透明质酸的提取工艺研究3稿.docx

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透明质酸的提取工艺研究3稿

透明质酸的提取工艺研究

摘要：

论述了透明质酸的结构和理化性质，各种提取方法以及各方面的应用和发展前景。

关键词：

生化药物，透明质酸（HA）,提取工艺

生物技术是21世纪技术的核心，它是利用生物体或其组织部分发展产品的技术体系，利用生物技术研究和开发的。

生物技术药物与生化药物没有严格的界限，可以利用现代生化技术生产，还可以用化学方法合成或修饰，这些药物均具有疗效高、安全性强、生产污染小、原料取自天然、可生物利用等优点。

在人类面临健康资源、环境、人口危机的今日，更显出其独有的魅力，在制药业已异军突起，而且生物技术制药市场方兴未艾。

透明质酸是一种性能优良的生化物质，应用极其广泛，它的应用开发和生产是目前生化药界比较热门的课题。

引言

透明质酸（Hyaluronicacid简称HA）又名玻尿酸，是一种酸性粘多糖类高分子化合物，基本结构由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。

分子式：

（C14H20NNaO11）n，其结构式如下如所示：

与其它粘多糖不同，它不含硫。

广泛存在于人和动物的结缔组织、眼球玻璃体、细胞间质、关节滑膜液、脐带、角膜、鸡冠、鸡胚及细菌壁中。

由于其具有特殊的生理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力,在化妆品工业、医学研究、临床治疗等领域得到了广泛的应用。

它的透明质分子能携带500倍以上的水分，为目前所公认的最佳保湿成分，目前广泛的应用在保养品和化妆品中。

1结构及理化性质

HA高聚物的结构单元由一分子D-一葡萄糖醛酸与一分子N-乙酸氨基葡萄糖以β-1，3糖苷键连接而成，此单元的N-乙酸胺基葡萄糖又以β-1，4糖苷键与另一单元的D-葡萄糖醛酸相连分子量通常为数十万。

HA具有以下理化特征：

1）无定形物质；2）水溶液带负电；3）分子链间成紊乱的网状结构；4）水溶液有较好的粘弹性和渗透压；5）分子存在大量的羟基

2透明质酸的提取方法、

ＨＡ的生产工艺主要分为两大类：

以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。

本工艺中，组织提取法选取鸡冠为原料；细菌发酵法选取牛鼻粘膜，其含有能产生HA的链球菌。

2.1以鸡冠为原料的工艺流程

鸡冠（丙酮、脱水）→脱水鸡冠（蒸馏水）→滤液NaCl（氯仿提取）→水相（乙醇、沉淀）→透明质酸（脱水：

干燥）→粗品（0.1mol/LＮaCl溶液）→溶解液（稀HCl，ＰＨ４·５、氯仿）→水相（NaOHpH7.7链酶蛋白酶）→酶解液（氯仿）→水相（氯化十六烷吡啶）→沉淀（CaCl离心）→上清液（95%乙醇：

沉淀）→沉淀（脱水）→HA产品。

2.2发酵法生产

微生物发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜来生产HA。

与组织提取法相比,具有成本低、生产规模不受动物原料限制、发酵液HA以游离态存在、易于分离纯化和形成规模化生产、无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。

2.2.1实验材料：

牛鼻黏膜140份。

培养基。

目前所用培养基氮源为各种肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。

其中酵母浸膏最常用。

在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸,可以提高HA的产率。

碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物,最常用的是葡萄糖。

其他还有磷酸盐、硫酸盐、钾、钠、钙、镁等无机盐。

此外,为了获得高分子量的HA,培养基中不能含有促使HA降解的金属离子,如铁离子、铜离子;也不能加入自由基清除剂,以防止HA降解。

主要有以下几种:

①斜面培养基。

牛脑沁液800mL,牛心沁液200mL,牛肉膏的质量分数为0.3%,蛋白胨为1%,NaCl为0.5%,琼脂为1.8%,灭菌前pH=7.0,121℃灭菌20min。

②血琼脂平板培养基。

葡萄糖的质量分数为2%,蛋白胨为1%,牛肉膏为1%,MgSO4•7H2O为0.1%,KH2PO4为0.2%,琼脂为1.6%,灭菌前pH=7.0,121℃灭菌20min.,冷却至50℃以下,无菌条件下加入无菌脱纤维兔血。

③摇瓶培养基。

葡萄糖的质量分数为4%,蛋白胨为1%,牛肉膏为1%,MgSO4•7H2O为0.1%,KH2PO4为0.2%,灭菌前pH=7.0,121℃灭菌20min,冷却至50℃以下,无菌条件下加入体积分数为10%的小牛血清。

2.2.2试验方法

菌种分离筛选操作方法

（1）初筛。

将牛鼻黏膜用0.1%蛋白胨溶液稀释成不同梯度涂于血琼脂平板,在37℃下培养24h。

观察各菌落在血平板上的溶血性和形态,用接种针挑起看其黏度、荚膜染色和革兰氏染色并镜检。

（2）复筛。

在发酵摇瓶中接入初筛疑似菌株,每株3瓶,在200r/min,37℃下培养24h。

用红外吸收光谱对经复筛发酵液提纯得到的多糖精品作定性分析。

（3）红外吸收光谱法。

取HA2mg,KBr压片,用IR2400红外分光光度计在4000～500cm-1范围内扫描。

2.2.3　诱变方法

人们研究发现，链球菌属和多种细菌都有荚膜，这种荚膜的主要成分是HA，同时，在这些细菌中也含有透明质酸酶，它使HA降解，所以，发酵法生产HA的基础是找到高产HA，又不产生透明质酸酶的菌种。

（1）制备菌液。

菌液经3500r/min离心10min后弃上清。

供紫外线诱变处理的菌体用生理盐水洗涤2次,重新悬浮于5mL生理盐水中,摇匀后倒入盛有45mL灭菌生理盐水并带玻璃珠的100mL锥形瓶中,振荡10min,调整细胞浓度至108/mL。

在进行诱变处理菌体时,用0.1mol/L、pH=6.0的磷酸盐缓冲液代替生理盐水,其他与供紫外线诱变处理菌体的菌液制备相同。

（2）紫外线诱变处理。

紫外灯的功率为15W,照射距离为30cm。

将3mL菌液和磁力搅拌棒放入直径为9cm的无菌培养皿中,搅拌照射时间为2min。

（3）NTG诱变处理。

称取1mgNTG倒入无菌离心管中,加入0.1mol/L、pH=6.0的磷酸缓冲液1mL,暗处振荡溶解。

取4mL菌液加入上述离心管中,充分摇匀,立即置于37℃水浴振荡处理30min（NTG处理终浓度为100g/mL）后,离心收集菌体,将含NTG的上清液倒入浓NaOH溶液弃去,用无菌水洗涤菌体3次,用大量稀释法终止NTG的诱变,最后向离心管中加5mL无菌生理盐水。

（4）突变株筛选。

诱变处理的菌液经过中间培养稀释涂于平板上,从血琼脂平板上挑取溶血性较弱或不具溶血性的菌株。

再将其置于斜面培养基,在37℃下培养14～16h,选取2～3环接入装有50mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中,在200r/min的旋转摇床上培养24h后测定发酵液中透明质酸的含量,选取产量提高的菌种。

（5）HA菌的提纯。

目前,HA产生菌的诱变方法多为紫外线照射和化学诱变剂等常规方法,本实验室使用微波诱变、超声波诱变及微波-超声波复合诱变的方法选育出高产菌株,其诱变菌株比原始菌株透明质酸产量高出61%,且该菌种经5次传代后透明质酸产量稳定,实验证明该诱变选育方法具有一定的研究价值。

透明质酸生产菌株的选育野生型的链球菌作为HA产生菌,首先要经过诱变使其成为溶血素和透明质酸酶缺陷型菌株。

链球菌多会产生溶血素（Streptolysin）,溶血素有溶解红细胞、杀死白细胞和毒害心脏的作用。

溶血素混入成品HA,还会使HA的品质降低,不能用于医药品和化妆品,所以规模生产必须获得非溶血性的菌株。

邓开野从血琼脂平板上筛选出一株不具有溶血性的突变菌株,其性能比原始菌株有很大提高。

2.2.4发酵条件。

HA发酵有需氧发酵也有厌氧发酵。

有氧发酵一般产率较高且分子量高。

在发酵过程中保持适当的溶氧量,而在不同的阶段采用不同的溶氧量,也是提高HA产率的手段之一。

根据HA生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的ATP，有利于UTP生成，而UTP是合成HA的两个活化前提物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。

因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。

Nimrod等用兽疫链球菌的一个变异菌株进行发酵，在厌氧条件下，HA的产率为2g/L；在通气条件下，为4g/L~6g/L。

在发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，也可在不同阶段采用不同的溶氧量。

通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧，但转速过快可导致HA的机械降解。

在HA发酵过程中,pH值一般控制在6.0～8.5范围内,低于6.0或高于8.5会影响菌体的生长,降低HA的产率和分子量。

链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸等小分子有机酸，需用碱液进行中和，以维持适当的pH值。

发酵温度通常为37℃。

发酵过程中需要检测的主要参数有pH值、溶氧量、葡萄糖含量、发酵液粘度、HA含量和菌体密度等。

测定发酵液粘度可直观反映出HA产率的高低。

在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在37℃。

发酵温度一般为37℃，也有的采用35℃或33℃等较低的温度，或在不同的阶段采用不同的温度。

在种子培养阶段和发酵的初期，37℃培养可使菌体较快的生长繁殖，发酵中期和后期可适当降低温度，据报道可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成HA，提高HA的产率。

2.2.5工艺过程

取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液锥形瓶中，37℃培养12h~16h，接种于种子罐中。

培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖。

37℃搅拌培养12h~16h，接种于发酵罐中。

接种比例1：

10。

发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为3%~6%。

维持通气量0.3vvm~1.0vvm，搅拌转速120r/min，37℃发酵40h~46h。

在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，需调pH6.5~7.0。

发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5%以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。

发酵结束，用三氯乙酸调pH4.0~4.5，板框过滤除菌体，滤液调pH6.0~6.5，加3倍体积95%乙醇，沉淀出HA。

沉淀用发酵体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的1%CPC与滤液中的HA发生络合沉淀，静置使沉淀下沉。

虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次。

沉淀在发酵体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜。

过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得HA

如果直接用野生菌发酵,发酵液中会有一定量HA,但含量极低,一般情况下不会超过2g/L,得到的HA分子量也很低,因此必须经过诱变、筛选等手段选育出高产菌株。

而现阶段报道多以紫外诱变和化学诱变为主,应从其它多种育种方法着手,以期得到稳定的高产菌株。

2.2.6从发酵液中提取HA。

在后处理前,首先要杀灭和除去发酵液中的菌体。

通常加入杀菌剂或加热灭活菌体后离或过滤除菌。

也有文献报道将壳聚糖或氯代十六烷基吡啶直接加入发酵液中以沉淀HA。

HA含量较高时,发酵液粘度很高,需要用水稀释后再离心或过滤除菌,滤液再经乙醇沉淀、CPC沉淀、超滤等方法进行分离纯化,最后用有机溶剂沉淀、真空干燥制得最终产品。

乙醇沉淀时,HA溶液中一定要有盐的存在,否则不会产生沉淀。

常用的盐为NaCl和NaAc,浓度在1%左右。

乙醇沉淀HA不仅可除去杂质,而且可以脱色。

粗品制备

量取一定体积发酵液,缓慢加入2倍体积的乙醇,边加边搅拌,静置2h,4000r•min-1离心5min,倾去上清液,沉淀用工业乙醇脱水3次,真空干燥即得HA粗品。

6种除蛋白方法

加热法：

取适量HA粗品溶于蒸馏水中,于90℃水浴中边加热边搅拌10min,冷却至室温,4000r•min-1离心5min,弃去沉淀,上清液醇沉干燥即得HA精品。

盐酸法提取适量HA粗品溶于蒸馏水中,用10%HCl溶液调节pH至410～415,4000r•min-1离心5min,弃去沉淀,上清液用稀NaOH溶液调pH至610～615,醇沉干燥即得HA精品。

三氯乙酸法：

　取适量HA粗品溶于蒸馏水中,用10%三氯乙酸溶液调pH值至410～415,4000r•min-1离心5min,弃去沉淀,上清液用稀NaOH溶液调pH至610～615,醇沉干燥即得HA精品。

　Sevage法：

　取适量HA粗品溶于蒸馏水中,加入总体积1/5的氯仿和氯仿体积1/5的正丁醇,剧烈振摇20min,静置分层,弃去蛋白乳化层。

按上述方法重复4次后,上清液醇沉干燥即得HA精品。

氯仿法：

　取适量HA粗品溶于蒸馏水中,用10%HCl溶液调pH至510,加入等体积的氯仿,振摇20min,静置分层,弃去下层氯仿及中间的蛋白乳化层,再向上清液中加入等体积的氯仿,重复上述操作2次后,弃去乳化层及氯仿,上清液醇沉干燥即得HA精品。

　等电点沉淀法：

　取适量HA粗品溶于蒸馏水中,加热至55～60℃,过滤,滤液用5mol•L-1NaOH溶液调pH至1010～1015,过滤,再用10%HCl溶液调pH至610～615,过滤,滤液加入约2～3倍体积工业乙醇沉淀,沉淀用蒸馏水溶解,再用5mol•L-1NaOH溶液调pH至1010～1015,过滤,然后用10%HCl溶液调pH至610～615,过滤,滤液醇沉干燥即得HA精品。

3透明质酸的特性及用途

HA具有许多天然粘多糖共有的性质：

呈白色、为无定形固体、无臭无味、具有强烈的吸湿性、溶于水、不溶于有机溶剂。

由于直链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上呈刚性的螺旋柱型[，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强烈的亲水性；同时羟基的连续定向排列，又在分子链上形成高度的憎水区，HA分子的亲水和憎水特性，使得浓度低于1‰的HA也能形成连续的三维蜂窝状网络结构_2j，水分子则在网络内通过极性键和氢键与HA分子相结合，使得这些水在柱内固定不动，不易流失，HA亲和吸附的水分约为其本身重量的1000倍，这是其它粘多糖无法比拟的所以HA是理想的保水剂，是目前自然界中发现的保水性最好的天然物质。

透明质酸可分为:

1）化妆品级透明质酸。

透明质酸是皮肤和其它组织中广泛存在的天然生物分子，具有极好的保湿作用，被国际上称为理想的天然保湿因子。

大分子透明质酸（分子量范围1800000～2200000）可在皮肤表面形成一层透气的薄膜，使皮肤光滑湿润，并可阻隔外来细菌、灰尘、紫外线的侵入，保护皮肤免受侵害；中分子透明质酸（分子量范围1000000～1800000）可以紧致肌肤，长久保湿；　小分子透明质酸（分子量范围400000～1000000）能渗入真皮，具有轻微扩张毛细血管，增加血液循环、改善中间代谢、促进皮肤营养吸收作用，具有较强的消皱功能，可增加皮肤弹性，延缓皮肤衰老。

衡量一个好的护肤品是以含有三种不同分子量的透明质酸成分为衡量标准的，只含有单一分子量透明质酸成分的护肤品作用有限，并不能发挥透明质酸的最佳护肤功效。

2）医药级透明质酸　透明质酸是构成人体细胞间质、眼玻璃体、关节滑液等结缔组织的主要成分，在体内发挥保水、维持细胞外空间、调节渗透压、润滑、促进细胞修复的重要生理功能。

3}和食品级透明质酸。

人体中的透明质酸含量约为15g，在人体的生理活动中发挥着重要作用。

皮肤中的透明质酸含量减少，皮肤的保水功能减弱，显得粗糙并产生皱纹；其它组织和器官中的透明质酸减少，可导致关节炎、动脉硬化、脉搏紊乱和脑萎缩等。

人体中透明质酸的减少会产生早老症。

美容行业透明质酸类可做填充剂注射。

有去皱、丰唇、填充脸部、隆鼻和填充凹痕等美容手术应用透明质酸副作用偶尔出现荨麻疹、皮症瘙痒感，应停药，适当处理。

有时出现疼痛、肿胀，偶尔出现水肿、发红、热感、局部重压感。

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【6】凌沛学,贺艳丽,等玻璃酸钠的临床研究应用进展[J]1中国生化药物杂志,1998,（4）:

20022041

【7】XX百科！

致谢词

在本论文即将完成之际，首先要向我的指导老师王玉刚老师表达我最真挚的感恩之情！

在论文的写作过程中，王老师给了我很多宝贵的建议和修改意见，才使我的论文更加规范，最后顺利完成。

王老师学识渊博，治学严谨，给我做了很好的学习榜样。

平易近人，热情关怀的风格让我能更好的学习交流。

再次向老师表示感谢。

其次还要感谢三年来培养我的任课老师们，是他们的传道、授业、解惑才让我学到了知识，学到了做人，学到了很多很多。

还有，要感谢我的同窗舍友们，在写论文中相互交流，相互切磋，给了我很大帮助。

最后还要感谢各位评委老师能抽出时间接受我的答辩，谢谢！

修改意见一：

1、选题方向比较新颖。

只是题目主题不是很明确，是不是可以更具体些，比如“透明质酸提取工艺研究”，把提取作为主题思想。

然后把结构、性质、用途作为辅助内容。

2、需要补充一些相关的参考文献。

3、字体格式需要进一步排一下版，里面带着很多粘贴的网络格式。

4、内容可以进一步充实，字数偏少。

有些重要地方比如提取方法可以加以更加详细的介绍。

修改意见二：

1、题目改为工艺比较合适“透明质酸提取工艺研究”。

2、基本内容还可以，只是需要从头至尾理一遍，将前后的逻辑关系理清，另外，正文中有些内容罗列的情况比较明显，应通过一些过度句子联系起来。

3、最后在参考文献后加上一段致谢。