酵母发酵酒精的研究应用进展.docx

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酵母发酵酒精的研究应用进展

酵母发酵酒精研究进展

（生命科学与技术学院微生物专业）

前言

人类运用酵母菌历史已有几千年了。

值得提出来是，早在国内宋代酿酒著作中，中华人民共和国人已经明确记载了从发酵旺盛酿酒缸内液体表面撇取酵母菌（固然不是纯粹酵母菌）办法，并把它们称为“酵”，风干后来制成“干酵”可以长期保存。

这种制造干酵母原始办法阐明，早在8前，中华人民共和国人已经意识到酒精发酵是由“酵”，即某种能生长物质引起。

这种推断直到19世纪巴斯德才证明是酵母菌。

明代末年出版词书中记载有“以酒母起面曰发酵”，“发酵，浮起者是也”等解释。

这阐明至少在那时，一引起细心观测自然现象和注意比较学者，已经结识到发面和酿酒有某种相似因素在起作用。

当时在欧洲虽然已经发现了酵母菌，但在2后才懂得酵母菌作用。

今天咱们把此类微生物称酵母菌，正是以此为依照。

酵母菌可以把糖变成酒精，是由于它细胞里有催化剂，这些存在于生物细胞催化剂在科学上叫做酶。

虽然当前懂得所有生物都是靠酶催化化学反映来生活，但最早发现酶，就是酵母菌酶。

酵母菌中最早发现酶，是把糖变成酒精一群酶，当时自然数酒化酶。

由于这种酶作用，使糖分解成酒精和二氧化碳，这就是运用酵母菌酿酒和发面包原理。

使面团产生许多空隙就是二氧化碳。

酵母细胞大小为2.5-10μm×4.5-21μm，在加盖玉米琼脂上不产生假菌丝或有不典型假菌丝，营养细胞可直接变为子囊，每囊有1-4个圆形光面子囊孢子，在麦芽汁25℃培养3d，细胞为圆形、卵形、椭圆形和香肠形。

其菌落在麦芽汁琼脂上为乳白色，有光泽，平坦，边沿整洁。

菌体维生素、蛋白质含量高，既可食用又可提取细胞色素C、核酸、麦角固醇、谷胱甘肽、凝血质、辅酶A、三磷酸腺苷等。

该菌种能发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖及蔗糖，但不能发酵乳糖和蜜二糖，不同化硝酸盐。

酵母菌繁殖方式既可进行无性繁殖，如芽殖，又可进行有性生殖；酵母菌既可进行有氧呼吸，又可进行无氧呼吸，是一种兼性厌氧呼吸真核微生物。

单细胞真核生物酿酒酵母基因组为12,068kb，比单细胞原核生物和古细菌大一种数量级。

酿酒酵母基因组共有5887个ORF，这比原核生物和古细菌要多诸多。

酿酒酵母基因密度为1个基因/2kb，密度不大于原核生物流感嗜血杆菌和尿殖道支原体等。

酿酒酵母是最小真核基因组，裂殖酵母另一方面，其密度是1/2.3kb，简朴多细胞生物线虫基因密度为1/30kb。

第二、酿酒酵母只有4%编码基因有内含子，而裂殖酵母则有40%编码基因有内含子。

1、酵母生长条件

1.1无机盐

无机盐类是微生物生命活动不可缺少物质，其重要功能是参加构成菌体成分、作为酶构成某些，或维持酶活性、调节渗入压等。

王蓬际[8]（）在完全合成培养基条件下,就硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二氨3种无机盐对1株产高浓度酒精酿酒酵母A12（大连轻工业学院菌种保藏室保藏）间歇发酵影响进行了初步研究，得到了不同无机盐浓度与最后酒精浓度之间关系，初步找到了该株酵母所需无机盐临界值：

硫酸镁5g/L；磷酸二氢钾为5g/L（或<5g/L）；磷酸氢二氨为5g/L。

并指出该株酵母发酵时间依然过长。

但对硫酸镁浓度较高时对酵母发酵抑制作用未做进一步研究。

1.2碳源、氮源吸取与运用

氮源是构成菌体物质和某些代谢产物必须营养元素,定性和定量地分析了两种酿酒酵母发酵前期在不同含氧条件下运用和吸取氮源差别，这些差别重要受发酵前期氧和酿酒酵母影响，在后发酵阶段，通过NAD（P）H再氧化释放氨基酸来保持氧化还原平衡。

王蓬际比较了尿素和硫酸铵两种氮源对A12发酵影响，发现硫酸铵比尿素较好，最后酒精浓度可以达到119.9g/L。

1.3碳源、氮源缺少影响

S.cerevisiae与碳源、氮源关系,当前研究重要集中在吸取与运用上，碳源、氮源缺少对S.cerevisiae影响却很少有人研究，ElisabethThomsson等针对碳源、氮源缺少对S.cerevisiae影响进行了持续研究。

年研究显示，缺氮培养后，发酵能力依菌株不同减少70%－95%，缺碳培养后，几乎所有供试菌株都丧失了发酵能力。

年发现碳（非氮）缺少对发酵性能影响取决于缺少培养前生长条件。

而氮缺少培养后所有供试菌均保持了大部份原有发酵能力，与缺少培养前生长条件无关。

氮缺陷型菌株在碳缺少培养后，丧失了大某些发酵能力。

碳缺陷型菌株在碳缺少培养后仍保持大某些发酵能力。

碳缺少培养前葡萄糖含量与碳缺少培养后发酵性能、胞内ATP含量存在互有关而发酵力与葡萄糖吸取率没有有关性。

并指出在工业发酵中，在厌氧条件下为保持酿酒酵母发酵能力强菌株数量，应避免酵母菌株碳源缺少。

2、酵母发酵酒精技术研究进展

2.1混合菌种发酵

葡萄酒老式自然发酵工艺普通采用混合菌种发酵。

朱一松用Debaryomycesvanriji和S.cerevisiae混合培养发酵来生产葡萄酒，发现混合培养比纯培养得到β-葡萄糖苷酶活性更高，发酵后葡萄酒中脂肪酸、酯、萜烯醇等含量更丰富，从而改进了葡萄酒风味。

南阳1308酵母混合发酵能解决酒精产率不高和有机酸等副产物存在问题。

2.2固定化酵母技术

固定化细胞技术是当代生物工程技术重点内容之一,它是运用物理或化学手段将游离细胞定位于限定空间区域，使其保持催化活力，并可重复使用。

当前，已对包埋剂和控制技术参数等获得了一定科研成果。

廖朝晖以陶瓷为载体实验中发现，采用陶瓷固定技术比藻酸钙固定化技术要好，其因素也许是陶瓷载体较重，能保护S.cerevisiae细胞及其生理活性，使S.cerevisiae对糖和酒精体现出较高耐受能力。

空心柱状载体材料比实心球状载体材料速度要快，小颗粒载体速度最快，但影响系数并不是最高。

Mansour对S.cerevisiae中转化酶用硅藻土和聚丙烯酰胺固定研究表白，硅藻土（celite）固定比聚丙烯酰胺固定有更好稳定性。

在最佳温度60℃，最佳pH4.6时，其转化酶活性分别为92%和81%。

并且pH在4.0-6.5和温度40-60℃范畴内，在室温下贮藏90d和重复使用20个批次后仍有特别好稳定性。

侯红萍等采用海藻酸钠包埋法和明胶包埋法，通过对比重复实验，发现用6%明胶-戊二醛为包埋剂固定酿酒酵母和生香酵母办法较好。

固定化最佳办法是：

取40mL6%明胶、1.0g酿酒酵母湿菌体和1.5%生香活性干酵母混合包埋后，再用1.5%戊二醛溶液交联3h。

固定化酵母菌最适糖化发酵时间为9d。

固定化酵母比游离酵母发酵速度快，出酒率提高了2.2%，产酯量提高了20%。

持续使用10个批次后，其机械强度良好，酿酒性能稳定

2.3浓醪酒糟发酵

国内老式发酵法酒精工业已有近一种世纪发展历程，生产上酒精出率已经达到国际先进水平，从生产消耗、能耗及发酵强度方面看仍具备很大潜力；这要以先进工艺为根据。

于1995年终，成功研究“酒精浓醪发酵工艺”具备设备运用率高、能源消耗低和酒糟解决量少等一系列明显长处。

原料经精选、除杂（玉米经脱皮、去胚）后粉碎，通过低温蒸煮（双酶法）液化、糖化和浓醪间歇发酵后，发酵成熟醪中酒精浓度可达14%～16%（v/v）；发酵温度30～37℃，发酵时间在50小时之内，淀粉运用率达90%。

3、新型酵母菌株研究进展

3.1诱变育种

诱变机理是：

碱基置换：

又分为转换和颠换。

DNA链中一种嘌呤被另一种嘌呤或一种嘧啶被一种嘧啶置换称为转换；一种嘌呤被一种嘧啶或一种嘧啶被另一种嘌呤置换称为颠换。

移码突变和染色体畸变。

用于酵母变育种理化因素有：

1、物理诱变剂，如紫外线、γ射线（60Co照射）、X射线、离子束、质子、激光、微波、电磁波、空间辐射等。

2、化学诱变剂。

（1）烷化剂类化合物，如N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（NTG）、二乙基亚硝胺（DEN）、乙基磺酸甲酯（EMS）、重氮甲烷、乙烯亚胺、氮芥等。

（2）碱基类似物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶（5-AU）等。

（3）移码诱变剂：

吖啶黄、吖啶橙等吖啶类化合物。

（4）脱氨基诱变剂：

亚硝酸。

运用诱变育种办法已经筛选到诸各种工业酿酒酵母。

3.2原生质体融合

原生质体融合技术广泛应用于各类微生物遗传育种中，单亲灭活原生质体融合技术最大长处，就是可以省去亲株细胞遗传标记和提高筛选效率，也可通过双亲灭火或抗性筛选办法建立筛选体系。

当前生料发酵仍需添加糖化酶系，构建可降解淀粉直接发酵酒精菌株则可不必添加糖化酶而直接发酵，不但可以缩短工艺过程，并且可以节约设备和投资，增强了市场竞争力。

张华山通过酵母属间融合成功地构建了直接转化淀粉生产燃料酒精新型菌株。

文铁桥通过PEG诱导碘乙酸灭火呼吸缺陷克鲁维酵母原生质体与酿酒酵母原生质体融合，获得45℃发酵产酒率高达8.7%高温酵母菌株。

毛华等人运用原生质体融合技术进行属间融合,得到能发酵木糖产生乙醇酵母菌融合子。

细胞原生质体拆合技术是在细胞融合基本上、结合了基因工程技术而发展起来一项新兴技术。

林炜铁选取具备耐高温（42℃）、耐高酒精度（15％）特性K氏酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）细胞核，与耐高糖（55％）H15蜂蜜酵母（Nectaromycessp．）经紫外线灭活无核原生质体，进行原生质体拆合技术研究，建立一条遗传育种新型途径，为工业微生物育种提供了一种新办法，并构造细胞核转移和真核细胞无核系统实验模型。

3.3外源基因在酵母中表达

国外对糖酵解途进中3个激酶及14个有关基因进行过量表达研究表白对产酒率和酒精耐受性都没有明显变化。

酒糟中存在着某些未能被酵母消耗糖，含量较高如纤维二糖、蜜二糖等，有效运用酒精发酵过程中产生纤维二糖，具备一定理论和实际意义。

采用异硫氰酸胍－酚－氯仿法提取里氏木霉总RNA，分离polyA+mRNA2;通过RT-PCR办法扩增得到葡萄糖苷酶基因。

构建了重组质粒Pyx-BGL，并在酿酒酵母中获得表达，得到转化子能以纤维二糖为唯一碳源生长。

虽然半纤维素多聚体降解比较容易,但其降解产物戊糖（重要是木糖）发酵产生乙醇则要比纤维素降解产物葡萄糖发酵困难得多。

将P.stipitis基因XYL1和基因XYL2克隆于多拷贝载体在酿酒酵母启动子如PGK、ADHI,或在其自身启动子下,均可以在酿酒酵母菌中得到较高酶活表达。

但所构建表达XYL1和XYL2酿酒酵母重组菌株,尚不能发酵木糖产生乙醇,消耗少量木糖重要被还原为木糖醇以及其她副产物。

这被以为是反映平衡常数特点所致,XR酶促反映,木糖+NADPH+H+木糖醇+NADP+平衡常数Keq为5175×109mol/L,XDH酶促反映,木糖醇+NAD+木酮糖+NADH+H+Keq为619×10-11mol/L,表白这两步可逆反映倾向形成木糖醇。

此外,两步反映辅酶（NADPH和NAD+）不能偶联,导致细胞内氧化还原失衡,也是引起木糖醇积累因素之一。

仅仅表达XYL1和XYL2基因尚不能使酿酒酵母重组菌株发酵木糖产生乙醇,推测是木糖到乙醇整个代谢途径上其她环节有障碍。

转酮酶（TKL）和转醛酶（TAL）是PPP途径上核心酶,酿酒酵母菌具有这两种酶,但酶活较低。

转酮酶是构成酶,已从酿酒酵母中克隆得到2个转酮酶基因TKL1和TKL2。

研究成果表白TKL1对木酮糖代谢影响较大。

酿酒酵母转醛酶基因TAL1也已克隆得到。

酿酒酵母菌株在木酮糖上生长时大量积累72磷酸景天庚酮糖,这一成果暗示着转醛酶是酿酒酵母通过PPP途径代谢木酮糖限制因素。

木糖转化为木酮糖另一途径是通过细菌木糖异构酶,该酶一步完毕木糖向木酮糖转化,并且不需要任何辅助因子,因而被以为是构建运用木糖酿酒酵母代谢工程菌株便利途径。

编码该酶基因xylA曾先后从E.coli，Actinoplanesmissouriensis，Bacillussubtilis，和Lactobacilluspentosus克隆得到,上述不同来源xylA基因分别克隆于酿酒酵母菌GAL1、PDC1、PGK1和ADH1启动子下,转化于酿酒酵母菌中,但以上各种来源xylA基因在酿酒酵母菌中均没得到活性表达。

由于Thermusthermophilus木糖异构酶基因xylA在茄科植物细胞中得到表达,本课题组采用PCR技术从该菌克隆得到xylA基因。

转化酿酒酵母,初次成功地在酿酒酵母中得到木糖异构酶活性表达。

为了使木糖代谢流向乙醇形成方向,在酵母转化子中又引入磷酸戊糖途径中转酮酶基因TKL及转醛酶基因TAL1,同步表达xylA和超表达TAL1基因、TKL1基因酿酒酵母工程菌株可以在木糖为唯一碳源平板上生长;摇瓶发酵实验成果表白,该工程菌株可以发酵木糖形成113g/L乙醇。

这一成果表白在酿酒酵母菌中建立了一条新木糖代谢途径。

3.4基因敲处

CreP-loxP系统共转化法可用来敲除抑制乙醇生物合成基因,同步也可用于过量表达增进乙醇生物合成有关基因，进一步提高乙醇产量。

乙醇脱氢酶是酿酒酵母乙醇代谢分解核心酶。

敲除编码乙醇脱氢酶基因可有效地减少酵母乙醇分解代谢活性,提高酵母细胞合成乙醇能力。

以PCR为基本基因敲除办法,特别是loxP-Marker-loxP序列组件和CreP-loxP系统精确易行,已被广泛应用于酵母功能基因分析。

黄建忠等通过敲除sfa1基因提高酿酒酵母乙醇合成能力。

周建中档采用醋酸锂转化法,将一段目基因转入到酵母体内,破坏酵母PEP4基因表达。

通过对目基因扩增和羧肽酶Y酶活检测验证基因敲除状况,并通过传代抗性实验与传代发酵稳定性实验验证突变株遗传稳定性良好。

3.5代谢合成网络调控和重建

全转录工程办法（globaltranscriptionmachineryengineering,gTME）是依照转录水平调控全局性进行生物生理表型改造办法。

由于细胞大某些表

型是受各种基因控制,要想得到某一特定表型必要同步对各种基因进行修饰,这在诸多状况下是难以完毕,因而转录水平调控可以有效地得到需要表型。

该办法普通通过变化几种影响全局转录核心蛋白（经由“易错PCR”）来导致多基因转录水平变化,进而通过筛选可得到带有目表型突变株,然后通过比较出发菌株和突变菌株转录谱可望得到与该表型有关基因。

针对生物乙醇研究中面临乙醇和葡萄糖耐受性这一问题,Alper等运用gTME办法,通过易错PCR变化酵母中调节启动子特异性重要DNA结合蛋白spt15p和TAF25编码基因,构建了两个gTME突变文库,运用选取压力从中筛选出乙醇和葡萄糖耐受性提高突变菌株spt15-300。

比较转录谱研究显示,在非选取压力下,spt15-300中有好几百个基因表达水平同出发菌株不同,敲除其中14个表达量最高基因中任何一种都会导致菌株耐受性减少,并且将其中表达量最高3个基因分别在对照菌株中过量表达都不会导致菌株耐受性提高。

在原核生物大肠杆菌中,Alper等运用gTME办法对影响RNA聚合酶同启动子结合能力σ因子编码基因rpoD进行突变,分别得到了乙醇耐受性提高。

4结论及展望

近来工业微生物技术针对老式微生物催化工业中核心技术和热点问题,展开了更为细致和详细研究,成为酒精工业发展直接推动力。

同步,基因组及代谢网络等基本研究在生物工艺方面应用,使工业微生物技术从基因水平出发,在更多微生物资源中寻找催化合成工具,在更深层次上探讨催化调控办法,呈现出空前辽阔发展前景。

参照文献

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