛血清，低糖的DMEM/F12完全培养基，100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素，此外可选的有5μg/L碱性成纤维细胞生长因子，
10μg/L表皮生长因子，10μg/L血小板衍生生长因子。
文献中报道的培养基：
#10%胎牛血清的L-DMEM完全培养基
#5μg/L碱性成纤维细胞生长因子和10μg/L表皮生长因子的L-DMEM完全培养
基
#10%胎牛血清的α-MEM培养基
#LG-DMEM培养基（含体积分数为10%的胎牛血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、10g/L非必需氨基酸、55μmol/L2-巯基乙醇、1mmol/L丙酮酸钠、100U/mL青霉素和100g/L链霉素）
#DMEM/F12+10%FBS+10ng/mLbFGF+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素
#10%的胎牛血清的低糖DMEM
#含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM/F12
#含体积分数为10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F12
培养基
#完全培养基（含体积分数为2%胎牛血清、40%MCDB201、10μg/L血小板衍生生长因子、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L表皮生长因子的DF12培养基）
#DMEM+体积分数为10%胎牛血清+1%enicillin-Streptomycin+5μg/L碱性成纤维细胞生长因子
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