组培课程园艺同学课程.docx
《组培课程园艺同学课程.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《组培课程园艺同学课程.docx（19页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
组培课程园艺同学课程
组培课程
第一章：
安全事项
一药剂使用安全
．危化品品种：
氯化汞，浓盐酸。
易燃物：
99%酒精。
危化品废弃物处理：
将使用过的氯化汞废弃溶液放债指定的废弃物处理箱，并密闭保存。
易燃物处理:
99%酒精放置于远离明火，近于水源，便于发生燃烧时可以及时采用灭火措施的地方。
危化品放置：
将氯化汞，浓盐酸等危化品放置于加固的铁质药品柜，且平时有安全锁锁定，每次使用皆记录使用量，使用人。
危化品放置环境处理：
在放置危化品的房间，采用木门加铁门双重防护，且上锁，非经允许不得入内。
二仪器使用安全
危险仪器:
2台一类容器型号的高压蒸汽灭菌锅。
注意事项：
学生在实训或实习使用时。
必须有2位指导老师在场看护，并严格按照灭菌锅使用步骤进行操作，不得私下违规操作。
未经指导老师允许，不得随意进出灭菌锅室。
第二章：
无菌概念建立
为什么要建立一个无菌概念呢？
因为引起很多植物组培失败的原因主要是菌类污染，二造成菌类污染的原因就是灭菌不彻底。
1.对环境的意识菌是无处不在的，但凡暴露在空气中和接触自然水源的物体，至少他的表面都是有菌的，童鞋们不要因为肉眼看不到而忽视它哦
2.操作的意识菌是无处不在的，但是我们通过操作，仔细注意便能有效的避免它。
操作中主要的交叉污染。
3.自我的意识人生活在大自然，其实自己本身就是一个强悍的带菌体，因此注意自身的清洁和操作是非常有必要的哦。
4.灭菌操作
灭菌操作主要有两方面：
物理灭菌和化学灭菌。
组培常见的物理灭菌有以下几点：
压力蒸汽灭菌主要用于培养基，无菌水，灭菌盘等的灭菌。
灼烧灭菌主要用于无菌接种的器械。
紫外辐射注要用于接种室，超净工作台等的空间灭菌。
臭氧发生器的原理其实就是紫外辐射的原理。
超声波主要用于培养瓶的消毒洗涤。
熏蒸灭菌主要是用加热焚烧，氧化等方法，是化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。
譬如用相应的比例将高锰酸钾和甲醛混合，使其挥发气体进行熏蒸灭菌。
喷雾灭菌，接种室空间或物体表面可用75%酒精做喷雾处理，可杀死空间微生物，同时使悬浮在空间的灰尘沉降到地面。
涂抹灭菌：
桌面，墙面，双手，植物材料表面可用75%酒精反复涂抹灭菌。
浸泡灭菌，把接种器械，接种材料直接浸泡在一定的消毒剂中达到灭菌的目的。
譬如把接种器械浸泡在75%的酒精中。
以及将外植体浸泡在一定浓度的消毒剂中杀菌。
第三章组培常用仪器及药剂的认识
分类
名称
用途
规格
常用仪器
天平
药物天平
分析天平
冰箱
酸度计
测定PH
加热器
电磁炉
培养基灌装机
纯水仪
高压灭菌锅
用来灭培养基
紫外灯
超净工作台
用来无菌操作
榨汁机
人字金属梯
洗瓶机
用来洗瓶
臭氧发生器
用来空间消毒
通用器皿
烧杯
搅拌器
洗耳球
药匙
玻璃漏斗
剪刀
各种盛具
塑料桶
塑料筐
各种规格的磨砂玻璃瓶
纯水水桶
计量器械
量筒
容量瓶
吸量管
微量移液器
灭菌器械
器械架
在无菌操作期间用来放置灭菌的器械
灭菌容器
小型三角烧瓶
用来植物的灭菌
酒精灯
灭菌器械
接种器
用来消毒接种器械
接种器械
小型喷雾器
镊子
用来接种
解剖刀
用来切割外植体
解剖剪
培养器械
试管
培养瓶
试管架
常用药剂
硝酸铵
硝酸钾
氯化钙
硫酸镁
磷酸二氢钾
碘化钾
硼酸
硫酸锰
硫酸锌
钼酸钠
硫酸铜
氯化钴
乙二胺乙酸二钠
硫酸亚铁
甘氨酸
肌醇
烟酸
维生素B6
维生素B1
蛋白胨
花宝
激素
6苄基腺嘌呤
萘乙酸
激动素
吲哚乙酸
添加物
固体添加物
为植物提供影响
琼脂
固化剂
蔗糖
为植物提供碳源能量
活性炭
用来吸附植物中的一些有害物质
盐酸∕氢氧化钠
调整ph
阶段
动作
要领
思考
1
接种室消毒
1、预先对接种室灭菌，
2
接种用具摆放
接种室消毒后，接种工具等摆放在超净工作台上，并在接种前20分打开超净台的风机和紫外灯，同时打开接种器，同时也可以将接种室的紫外灯打开。
3
进入接种室
接种人员用肥皂水洗净双手们，在缓冲间换上拖鞋或带上鞋套，穿好工作服和戴好帽子和口罩后进入接种室，随后打开超净台的照明灯。
手及台面消毒
用75%酒精浸泡过的酒精棉球擦拭双手，然后按一定顺序和方向擦拭超级台面。
擦拭接种工具并灼烧灭菌
用酒精棉球全面擦拭接种工具及培养皿，然后点燃酒精灯，按接种工具的先后顺序插入灭菌器，并将灭完菌的接种工具摆放在接种盘上，
瓶苗和培养基的处理
1.用酒精棉球将药用的瓶苗和培养基擦干净，并放入操作台前面。
2.火烤原瓶苗和培养基瓶口，务必在火焰前方开瓶（火焰前方菌类存在几率小），开瓶后快速火烤瓶口和瓶塞，将原瓶苗的瓶塞放在操作台外侧，培养基的瓶塞放在最里边。
瓶苗接种
1.将幼苗放在接种盘内，，然后一手拿镊子，一手拿剪子（手术刀）对材料进行切割成适宜的大小。
2.将外植替插直或平放在培养基上。
3.种完之后，将工具放入酒精瓶。
完瓶子的瓶口，瓶塞，在火焰前方盖上瓶塞，并且拧紧，放在小台车上。
清理现场
1.所有材料接种完毕，用记号笔在瓶壁上注明材料名称缩写，接种日期和接种人员。
2.接种结束后清理干净超净工作台，填好仪器使用记录本。
3.将当天的空瓶子和垃圾拿出接种室，当天清理干净。
4.将操作台面，小台车及地板擦干净，关上接种器，酒精灯和操作台开关。
第四章无菌操作
接种前准备
一．洗手：
二．三防服正确穿上身在更衣室内穿无菌操作服。
三防服穿好后要卷衣袖至手臂，切记自己的衣袖不可露于无菌操作服的外面，戴操作帽时将头发全部挽入，防止头皮屑掉落，穿室内拖鞋。
三，进入风淋室。
进入风淋室是应将双手向上升直，并转圈使身体尘埃散落，等风淋室吹风停止方可进入操作室。
同时风淋人员最多不可超过4人。
接种准备工作
1.将无菌操作台。
小台车，地板的整体部位按顺序用75%的酒精擦干净。
2.将当天所用的工具，酒精脱脂棉，油性笔的办法准备好。
3.用75%的酒精将手，手臂擦干净。
4.用75%的酒精将无菌操作台台面及网格，酒精灯，工具盒全面擦干净。
5.火烤工具，工具在火焰外焰上要慢速移动，要火烤全面。
，不可草草了事、
6.将工具放在无菌操作台的左侧最里面。
酒精壶及喷酒精的脱脂棉放在无菌操作台的左侧最外面。
无菌接种操作
1.用75%的酒精将要用的瓶苗和培养基擦干净，放入操作台前面。
以放5瓶为标准。
2.仔细查看原瓶苗是否感染，确定没有问题后方进行下一步操作。
3.火烤原瓶苗和培养基瓶口。
务必在火焰前方开瓶，开瓶后快速火烤瓶口和瓶塞，将原瓶苗的瓶塞放在操作台外侧，培养基瓶塞放在最里面。
4.从酒精瓶中取出接种工具在火上全面快速烤过，待工具冷却后开始进行瓶苗移植工作，移植时所有动作应水平移动，手与工具切记不可挥过瓶口上方，往培养基内放苗时，工具应倾斜于瓶口上方，不可垂直。
5.种完之后，将工具放入酒精瓶捏，火烤完瓶子的瓶口，瓶塞，在火焰前方盖上瓶盖。
并且拧紧，放在小台车上。
6.每种完一瓶母苗后，应更换一套工具，在继续下一瓶的操作。
接种完毕后
1.将当天种好的瓶苗写上品种代号，操作员代号与日期，摆到小台车上。
数量不多或不够的应按要求做好标记。
2.将操作台面，小台车及地板擦干净，关上酒精灯，接种器和操作台的开关。
3.将当然移完的空瓶子，垃圾拿出操作室，当天清理干净。
4.将当天种植完成的瓶苗按要求整齐摆到培养室内指定的架子上，培养基按培养架上的代号归位，不可乱放。
外植体的选择与处理技术
一，外植体最好在其生长开始的季节选取，选取生长健壮的器官或组织代谢旺盛，再生能力强的。
确定外植体的取材部位，最好选取不易变异的部分，除特殊条件除外。
选择外植体的大小要根据培养目的而定，选取时间最好是晴天且早上露水已干的这段时间。
二，外植体在接种前必须进行表面消毒。
消毒情况视外植体的具体情况分析。
三，外植体消毒操作步骤
1.预处理预处理在清洗室内处理。
材料选取-----材料预处理与修整-------洗衣粉或洗洁精浸泡--------（刷子刷洗）--------流水冲洗----放入接种室
2.消毒消毒在接种室内处理
材料取出放入无菌瓶-------75%酒精浸泡---------无菌水漂洗---------消毒剂处理--------无菌水漂洗----------无菌接种
外植体修整方法
外植体类型
修整方法
种子和果荚
直接冲洗消毒，如果种皮较厚，颗去除种皮或用药剂浸泡软化。
叶片
叶片带油脂，蜡质，茸毛。
可用刷子蘸肥皂水刷洗。
较大的叶片颗剪成若干带叶脉的也块，大小以能放入冲洗容器为宜。
茎段、花梗
先去除枝条上的叶片、刺等，如果是软质枝条则用软毛刷刷洗，硬质枝条用刀刮枝条表面蜡质，茸毛。
再将枝条剪成带茎节的茎段。
外植体消毒剂
灭菌剂
使用浓度
消毒时间（分）
氯化汞
0.1%~0.5%
3~20
酒精
70%~75%
0.5~2
次氯酸钠
0.7%~20%
5~30
无菌操作注意事项
1.接种人员：
接种人员要经常剪指甲，实验服和口罩帽子应经常清洗和严格灭菌。
无菌操作时要带上口罩，防止大声说话或咳嗽所引起的污染。
双手不要离开超净台，头部不要伸入超净工作台，手及手臂尽量避免或减少从培养皿上方经过，离开超净工作台后再接种时药重新擦手。
2.瓶苗接种：
仔细查看原瓶苗是否污染，确定没有问题后方可进行下一步操作，无法显示原瓶感染，需经主管确认后再做处理。
瓶苗火烤时间不可过长，以免瓶苗受烫伤。
用手开瓶时，拇指切记不可接触到瓶口。
移植时所有动作均应水平移动，手与工作切记不可挥过瓶口上方，往培养基内放苗时，工具应倾斜于瓶口上方，不可垂直。
分苗是要注意分级，差不多大小的苗放在同一培养基瓶中，插苗时根要插入培养基中，但不可将瓶苗也淹没在培养基中。
每接完一瓶后，应更换一套工具，在继续下一瓶的操作。
3.其他注意：
酒精灯内的酒精易挥发应随时补充。
操作台上方一律保持干净。
各种瓶苗需处理问题
1.铁皮石斛原球茎只需放在培养基表面。
不需要直插入培养基，且摆放应有空隙。
小苗和大苗，原球茎应分开，幼苗应直接插入培养基。
2.蝴蝶兰蝴蝶兰的增殖苗应每颗芽一个位置，如果芽小。
不要切断，直接分为一颗。
蝴蝶兰生根的不需要切割叶片。
大小苗应分级。
增殖苗每瓶接25颗。
生根苗每瓶接14颗最佳。
畸形苗需剔除。
瓶苗需插正，不可有倒伏现象。
3.蝴蝶兰花梗在处理的时候，应去除苞片，但在去除苞片的同时，手术刀切记不能伤到幼芽。
4.金线莲金线莲接种时，应注意一个茎段一个芽，且摆放应整齐。
5.铁皮石斛荚果接种时。
操作应注意，只需轻轻用手术到割开，将种子撒入培养基即可。
第五章培养基认识，配置
1
准备仪器，用具和试剂
2、电子分析天平（精确度0.001和.0001各一台）、磁力搅拌器、塑料烧杯（500ml、1000ml）、量筒（100ml、500ml、1000ml）、容量瓶（500ml、1000ml）、标签纸、记号笔、周转筐。
3、配制母液所需的药品、植物激素、95%酒精、蒸馏水、0.1molNAOH、0.1molHCL。
琼脂、白砂糖。
4、培养基灌装机、托盘天平、酸度计、PH试纸、移液管架、吸耳球、电磁炉。
5、玻璃棒、培养瓶、温度计、培养瓶盖。
2
母液的配制
1.计算每种母液的试剂用量。
2.分别称取各种试剂。
3.药剂分别溶解。
4.混合定容。
5.母液装瓶。
6.贴标签。
7.冰箱保藏。
8.及时记录配制试剂名称、时间。
3
激素配制
1.确定激素配制的浓度与体积。
2.计算激素的用量。
3.称取激素。
4.溶解激素（不同的激素要使用不同的酸碱剂溶解）。
5.激素定容与装瓶。
6.贴标签（记录激素名称与激素配制时间）
7.冰箱冷藏。
培养基配制
1.确定培养基配方及用量。
2.称取琼脂粉、蔗糖。
3.量取蒸馏水。
4.加热熔化琼脂粉。
5.移取各种母液。
6.培养基定容。
7.调整PH。
8.培养基分装。
9.培养基封口。
10.培养基标识及记录。
培养基配置简易流程
母液及激素配置简单图
培养基配置简单图
1.配制大量元素母液时，一定要考虑彼此之间是否会发生沉淀或产生气体反应，因为这两种现象均会使配制的母液准确度降低，从而影响植物生长效果。
另外，决定扩展倍数是主要是试剂的溶解度。
2.配制铁盐母液要先将螯合剂和硫酸亚铁分别溶解，然后将螯合剂缓慢倒入硫酸亚铁溶液中，充分搅拌并加热5~10分钟，使其充分螯合
3.配制激素母液时，强碱或强酸是作为助溶剂参与的，所以用量不能太多，一般配制100ml母液时，助溶剂不能超过10ml。
如果此时还不能溶解，应该再加热或直接加入热蒸馏水即可。
4.母液保存时间不要过程，最好2个月内用完。
5.吸取各种母液时吸量管要专用，不要吸了一种母液后再吸取另一种母液。
6.酸度计使用后。
其电极需要用65℃的热水洗净。
7.培养基配制应建档备案，并妥善保管。
8.培养基应在24h内灭菌，灭菌后最好在3天后使用，不宜重复灭菌。
第六章仪器洗涤
新购玻璃器皿洗涤图
使用过的玻璃器皿的洗涤图
1.使用洗液洗涤玻璃器皿时应戴上橡皮手套，避免裸手与洗液直接接触而腐蚀皮肤。
2.用于制备或储存培养基母液的玻璃器皿最好专用，且洗涤要及时。
3.如果玻璃器皿不能及时洗涤，应立即用清水冲洗后浸泡水中。
4.玻璃量器洗涤后最好不要用高温烘干，否则易引起量具变形，影响到量取液体的准确性。
第七章试管苗的驯化与移栽
炼苗驯化简易图
移栽成功原因
内因试管苗驯化移栽成活率低的内因主要有植物的种类和试管苗的质量。
外因试管苗驯化移栽成活率低的外因主要有环境条件，管理措施及管理人员的责任心。
第八章培养室组培苗的常见处理
植物组织培养过程中主要的问题有外植体污染，和褐化。
玻璃化及黄化等。
植物组织培养中如何培养？
外围环境
1.温度大多数植物组培的最佳温度在23~27℃之间。
2.光照光照在2000~3000lx，光周期心思14~16小时之间。
3.湿度室内湿度在50%以下，瓶内湿度在70%~80%之间。
4.PH对于大多数植物来说PH在5.6~6.0之间。
培养程序
1.初代培养：
最初建立的外植体无菌培养阶段。
2.继代培养：
通过继代培养所获得的不定芽，无菌茎梢。
胚状体和原球茎等无菌材料。
3.壮苗生根：
当丛生芽增殖打牌一定数量后要分离成单苗转入生根培养基进行诱导。
升级会员 