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ceRNA假说

竞争性内源RNA（ceRNA）假说：

揭开RNA“语言”秘密的罗塞塔石碑

编者按：

lncRNA（长链非编码RNA）是一类长度大于200nt，不编码蛋白的RNA，在生物体内有重要的调控作用。

近年来，对lncRNA参与的生物功能及其调控作用机理的研究越来越受到重视。

竞争性内源RNA（ceRNA）假说，让lncRNA功能研究有了新的着眼点，现在让我们跟随生物学大牛Leonardo Salmena的脚步，一起走近阅读这块RNA语言的“罗塞塔石碑”。

（以下内容转载自生物医药科研联盟）

本文将提出一个新的假说，它将解释mRNA、假基因、长链非编码RNA（lncRNA）之间如何通过microRNA反应元件（MRE）进行“对话”的。

我们假设竞争性内源RNA（competingendogenousRNA，ceRNA）在转录体间构成庞大的调节网络，从而极大拓展了人类基因组遗传信息的功能，并在病理条件下发挥重要的作用。

非编码RNA（ncRNA）的革命

低等生物如线虫与人类有许多相同的蛋白编码基因。

然而，人类的基因组却是线虫的30倍，这提示基因组中的非编码基因对高等真核生物的复杂性有着至关重要的影响。

事实上，哺乳动物转录组有很大一部分并非蛋白编码基因的外显子，这也提示哺乳动物基因组中“携带信息”的比例远比之前预期的要大得多。

值得注意的是，关于癌症基因组和转录组的系统分析已经深刻改变了人们对非编码RNA（ncRNA）的认识。

研究已发现一些基因重排如缺失、扩增、倒位和染色体易位除了能够影响蛋白编码基因，还能够影响非编码基因。

尽管目前有一些研究开始关注长链非编码RNA（longnoncodingRNAs，lncRNAs）和特殊调节机制间的关系，但对于非编码转录在基因组规模上的影响却知之甚少。

此外，有关编码基因的非编码功能也鲜为人知。

近期一些理论和实验研究提示，RNA之间通过竞争有限的microRNA池而影响彼此的水平。

在本文中，我们将描述一个系统的假说，解释编码和非编码转录组的新功能。

我们提出竞争性内源RNA（competitiveendogenousRNA，ceRNA）假说，我们将阐述它的机制，讨论目前支持该假说的实验证据，以及改变其动态平衡的后果。

总之，我们假设所有类型的RNA转录体都通过一种新的“语言”进行交流，这种“语言”的媒介就是microRNA结合位点（‘‘microRNAresponseelements’’，或者‘‘MREs’’），而近期实验技术的发展最终允许我们能够听到并翻译这种语言。

ceRNA假说的主角们

该竞争性内源RNA（ceRNA）假说的主角们上场了，它们分别是microRNA、蛋白编码基因、假基因和长链非编码RNA。

一）MicroRNA：

microRNA长约22个核苷酸，可与目标RNA部分互补结合，与microRNA结合的序列成为microRNA反应元件（MREs），结合后通常会抑制目标基因的表达。

多个microRNA能够同时作用于一条mRNA转录体上的不同MREs，而且每一条microRNA能够抑制数百条转录体，因此microRNA调解着数量巨大的转录组。

事实上，microRNA和许多疾病有关，比如癌症。

二）转录组：

蛋白编码基因。

目前已证实人类基因组中大约有2万个蛋白编码基因，其中大多密布MREs。

随着验证编码基因转录体上的MREs的能力的增加，我们就越能预测microRNA依赖的调节。

我么相信通过这种预测，加上恰当的验证步骤，将会在验证ceRNA假说中发挥重要的作用。

假基因。

尽管缺乏规范的启动子，处理过的假基因（比如去除内含子）可以使用近端调节元件进行转录。

事实上，假基因转录具有组织特异性，而且能在特定病理条件下激活或沉默，比如癌症。

重要的是，基因和相关假基因具有序列高度保守性，这提示它们可被相同的microRNA结合。

长链非编码RNA。

长链非编码RNA（lncRNA）长度为300到数千核苷酸不等。

关于lncRNA的报道越来越多，其中部分与表观遗传学机制相关，包括X染色体失活特异转录本（XIST），以及最近证实的长链基因间非编码RNA（linc）。

重要的是，最近一项使用HITS-CLIP技术进行Argonaute结合转录体全球分析发现，microRNA同样能够调节lncRNAs。

ceRNA假说-RNA间通过ceRNA进行对话

microRNAs对负性调节基因，降低目标RNAs的稳定性或抑制其翻译。

因此，microRNAs通常被视作活性调节元件，而目标mRNAs则被视为microRNAs的沉默对象（图1A，左）。

相反，在2009年，Seitz通过计算推测出已证实的microRNA结合位点能够作用于microRNAs，从而调节后者的作用。

Seitz着重于那些低亲和力的“假位点”，而我们则假设“正常的位点”是microRNA调节的关键，这讲更容易计算。

事实上，我们最近通过实验证实，由于假基因序列的高度同源性，它能够编码基因竞争microRNA，假基因通过保守的MREs与其对应的编码基因竞争microRNA池。

竞争的结果就是microRNA含量减少，从而降低其作用。

因此，我们假设，除了传统的microRNA-RNA作用方式外，还存在反向的RNA-microRNA作用方式，这样编码RNA和非编码RNA就可以通过竞争microRNA进行交互。

在这个假说的基础上，MREs可看做“RNA语言”的信使，转录体之间可通过该信使调节各自的表达水平（图1B）。

我们推测，含有越多相同MREs的RNAs之间能更有效的“交流”。

重要的是，我们预测，这种“语言”能通过ceRNAs对话（或者ceRNA网络），适用于整个mRNA系统。

ceRNA假说除了能解释所有非编码RNA的功能外，它还对“编码基因必须被翻译成蛋白才能发挥功能”这一传统理论做出挑战。

我们认为，mRNA还有额外且可预测的功能，那就是调节其它mRNA。

一条mRNA可能既存在非编码功能，又存在编码功能，而且这两种功能的作用可能并不一致，甚至可能相反，从而建立更庞大的调节网络，产生复杂的功能，并导致生理和病理条件的多样性。

此外，ceRNA假说能够解释3’UTR的调节功能。

此外，ceRNA假说能够解释3’UTR的调节功能。

除了作为顺式调节元件，调节转录体的稳定性以外，3’UTR可能通过microRNA结合反向调节其它基因表达（图1C）。

最近证实3’UTR能分别表达在相关的编码序列和经常连接的序列上，这一点也符合ceRNA假说。

同时，我们认为，所有类型的RNA彼此之间都能竞争microRNA，从而产生大规模调节网络。

图1ceRNA语言基础

人们对microRNA-mRNA作用方式已有足够的认识并，但对mRNA-microRNA反向作用却知之甚少

（A）mRNAs和microRNAs之间的作用可能是双向的，因此一条mRNA的水平能够影响到其它mRNA的水平和活性。

（B）RNA之间能够通过microRNA、microRNA反应元件（MREs）进行交流。

RNA之间含有的相同MREs数量越多，它们之间的交流就越“深入”。

（C）RNA的3’UTRs含有MREs，能够自身顺式调节RNA分子，也可能反式调节miroRNAs的水平，从而调节其它RNA的水平。

ceRNA假说-ceRNA网络的逻辑与调节

ceRNA假说依赖于人们对MREs的精确数量和位置的了解。

尽管一些目标预测算法能成功找到microRNA结合位点，但由于microRNA结合的机制仍不明确，因此这些算法通常无法预测出那些重要的结合位点。

我们期望有更好的目标预测算法和新的生化技术出现，进一步证实ceRNA假说。

例如，使用免疫印迹交联实验或HITS-CLIP分离出RNA后进行高通量测序，这可以找出与RNA诱导沉默复合体（RISC）关联的MREs。

那么，ceRNA网络存在需要哪些细胞条件呢？

首先，ceRNA和microRNA的浓度的重要性是显而易见的。

ceRNA表达水平的改变要很大，才足以消除或减弱microRNA对竞争ceRNAs的抑制。

例如，在不同发育阶段或生理/病理条件下RNA转录“开关”会开启或者关闭。

同样，与之结合的microRNA既不会消失，也不会过度表达，因为竞争不会被消除。

其次，ceRNA的有效性还将取决于microRNAs的数量。

这反过来也取决于ceRNA对microRNA分子的可及性，它受到亚细胞定位以及与RNA结合蛋白相互作用的影响。

由于microRNAs并非无处不在，并非持续表达，因此在特定的组织、发展阶段或病理情况下，ceRNA同样影响microRNA的整体水平。

尽管ceRNA网络可以通过一个microRNA发挥作用，但我们推测，大多数强大的ceRNA网络将含有转录体，这些转录体含有多个MREs，可结合多个microRNA。

总之，ceRNA网络取决于RNA和microRNA的密度、浓度、亚细胞定位，还取决于不同物种、不同细胞类型的不同阶段。

再次，并非所有的ceRNAs中的MREs都是相同的。

尽管两个MRE可能结合相同的microRNA，但它们可能具有特定的核苷酸组成，在某些部分存在差异，因此单个MRE结合microRNA的能力对整体ceRNA功能也很重要。

同样，microRNA也能结合数十至数百个RNA，但对不同RNA的抑制程度也不尽相同，其中完全的抑制是很少见的，剩下的大多数结合仅具微调功能。

可以想象，如果一个microRNA结合到ceRNAs上，microRNA的主要目标将受到最大影响。

支持ceRNA假说的实验证据

最近，我们的实验证明非编码假基因能够与其祖先基因竞争microRNA。

我们在抑癌基因PTEN上发现许多MREs，其假基因PTENP1具有保守性。

过表达PTENP1的3’UTR会增加PETN水平，并通过Dicer依赖的方式抑制生长。

有趣的是，在散发性结肠癌上出现PTENP1拷贝数减少，暗示PTENP1也可能为抑癌基因。

我们和其它实验室还将这一分析拓展到其他假基因（如KRAS及其假基因KRAS1P）和蛋白编码mRNA（如PTEN的3’UTR、versican的3’UTR和CD44的3′UTR）中。

不管是假基因，还是编码基因，它们的3’UTR都具有强大的生物学活性，成为microRNA的内源性“诱饵”。

大约在证实这些内源性“诱饵”的三年前，许多研究已发现外源性表达“microRNA海绵”能够有效特异地抑制microRNA的功能。

所谓的“microRNA海绵”是一种人工合成的转录体，它将某种MRE的多个拷贝串联起来。

通常将它克隆到病毒载体上，因此能在细胞中高表达。

这种海绵结构的应用令人激动，也许会成为将来RNA治疗的模式。

类似地，我们认为ceRNA就是“内源性海绵”，能够影响目标microRNA的分布。

和人工海绵不同，ceRNA含有多种microRNA的MREs，因此能够影响多种microRNA的多个靶点。

除了假基因，目前还有其它ceRNA的例子。

Franco-Zorrilla及其同事发现，拟南芥中的非编码RNAIPS1能通过模拟miR-399的靶点并与之结合。

类似地，疱疹病毒中的一种非编码RNAsaimiriRNA能够结合并降解人类miR-27，从而产生对病毒感染、转化有利的细胞环境。

此外，长链非编码RNAHULC（肝癌高表达基因）能结合内源性miR-372，并调节其在HCC中的自身转录上调。

需要注意的是，这些有关内源性海绵的报道都不是蛋白编码RNA。

尽管我们的假说同时适用于蛋白编码和非编码RNA，但我们推测，由于非编码ceRNA不具备翻译功能，专门和microRNA结合，因此可更有效地抑制microRNA。

广泛使用HITS-CLIP和其它相关技术，将最终揭示假基因和lncRNA如何通过microRNA进行作用，并明确它们各自在ceRNA中的位置和影响。

还有一个例子可以很好的支持ceRNA假说，那就是Arvey及其同事发现microRNA的作用受其靶点mRNA的影响。

有多个靶点基因的microRNA更能下调靶点基因。

同样，当某个mRNA上调时，由于MRE总量超过了microRNA，microRNA的抑制作用将会减弱（图）。

因此，改变单个ceRNA的表达水平能够影响其它具有相同MRE的ceRNA。

图细胞内的MRE浓度影响microRNA的作用

图注：

RNAY过表达（如转录激活），会使细胞内某些MRE的浓度上升，microRNA对其它含有相同MRE的转录体（如RNAX）的抑制减弱，RNAX水平随之上升。

反之亦然，RNAY下调可使MRE浓度下降，结果导致RNAX水平下降。

ceRNA在癌症病因中的作用

原则上，几乎任何一种RNA分子都至少含有一种MRE作为ceRNA发挥作用。

因此，要探明ceRNA网络需要精确地找出RNA分子内的所有MRE。

事实上，传统的基因组学和蛋白组学可能会遗漏某些分子相互作用和基因调节网络，我们推测，我们的分析方法可以发现这些遗漏的部分。

基于此框架，我们更应系统地研究人类疾病相关基因的异常表达。

假基因是ceRNA的最好例子，它与其祖先基因含有许多相同的MRE，是最佳的“MRE海绵”，然而，假基因调节细胞生物学的能力却超过调节其祖先基因的能力。

比如，PTENP1通常通过microRNA网络调节PTEN，但其在PTEN缺失的细胞中依然具有生物学活性。

此外，OCT4、NPM1和许多核糖体蛋白基因通常也受多种假基因的调控，这表明基因-假基因的网络是广泛且错综复杂的。

来到癌症领域，ceRNA假说的一个最直接的提示就是，假基因和lncRNA可通过其ceRNA功能，成为潜在的癌基因或抑癌基因。

同时，近期的研究也将内源性lncRNA海绵和肝癌联系了起来。

Panzittetal的研究发现lncRNAHULC是肝癌细胞中上调最为明显的基因。

Wang及其同事也表明，CREB（cAMP反应元件结合蛋白）和HULC上调有关，他们还发现，HULCRNA能通过ceRNA功能抑制miR-372的活性。

这反过来会下调CREB的目的基因PRKACB，从而诱导CREB的磷酸化和活性。

总之，lncRNAHULC是自我放大自动调节环路的一部分，它可竞争miR-372，激活CREB，从而上调其自身水平。

基因组缺失和扩增经常在癌症中出现，如果是那些含有ceRNA的区域异常就可能会产生巨大的影响。

此外，点突变可能会改变蛋白质功能，但却保留了完整的ceRNA功能，根据ceRNA假说，需要将其和基因缺失区分开来。

如果ceRNA假说正确的话，在建立老鼠疾病模型时需要考虑的就是敲除或过表达某些ceRNA。

比如，制作基因敲除小鼠时，需要考虑是仅干扰转录还是包括蛋白表达。

许多实验技术通常只关注基因编码区域的功能，而忽视UTR区，比如，在制作转基因小鼠时，通常只过表达编码序列，而不带UTR区。

然而，microRNA结合位点可以发生在3′UTR、5′UTR和编码区，这提示整条转录体可能都具有反式调控功能。

因此，如果仅关注编码区，许多传统工具和技术可能会忽略基因的全部功能。

染色体易位和通读（readthrough）转录体在癌症中也很常见。

比如，t（15;17）易位会引起PML-RARa和RARa-PML融合转录，就经常出现在急性早幼粒白血病中，而通读转录体CDK2-RAB5B在黑色素瘤中也很常见。

这类事件可以考虑为“UTR互换”，由于错位从而干扰MRE水平，从而改变UTR的表达。

（图）影响非编码区的体基因组重排目前在癌症当中并不是很受重视，但它同样也可能会干扰ceRNA。

异常的选择性剪接事件同样可能会产生新的RNA序列以及新的MRE。

由于癌症和其它疾病过程中也存在异常剪接，同样会影响ceRNA网络，从而引发疾病。

类似地，研究人员也在人类癌细胞中观察到3′UTR缩短现象，这不仅会影响microRNA依赖的mRNA调节，相反，也可能改变mRNA转录体竞争microRNA的能力。

所有这些事件都有一个共同的特征：

它们能干扰某些转录体及相应的MRE的表达水平，不管该转录体是否被翻译为蛋白。

因此，明确上调或下调某一转录体的水平是否能够通过竞争microRNA的方法产生致癌活性将是非常有趣的一件事情。

图：

病理状态下可能的ceRNA改变

许多遗传事件能改变某种转录体的丰度或序列。

基于ceRNA假说，这些事件可能独立于编码功能，而是改变能沉默特定转录体的microRNA的水平。

结论

总之，我们假设，各种RNA之间通过MRE进行交互对话，从而形成庞大的调节网络。

ceRNA能够为进化问题提供答案，它能部分解释基因组大小和生物复杂性的关系。

此外，干扰ceRNA及其网络可能会导致疾病，但另一方面，它也能解释疾病进程，提供潜在的治疗方法。

尽管ceRNA假说还处于起步阶段，但我们相信通过实验，科研人员能够完全找出microRNA结合位点，并为ceRNA语言分类。

我们设想，ceRNA语言将允许我们通过microRNA竞争来预测和控制整个调节网络。

然而，我们依然还面临挑战，比如，为什么会存在这样的一个网络，它们可能会如何演变，让它们受到干扰时会出现什么后果？

只有明确这些问题，我们才能完全破译隐藏在“罗塞塔石碑”背后的秘密。

参考文献：

LeonardoSalmena,LauraPoliseno,YvonneTay,LevKats,Pier PaoloPandolfi.AceRNAHypothesis:

TheRosettaStoneofaHiddenRNALanguage?

Cell,Volume 146,Issue 3,353-358,28July2011

转载来源：

生物医药科研联盟