原发性肝癌的分子诊断精.docx
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原发性肝癌的分子诊断精
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2011-05-
18△
通讯作者,E-mail:
dongliangcang
5856@163.com。
原发性肝癌的分子诊断
董良仓1综述,柴 丽△审校（1.河北省三河市燕达国际医院检验科 065201;2.
河南省通许县人民医院检验科 475400
【关键词】 肝癌; 诊断; 分子
DOI:
10.3969/j
.issn.1672-9455.2012.01.033文献标志码:
A
文章编号:
1672-9455（201201-0060-
03 全世界每年新发现的恶性肿瘤患者约6
35万例,肝癌26万例,其中42.5%发生在中国。
肝脏原发肿瘤中90%以上为恶性肿瘤,而原发性肝癌的发病率居肝脏恶性肿瘤之首,是我国常见的恶性肿瘤之一,其死亡率在消化道肿瘤中占第3位,仅次于胃癌与食管癌。
近年来,随着分子生物学、细胞生物学和人类基因组学、蛋白质组学等基础学科向癌症研究领域的延伸,
肝癌分子诊断的研究取得了长足的进展,下面简单介绍一下肝癌相关的分子诊断方法和分子诊断要点。
1 基因相关检测1.1 癌症相关基因的检测 癌症相关基因传统上分为癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因。
在这些基因中有代表性的基因如P21、P53、表皮生长因子受体、nm23、
热休克蛋白70等,
这些基因有的直接介导癌症的发生、发展[1]
有的可以分泌蛋白,作为癌症的促进或抑制因子,有的是作为“伴侣蛋白”介导癌蛋白构象成熟,影响信号转导,参与肝细胞的恶性转化。
目前对这类基因的分子诊断方法很多,可采用单链构象多态性分析（PCR-SSCP、核酸杂交技术、DNA测序、等位基因特异性寡核苷酸（PCR-ASO
等方法进行,也可采用各种印记方法进行相关检测[
2]
。
1.2 基因甲基化的检测 DNA甲基化能引起染色质结构、
DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达。
DNA的甲基化对维持染色体的结构、染色体的失活、基因印记和肿瘤的发生、发展都起着重要的作用。
DNA甲基化是一种表观遗传修饰,它是由DNA甲基转
移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶的一种反应,在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。
CG二核苷酸是最主要的甲基化位点,它在基因组中呈不均匀分布,存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域,在哺乳动物中5-甲基胞嘧啶约占C总量
的2%~7%[
3]
。
检测基因甲基化的技术主要有SssⅠ甲基转移酶转移分析法,免疫抗体分析技术,甲基化敏感随机扩增PCR技术
（MSP,高效液相层析,探针杂交法,DNA微阵列法等。
有学者采用MSP研究肝癌患者92个基因的甲基化谱,发现32个基因甲基化频率发生了改变。
其中肝癌早期相关基因有硫酸软骨素蛋白多糖（CSPG2、OXCT、周期蛋白（cyclinA1、Ras相关区域家族1A（RASSF1A等14个,肝癌晚期相关基因有DBCCR1、PENK、IRF7、GSPT1等9个。
部分甲基化基
因可能成为肝细胞癌诊断的潜在分子[
4]
。
1.3 相关病毒的基因检测 大量研究发现,
肝癌的发生与乙型肝炎病毒（HBV、丙型肝炎病毒（HCV等病毒的感染息息相关,相当一部分的肝癌都是由这些病毒感染发展而来,利用分子诊断的方法如核酸杂交、PCR、基因芯片等技术检测这些肿瘤相关病毒的基因,也可以为肿瘤的诊断提供参考依据。
HBV的分子诊断方法目前主要是以PCR为主,
可采用普通PCR、套式PCR、荧光定量PCR、竞争性PCR、免疫杂交PCR等进行HBV DNA检测。
HCV一般是以检测HCV RNA为主。
2 肝癌相关标志物的检测
肿瘤相关标志物可分为两大类,即血清肿瘤标志物和细胞肿瘤标志物,
血清标志物包括癌胚抗原类、酶类、激素类、糖蛋白类,常见的肝癌的血清标志物有甲胎蛋白（AFP、γ-谷氨酰
基转移酶（GGT、糖链抗原125（CA125等。
细胞肿瘤标志物主要包括癌基因类和细胞表面抗原类两大类。
这类物质在正常组织和良性疾病时几乎不产生或产量甚微,它反映了肿瘤的发生、发展过程及肿瘤相关基因的激活或失活程度,可在肿瘤患者组织、体液、排泄物中检测出来。
此外,在肿瘤的发生、发展过程中,某些因子特异性低,但是与肿瘤的发展相关,也可用
·06·检验医学与临床2012年1月第9卷第1期LabMedClin,Januar2012,Vol.9,No.1
作肿瘤的诊断[5]。
2.1 血清学水平上肝癌的诊断标志物 血清学水平肿瘤标志物的检测方法,除传统的放射免疫分析（RIA和酶联免疫分析（ELISA外,目前在国内主要有三类全自动免疫化学分析系统（化学发光免疫分析系统、荧光免疫分析系统和电化学发光免疫分析系统广泛应用于临床,可检测AFP、CEA、CA19-9、CA72-4、CA125、CA15-3、NSE、Cyfra21-1、PSA、f-PSA等血清肿瘤标记物。
AFP现已广泛应用于肝细胞癌的普查、诊断、判断治疗效果、预测复发。
肝细胞癌AFP阳性率为70%~90%。
在生殖腺胚胎瘤、少数转移性肿瘤如胃癌以及孕妇、肝炎、肝硬化等AFP可呈假阳性,但升高不如肝癌明显。
AFP浓度通常与肝癌大小呈正相关。
在排除妊娠、肝炎和生殖腺胚胎瘤的基础上,AFP检查诊断肝细胞癌的标准:
（1AFP>500μg/L持续4周;（2AFP由低浓度持续升高不降;（3AFP在200μg/L以上的中等水平持续8周。
采用亲和层析微柱法测定肝癌特异性AFP（HS-AFP,当其临界值定位15%时,其敏感性和特异性均较高;HS-AFP对较小的早期肝癌也有诊断价值,是HCC早期诊断的潜在分子[2]。
硫酸肝素蛋白多糖3（Glypican-3,GPC3是近年来备受关注的一种肝癌相关分子,GPC3位于细胞膜表面,在细胞生长发育的过程中起重要作用。
GPC3是作为一种配体,受体或者其他蛋白,参与一个功能复杂的调节过程。
在直径小于3cm的小肝癌患者中,GPC3的敏感性明显高于AFP,GPC3在AFP阴性的肝癌患者中表达可以达到90%以上。
肝癌的复发癌组织的GPC3阳性率高达91.3%,GPC3蛋白阳性与肝癌复发两者之间有一定的关联。
从蛋白水平上来看,GPC3与肝癌分级及侵袭相关,GPC3蛋白在肝癌组织及血清中的表达具有相对特异性,其表达与AFP的表达不相关,特别是对小肝细胞癌患者及AFP阴性肝癌患者具有重要的诊断意义,其表达水平与肝癌的临床分期、病理分级、肝硬化程度有关,提示对预测肿瘤的恶性程度、病情轻重及预后具有重要价值[2]。
血清可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1在某种情况下可比AFP更敏感地提示原发性肝癌,在原发性肝癌检测中有不可忽视的辅助诊断价值。
对于临床上疑似原发性肝癌的患者,若AFP表达为阴性或弱阳难以确诊时,血清sICAM-1动态检测水平含量持续1 000mg/mL以上时,可作为重要的辅助诊断指标[2]。
而且血清sICAM-1动态检测还在一定程度上可以反映肝癌肿瘤细胞集体逃逸免疫监视的能力,可作为判断原发性肝癌进展程度、疗效评价和检测病情变化的一项血清学指标[5],在临床上不可忽视。
另外,最新研究发现血清的转录因子对小RNA-194的作用,对肝癌的发展也起到非常重要的作用,血清转录因子作用于小RNA-194,而RNA-194又作用于内源性fzd-6因子,fzd-6对WNTS分子起直接作用,从而引导肝癌的发生、发展[6]。
有学者提倡对WNT分子和WNT分子受体的直接治疗可以对疾病的治疗和预后提供帮助[7]。
2.2 组织学水平的标志物检测 组织学水平的标志物检测主要有免疫组化和原位分子杂交组化技术。
它将免疫学技术和分子生物学技术同组织病理学制片方法巧妙结合在一起,在组织细胞原位显示某些化学成分和特定基因片段。
从细胞学水平来分析主要是流式细胞术,是利用流式细胞术对细胞和细胞器的结构和某些功能进行定量检测,并利用细胞表面特异性标志对特定细胞亚群进行分析和分选的先进技术方法。
检测白血病和淋巴瘤标记物（CD系列利于诊断和鉴别诊断[8-9]。
国内外多用RT-PCR检测外周血中的肿瘤细胞的主要标记基因有AFP mRNA,用于肝细胞癌微转移的检测。
同时,生物芯片技术最近几年的发展也很迅速,各种基因芯片、蛋白芯片、组织芯片层出不穷,为各种基因水平上的肿瘤标志物的检测提供了理想的工具。
从基因调控机制来看,AFP基因被激活后多数转录AFPmRNA,并翻译AFP,血AFP阳性。
在排除包括生殖器肿瘤在内的其他有关因素干扰的前提下,只要在外周血中检测到AFP mRNA,就能肯定肝癌细胞在原发部位已经突破血管壁并侵袭到外周血中。
外周血癌细胞中AFP mRNA的出现与肝癌转移、门静脉癌栓形成密切相关。
肝内转移与门静脉癌栓形成均表明HCC已经侵袭到了血循环,因此认为,外周血AFP mRNA是肝癌细胞存在于外周血的直接证据,是肝癌发生血管浸润并形成或可能形成转移的重要标志。
在肝癌的发生过程中,GPC3无论在基因水平还是在蛋白水平都是过度表达的。
应用差异显示技术,Hsu等发现了MXR7基因（cDNA100%同源于GPC3在肝癌组织中有异常表达。
近年来多项研究表明,在肝癌组织中74.8%能检测到了MXR7的mRNA,而在癌旁“非瘤”肝组织中仅3.2%为阳性,早期或Ⅰ期肝细胞癌手术切除进行免疫组织化学染色发现,GPC3的敏感性和特异性分别为69%和91%。
通过RT-PCR对肝癌相关基因进行筛选,也发现在原发性肝癌组织中,GPC3基因表达上调18倍[10]。
肝GGT mRNA变化与总RNA相平行,与肝细胞癌变呈正相关,癌组织GGT表达接近胎肝GGT水平。
人肝癌组织中端粒酶逆转录酶（hTERT基因高表达与肝癌发生关系密切。
肝癌细胞中端粒明显缩短,提示癌细胞在端粒激活及端粒长度稳定前已经历了若干次分裂。
端粒酶活性随着肝癌发生、发展呈进行升高的趋势。
肝癌组织中hTERT基因及GGTmRNA H亚型表达,与肝癌发生关系密切[11]。
肝癌组织端粒酶逆转录酶、GGT mRNA H亚型联合分析可弥补AFP的不足,对肝癌具有早期诊断价值。
有学者发现肝癌组清蛋白（AlbmRNA阳性明显高于肝硬化组和慢性肝炎租,而且随着临床分期的加重,肿瘤发生肝内、外转移时,其阳性率显著提高。
在肝细胞癌变时,肝细胞表达清蛋白也发生改变:
Alb mRNA与肝癌进展和转移之间可能有一定关系,但在肝组织有坏死的情况下,特别是急性肝炎时外周血Alb mRNA常为阳性,可能来自脱落入血循环的正常肝细胞。
联合检测AFP mRNA和Alb mRNA可以提高肝癌诊断的灵敏度[12]。
癌症的发生、发展过程是一个多基因、多蛋白的一个复杂过程,是各种基因相互促进、相互抑制,各种蛋白相互辅助的、功能复杂的渐进过程,如果只是单独的从一个单一的基因或者蛋白去了解这个过程是不全面的,也容易造成癌症的误诊或漏诊,需要从多角度、多方面综合考虑。
目前,对于肝癌诊断方面的专家都极力倡导运用多个肿瘤相关指标联合检测,以提高癌症的检出率,经过多次试验证明,多指标连续检测确实行之有效,显著提高诊断效率,降低漏检概率。
有学者就研究了GPC3与WNT、基质金属蛋白酶（MMPs、SULF1、SULF2和一些其他的生长信号分子,发现在肝癌的细胞水平,GPC3的表达与MMP14、ERBB2、FGFR3和FGFR4的表达关系密切;从组织水平上来分析,GPC3的表达与MMP2、纤维生长因子（FGF2、成纤维细胞生长因子受体（FGFR1、FGFR2、SULF1和SULF2有着不可分割的关系。
GPC3、E2F1表达从肝炎组到肝硬化、肝细胞癌组呈递增趋势,肝细胞生长因子（HGF、·16·
检验医学与临床2012年1月第9卷第1期LabMedClin,Januar2012,Vol.9,No.1
CLDN10在肝硬化组表达量升高,而在肝细胞癌组明显下降,PTEN、PRDM2、MGMT从肝炎组到肝硬化、肝细胞癌组呈递减趋势;GPC3、E2F1、MMP2表达从癌旁到癌呈递增趋势,CLDN10、HGF、PTEN、DLC1、PRDM2、MGMT表达从癌旁到癌呈递减趋势[13]。
Schwegler等[14]分析了使用表面增强激光解吸/离子化-飞行时间质谱联合检测AFP、DCP及GPC3诊断肝癌的价值。
在170例肝脏疾病患者标本中,使用38个蛋白组指纹鉴别诊断肝炎和肝硬化的敏感性和特异性分别为61%和76%,联合检测这些蛋白指纹和AFP、DCP和GPC3时,敏感性和特异性分别提高到75%和92%[15]。
其他研究比较多的肝癌的诊断指标还有许多,如醛糖还原酶（AR与醛糖还原酶相似蛋白（ARL-1、铁蛋白（Ferritin及酸性同工铁蛋白,α-L-岩藻糖苷素（AFU及血与尿中的代谢产物等。
单用AFP容易造成疾病的误诊和漏诊,一些肿瘤标志物敏感性优于或互补于AFP,与其联合检测可以减少漏诊。
如AFP联合GPC3。
一些肿瘤标志物特异性优于AFP,与其联合检测可以降低误诊率,如AFP联合AFP-L3[14]。
同时随着人类基因组学的完成,蛋白质组学的不断发展,新技术的不断成熟,新标志物的不断出现,相信在不久的将来,对很多的癌症都能够在癌前期有一个明确的诊断,对癌症的早发现、早治疗能够提供一个很好的帮助。
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