生物化学实验 1.docx
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生物化学实验1
定量吸（移）液器（微量加样器）：
定量吸液器的优点：
使用方便;取、加样迅速;计量准确;不易破损;能吸取多种样品。
定量吸液器的类型：
1.固定式：
只能取加一定容量的试剂，不能随意调节取加样量。
规格有:
10μl、20μl、25μl、30μl、50μl、100μl、200μl、250μl、300μl、400μl、500μl、1000μl等。
2.可调式：
在一定容量范围内可根据需要进行调节取加样量。
固定式吸液器比较准确，可调式吸液器使用较为方便。
规格为:
0.5-10μl,2-20μl,20-200μl,100-1000μl,1000-5000μl
定量吸液器的使用方法：
1.
选择适当的吸液器。
吸液前先把吸嘴套在吸引管上，套上后要轻轻旋紧一下，以保证结合严密。
2.
持法：
右手四指并拢握住吸液器外壳，大拇指轻轻放在吸液器的按钮上。
3.
取样（吸液）：
用大拇指按下按钮到第一停止点，以排出一定容量的空气，随后把吸嘴尖浸入取样液内，徐徐松开大拇指，让按钮慢慢自行复原，取样即告完成。
4.
排液：
将吸液器的吸嘴尖置于加样容器壁上，用大拇指慢慢地将按钮按下到第一停止点，停留1秒钟。
然后再把按钮按到第二停
蛋白质定量方法与原理
1.紫外分光光度法：
原理：
蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
优点:
简单快速、不消耗样品、低浓度盐无干扰;缺点:
准确度差,受核酸影响。
光谱法的基础：
物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，这就是光谱法的基础
标准曲线法
取标准品配成一系列已知浓度的标准溶液，在选定波长处（通常为λmax），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图，得到一通过坐标原点的直线－标准曲线（工作曲线）。
理想的标准曲线：
至少5个点；2个以上重复值；重复值误差小于5%；点与线的垂直距总和最小；注意：
标准曲线不能任意延长！
理想标准曲线的特点：
过原点的直线;斜率为1；浓度为待测物质浓度的一半～二倍；A在0.05～1.0之间；
2.Folin—酚试剂法（Lowry法）
利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂起蓝色反应。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。
即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。
第一步：
碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质－铜复合物。
第二步：
蛋白质－铜复合物使磷钨酸—磷钼酸还原
优点:
操作简便灵敏度高（25-250μg）.缺点:
费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线不是严格的直线形式，专一性较差，干扰物质较多.
Folin—酚试剂法可检测的最低蛋白质量达5µg/ml，通常测定范围是25~250µg/ml
标准蛋白浓度=标准液（mL）×标准液浓度（250ug/ml）。
根据待测样品的读数查找标准曲线求得蛋白质浓度。
取待测样品稀释，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
样品:
健康人血清。
试剂：
1、牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）2、碱性硫酸铜溶液（当日有效）3、Folin-酚试剂。
仪器和器材：
1、V-1100分光光度计；2、恒温水浴箱；3、试管6支、试管架；4、加样枪、加样枪架；5、坐标纸
注意事项：
1.Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。
2.因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。
3.凯氏微量定氮法
原理：
含氮有机物与浓硫酸共热，有机物中所含氮转变成氨，并与硫酸结合为硫酸氢铵和硫酸铵，用氢氧化钠碱化后，释出氨，随水蒸馏出，用硼酸溶液或定量的酸吸收后，用标准酸液或标准碱液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。
组成：
由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成
方法：
经典,准确，但操作复杂。
4.双缩脲法
原理:
双缩脲在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。
因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律。
优点:
快速、受蛋白质特异性影响小、使用于大量蛋白质测定。
缺点:
灵敏度低,1-10mg。
5.考马氏亮蓝法
原理:
G250染料在酸性溶液中与蛋白质的疏水微区结合，溶液的颜色由棕黑转为蓝色，当它与蛋白质结合成复合物时,其最大吸收峰在595nm。
在一定的蛋白浓度范围内，A595与蛋白浓度成正比。
优点:
操作简便快速、干扰因素少、灵敏度高50μg以下;但＞50μg曲线弯曲。
蛋白质分离技术
盐析实验原理:
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”也是蛋白质分离纯化过程的常用方法。
蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：
水化膜和电荷。
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。
如球蛋白在半饱和（NH4）2SO4溶液中析出，而白蛋白（清蛋白）则需在饱和（NH4）2SO4溶液中才能沉淀。
蛋白质在盐析沉淀分离后，需将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析。
此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
蛋白质盐析常用的中性盐主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的是硫酸铵（NH4）2SO4.
实验操作
1.盐析
2.透析:
1.制备透析袋;2.装样：
取透析袋，将一端固定，由开口端加入含有硫酸铵的蛋白沉淀。
3.透析：
取10倍以上蛋白质体积的去离子水，将装好样品的透析袋悬于大烧杯中部。
更换洗脱溶液数次（约30min一次），至达到透析平衡为止。
4.检查：
检查洗出液中是否有NH4＋
层析的分类：
1.分配层析:
溶质在互不相溶的两相中溶解度不同，在终点时达到一种平衡，其比值为一个常数，即分配系数（α）。
2.离子交换层析:
离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
3.吸附层析:
利用吸附剂对混合试样各组分吸附力不同而使各组分分离。
4.亲和层析:
是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。
5.凝胶层析（凝胶过滤）
凝胶层析：
操作方式：
凝胶过滤，固定相：
固体，流动相：
液体，分离依据：
分子大小
凝胶层析原理：
又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢；所以最后流出。
凝胶层析分类：
1.天然凝胶：
琼脂糖凝胶;2.人工合成凝胶：
葡聚糖凝胶，葡聚糖凝胶离子交换剂，聚丙烯酰胺凝胶
3.
葡聚糖凝胶-G值：
调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。
葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值也越小。
G值表示每克干胶吸水量（mL）的十倍。
例如SephadexG-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。
常用的葡聚糖凝胶有8种型号G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、G-200。
凝胶过滤-应用：
1.生物大分子的纯化、2.分子量测定、3.脱盐及去除小分子杂质、4.去热源物质、5.溶液的浓缩
凝胶层析法分离蛋白质-操作：
1.凝胶的制备与装柱：
向层析柱内加蒸馏水赶走在层析柱的死体积和接口处的气泡，在蒸馏水高度约占体积的1/3时，关闭下端出口，自顶部缓缓加入已处理好的SephadexG-50悬液，待底部凝胶沉积1~2cm时，打开出口，凝胶加至凝胶沉积离层析柱口约3cm后，用3～5倍体积洗脱缓冲液平衡。
装柱注意点：
不得有气泡和分层；凝胶表面应平整；柱床体积稳定；不能让凝胶表面露出水面。
2-加样：
将出口打开，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关紧出口，用滴管将样品缓缓地加到床表面，注意尽量不要使平整的床表面搅动，然后打开出口，让样品进入床内，直至床面恰好露出，用洗脱液洗涤。
3-洗脱：
洗脱时要控制流速为4m1/3min。
观察Hb和核黄素（B2）的分离。
4-凝胶的回收：
用蒸馏水洗涤凝胶层析柱10分钟即可。
取下层析柱，将上下口打开，从上口处用吸耳球一吹胶即可从下口流出，凝胶可以灭菌保存，干燥保存，和防腐剂保存。
凝胶层析法分离蛋白质有血红蛋白（Hb）和核黄素。
血红蛋白的制备过程:
取草酸钾抗凝血1ml于离心管中离心（3000rpm）5分钟，弃去上层血浆,加10ml0.9％的氯化钠（NaCl）与血细胞充分混,再离心,并弃去上清液,再加0.9％的氯化钠,反复洗涤血细胞2~3次。
然后,血细胞用5倍体积蒸馏水稀释,用滤纸过滤或用离心法除去细胞碎片,即为血红蛋白稀释液
酶学实验
影响酶作用的因素:
酶是活细胞内产生的对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质，是机体内催化各种代谢反应最主要的催化剂。
实验原理:
酶的化学本质是蛋白质，所以对周围环境变化十分敏感：
高温、紫外线、重金属盐（Hg）等均可使酶蛋白变性，甚至失活。
影响酶的活力的因素：
温度,pH,底物浓度,激活剂、抑制剂
1.温度对酶促反应速度的影响:
在酶允许的温度范围内，温度每提高10℃，反应速度增加一倍;一般酶反应最适温度介于35-45℃之间（绝大多数为37-39℃之间）。
2.pH对酶促反应速度的影响：
①改变底物的解离状态，影响底物对酶的亲和力；②改变酶蛋白中某些关键氨基酸的解离状态，从而影响酶活力；③影响酶蛋白三维空间的构象状态，过酸或过碱均可使酶变性。
3.抑制剂对反应速度的影响：
凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称做酶的抑制剂。
抑制剂对酶有一定的选择性,引起变性的因素对酶没有选择性
4.激活剂对酶促反应速度的影响：
凡能提高酶活力的物质都称为激活剂。
大部分为无机离子和简单的有机化合物。
必需激活剂,非必需激活剂
酶的最适pH：
只有在特定的pH条件下，酶、底物和辅酶的解离状况，最适宜于它们的结合并发生催化作用，才能使酶反应速度达最大值。
这个pH值称为酶的最适pH。
酶活性测定：
通过产物的生成量和底物的消耗量,确定酶活性.
本次实验观察:
唾液淀粉酶:
pH6.8;T37度;激活剂cl-;抑制剂cu+
操作：
1.收集唾液；2.取试管编号
注意事项：
管迅速放入冰浴；淀粉不要加在试管壁上；碘液多加2滴
血清甘油三酯测定
正庚烷一异丙醇混合溶剂抽提后，用氢氧化钾溶液皂化成甘油，并进一步用过碘酸氧化成甲醛，在NH4＋的存入下，甲醛与乙酰丙酮反应生成3,5—二乙酰—1,4—二氢二甲基吡啶，后者为带荧光的黄色物质。
与同样处理的标准液比色计算，即得血清中甘油三酯的含量。
实验原理：
1.抽提:
正庚烷一异丙醇；2.皂化；3.显色；4.比色计算
（测定管吸光度/标准管吸光度）×0.2×100/0.2=mg%
光吸收基本定律:
Lamber-Beer定律
朗伯定律-吸光度与液层厚度的关系。
当入射光的（,吸光物质的c一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.
比尔定律-吸光度与溶液中吸光物质浓度的关系。
当入射光的（,液层厚度b一定时,溶液的吸光度A与吸光物质的c成正比.
标准对照法：
先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液，在λmax处测出吸光度A标，在相同条件下测出试样溶液的吸光度A测，则试样溶液浓度c测可按下式求得：
C测=A测/A标
C测=待测样品浓度;C标=标准溶液浓度;A测=待测样品吸光度;A标=标准溶液吸光度
操作
1.抽提：
取3只小试管，依次加入蒸馏水、标准液、样品，抽提剂及硫酸，边加边摇，用力振摇10min，静置10min分层。
2.皂化：
吸取上层液体0.3ml，加入对应的3只大试管中，加入正庚烷-异丙醇
、皂化试剂，充分混匀，56℃，5min。
3.氧化显色：
加入显色剂，混匀56℃，5min。
4.比色：
取出试管，冷却，测420nm的吸光度，分别比色。
注意事项：
提取时,充分震荡,吸量上层液时注意不要吸到到下层液;每一步骤均应混匀,保温时间要准确;试管与比色杯不应有水,因为该反应体系为有机溶剂环境。
电泳：
带电粒子在电场中向相反电极移动的现象。
电泳分离法的依据：
荷电性及大小不同→泳动速度不同→不同的区带或斑点
电泳分类
1.按支持物：
滤纸及其它纤维电泳；凝胶电泳
2.按支持物的装置形式：
水平式；垂直式
电泳的基本原理
原理：
不同的带电颗粒在同一电场中泳动速度，主要与其所带净电荷量，分子量及分子形状有关。
pH>pI分子带负电荷,在电场中向正极移动;pH在同一电泳条件下，不同的物质因其分子大小（r）和带电量（Q）的差异而具有不同的泳动速度，因此，电泳一定的时间（t）就可互相分离。
影响因素
1.待分离大分子的性质：
所带的电荷、分子大小和形状。
分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
2.电场强度：
：
过高，产热，蛋白变性导致不能分离；缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。
过低，电泳时间增加，扩散。
当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。
3.电渗：
在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。
4.支持介质的筛孔：
筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。
5.缓冲液pH和离子强度：
pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层，降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。
一般离子强度为0.02～0.2之间。
常用的染料：
①基黑10B（aminoblack10B）；②考马斯亮兰（CoomassiebrilliantblneR250，G250）。
两种染料的共同点是：
带有负电荷的磺酸基，能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。
但是，氨基黑分子含有较多的亲水基团，和蛋白质亲水微区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。
而考马斯亮兰却相反，含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力。
③1-苯胺基-8-萘磺酸：
本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。
醋酸纤维薄膜电泳：
采用醋酸纤维薄膜为支持物的电泳方法，叫做醋酸纤维素薄膜电泳。
醋酸纤维素，是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。
原理：
血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。
标本：
血清
操作：
1.薄膜准备与浸泡2.点样：
少，轻，直，匀；3.电泳；4.染色（氨基黑10B），脱色
聚丙烯酰胺凝胶电泳
PAGE：
聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。
以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。
PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。
聚丙烯酰胺凝胶特点：
1.机械性能好；2.稳定；3.无电渗；4.灵敏（可达10-6g）；5.分辨率高；6.孔径可调
PAGE的分为类：
1.连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
2.不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
聚丙烯酰胺凝胶的聚合：
单体：
丙稀酰胺（Acr）；交联剂：
甲叉双丙稀酰胺交联剂（Bis）；催化剂：
聚合形成的三维网状结构。
催化剂
1.过硫酸铵-TEMED系统。
碱性条件下催化作用；温度与聚合快慢成正比
2.核黄素-TEMED系统。
光激发的催化反；应用量少，对分析样品无影响；聚合时间可自由控制
聚丙烯酰胺凝胶浓度（T）与交联度（C）：
凝胶越浓T↑C↑，凝胶孔径↓，所受阻力↑，机械强度↑
丙稀酰胺浓度：
4％；7－7.5％；15－30％；T=a+b/m×100%
分离物质分子量：
大于100万；1－100万；小于1万；C=b/A+b
a=Acr；b=Bis；m=缓冲液体积
PAG机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，改变Acr浓度或Acr与Bis的比例可以得到不同孔径的凝胶。
缓冲系统的选择
1.pH、离子种类和离子强度：
1.酸性蛋白质：
高pH；2.碱性蛋白质：
低pH
2.连续和不连续系统：
1.电泳槽中的缓冲系统和pH与凝胶相；2.电泳槽中的缓冲系统和pH与凝胶相同，分辨率高。
SDS-PAGE基本原理
SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以破坏蛋白质的四级结构。
使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。
解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。
蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。
而与其所带电荷的性质无关。
由于该电泳应用的是一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，这样就形成不连续pH梯度和不同的离子强度。
样品被压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
采用考马斯亮蓝快速染色，可及时观察电泳分离效果
聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续性
1.凝胶层的不连续性：
浓缩胶T=5％分离胶T=12％
2.缓冲液成分的不连续性：
凝胶缓冲液Tris-HCl,含Cl－，电极缓冲液Tris-Gly,Gly
3.pH的不连续性：
浓缩胶pH6.8,分离胶pH8.8，电极缓冲液pH8.3
4.电位梯度的不连续性
不连续缓冲体系；不连续凝胶孔径；不连续pH→不连续电位梯度→浓缩效应
盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应：
1.样品的浓缩效应；2.电荷效应；3.分子筛效应
SDS-PAGE过程
1.浓缩效应:
①浓缩胶（大孔胶）
②浓缩胶缓冲液pH6.8Tris-HCl,电极缓冲液pH8.3Tris-Gly
解离度：
Cl→蛋→Gly；mclAcl→m蛋A蛋→mGlyAGly
③凝胶中Cl-为快离子，Gly-为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。
④样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应（缓冲液pH8.3）
⑤蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。
2.分子筛效应:
①蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大（pH8.8Tris-HC1），Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。
②由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。
③分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。
分子量小，形状为球形的泳动速度最快。
2.电荷效应:
①蛋白质样品进入分离胶后pH增大（pH8.8），Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。
②由于各种蛋白质pI不同，所载有效电荷不同，因此质点的有效迁移率不同，形成不同区带。
实验操作:
1.安装垂直板电泳槽;2.配胶;3.灌制凝胶板;4.样品处理与加样;5.电泳;6.染色与脱色
注意事项:
丙烯酰胺有神经毒性，勿接触皮肤;玻璃板光滑洁净;妥善安装好制胶板，避免液体渗漏;加样孔及凝胶底部不能有气泡
酵母细胞中核糖核酸（RNA）的提取及鉴定
原理:
核酸可分为核糖核酸和脱氧核糖核酸两类。
酵母中富含的核糖核酸在碱处理下成为可溶性的钠盐与蛋白质等其它成分分开，然后用乙醇提取。
加酸水解核酸，可鉴定其组成成分。
用硫酸水解RNA时，可以生成磷酸、戊糖和碱基。
各种成分以下列反应鉴定：
1.磷酸加钼酸铵试剂-蓝色磷钼酸铵沉淀
2.核糖加3，5－二羟甲苯-绿色
3.嘌呤碱加硝酸银-白色嘌呤银化物沉淀
实验操作
1.酵母中RNA的制备
取1g酵母加6.5mlNaOH，研磨3－5min→匀浆→倒到入大试管，加热30m→离心（2000rpm,10min）→弃沉淀，上清至一新管，加醋酸3滴→将溶液倒入6.5ml酸性乙醇的试管中→离心（2000rpm,10min）→弃上清，白色沉淀析出
2.RNA及水解产物的检查
白色沉淀:
1.约1/5，溶解3ml水中→双缩脲反应
2.约4/5，加入5ml1.5mol/LH2SO4，煮沸10分钟（RNA水解液）→1.戊糖实验；2.嘌呤实验；3.磷的检查
注意事项：
离心机的使用：
配平、调速、缓停
离子交换
离子交换层析分离混合氨基酸
原理:
离子交换层析是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
固定相：
带有电荷的离子交换剂
流动相：
具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液
层析方式：
常采用柱层析
洗脱方法：
增加离子强度、改变pH值
离子交换剂:
在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。
按活性功能基团带电荷性质不同分为:
阳离子交换剂:
带负电荷，与阳离子交换;阴离子交换剂:
带正电荷，与阴离子交换
离子交换树脂
1.阳离子交换树脂:
1.强酸型:
含磺酸基团（R-SO3H）；2.中等酸型:
含磷酸基团（-O-PO2H4）;3.弱酸型:
含酚基、羧基
2.阴离子交换树脂:
1.强碱:
含季胺基团[-N+（CH3）3]；2.弱碱:
含叔胺、伯胺基团[-N（CH3）2
离子交换实验操作
1.树脂处理
2.装柱，平衡：
以pH4.2柠檬酸缓冲液平衡柱子;
3.加样：
0.2mL氨基酸样品（溶解于0.1MHCl）加样于凝胶顶部，打开层析柱出口使样品缓慢流入柱内;加入3mL0.1MHCl洗涤;
4.样品洗脱和收集：
以15-20滴/分钟流速洗脱样品，收集洗脱液，每管2mL。
5.检测（按教材操作）
6.树脂回收
酶促反应动力学:
是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。
酶促反应速度：
通常以单位时间内产物的生成量或底物的减少量来表示
酶活力单位：
在特定条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位。
影响酶促反应速度（V）的因素:
底物浓度,酶的浓度,温度,pH,激活剂,抑制剂
Km、Vmax的测定—双倒数作图法ç：
抑制剂
1.竞争性抑制作用:
动力学特点Vmax不变，表观Km增大。
2.非竞争性抑制作用:
动力学特点Vmax降低,表观Km不变。
3.反竞争性抑制作用:
动力学特点Vmax降低，表观Km降低。
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