整理中国药品检验标准操作规程版细菌内毒素检查法.docx
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整理中国药品检验标准操作规程版细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法
1简述
1.1本规范适用于《中国药典》2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
1.2供试品细菌内毒素限值的确定
1.2.1药典中或国家标准有规定的，按供试品各论中规定限值；
1.2.2尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：
L＝K∕M
式中
L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U等表示。
K为按规定的给药途径，人用每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／（kg·h）表示。
其中注射剂，K＝5EU／（kg·h）；放射性药品注射剂，K＝2.5EU／（kg·h）；鞘内用药品，K＝0.2EU／（kg·h）。
M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml／（kg·h）、mg／（kg·h）、U／（kg·h）等表示。
药品人用最大剂量可依据药品使用说明书或参阅《临床用药须知》，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于1h的按1h计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积剂量乘以0.027即可转换为每千克体重剂量［即M：
（最大给药剂量／（m２·h）×1.62m２）／60kg］。
1.3供试品最大有效稀释倍数的确定
供试品的最大有效稀释倍数（MVD）按下式计算：
MVD＝C·L／λ
L为供试品的细菌内毒素限值，当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／u表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／ml或U／ml。
λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
供试品如为无菌粉末或原料药，供试品最小有效稀释浓度（MVC）按下式计算：
MVC＝λ／L。
1.4药典或国家标准或其他内毒素检验标准中已有规定的品种，可直接进行内毒素检查，如在检验中出现干扰的情况需再进行干扰试验的验证；其他未建立内毒素检查的品种需先进行干扰试验的研究，确定限值和不干扰浓度后再进行内毒素检查。
2实验材料及用具
2.1天平供试品称量用，精度为0.1mg以下。
2.2电热干燥箱用于去除外源性内毒素，温度应能达到250℃。
2.3恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。
2.4水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。
2.5旋涡混合器。
2.6鲎试剂，应具有国家主管部门的批准文号。
2.7细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品，除另有规定外，应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品。
2.8细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU／ml（用于凝胶法）或0.005EU／ml（用于光度测定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。
2.9实验用具移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头）、凝集管（10mm×75mm）、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、封口膜、时钟、75％乙醇棉、剪刀、砂轮。
所用玻璃器皿须经250℃干烤30分钟以上。
若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。
2.10细菌内毒素光度测定仪器。
3实验准备
3.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液控干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，控干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器内，放置入电热干燥箱。
3.2玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素的去除玻璃器皿置干燥箱后，将干燥箱调至250℃，待干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，250℃干烤30分钟以上。
达到规定时间后，关断电源，待干燥箱温度自然降至室温。
在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用；如果玻璃器皿用锡箔纸包装，在不打开包装的情况下可在两周内使用，否则须再次干烤除去可能存在的外源性内毒素。
3.3供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。
对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
4凝胶法操作方法
4.1鲎试剂灵敏度复核
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。
因此要求每个实验室在使用一批新的鲎试剂进行供试品干扰试验或供试品细菌内毒素检查前必须进行鲎试剂灵敏度复核试验。
4.1.1实验操作
4.1.1.1细菌内毒素标准溶液的制备
取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75％乙醇棉球擦拭后启开，启开过程中应防止玻璃屑落人瓶内。
按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15min。
然后进行稀释，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟（详细过程请参见标准品使用说明书）。
若使用的为细菌内毒素国家标准品，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装、保存。
若为细菌内毒素工作标准品，为一次性使用。
4.1.1.2待复核鲎试剂的准备
取规格为0.1ml／支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml／支时，取|若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18支管备用。
4.1.1.3加样将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。
4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。
4.1.1.4加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60min＋2min。
4.1.1.5观察并记录结果。
将试管架从水浴中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，若管内形成凝胶，且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（十）；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为
（一）。
保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
4.1.2实验结果计算
当最大浓度2λ4管均为阳性，最低浓度0.25λ4管均为阴性，阴性对照为阴性时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）
式中X为反应终点浓度的对数值（1g），反应终点浓度是系列递减的内毒素标准溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。
4.1.3结果判断
当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时判定该批鲎试剂灵敏度复核合格，可用于干扰试验和供试品细菌内毒素检查，并以λ（标示灵敏度）为该批鲎试剂的灵敏度。
4.1.4举例
如待复核鲎试剂标示灵敏度为0.125EU／ml。
实验结果如下：
内毒素浓度（EU／ml）
0.25
0.125
0.0625
0.031
NC
反应终点浓度
重
复
管
数
1
＋
＋
－
－
－
0.125
2
＋
－
－
－
－
0.25
3
＋
＋
＋
－
0.0625
4
＋
＋
＋
－
0.0625
]
λc在0.5λ～2λ范围内，符合规定。
以标示灵敏度0.125EU／ml为该批鲎试剂的灵敏度。
4.2干扰试验
4.2.1操作方法
干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据。
并且验证当供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时供试品是否存在干扰作用。
由于干扰试验检验的是在供试品存在的情况下内毒素与鲎试剂的反应是否正常，与所使用鲎试剂的灵敏度无关，因此在干扰试验中原则上可使用任一灵敏度的鲎试剂。
但建议使用较低灵敏度（如0.5EU／ml或0.25EU／m1）的鲎试剂，可尽量避免供试品所含的内毒素对干扰试验造成的阳性影响。
4.2.1.1干扰试验预实验
预试验的目的是初步确定供试品的最大不干扰浓度（当限值以EU／mg或EU／U表示）或最小不干扰稀释倍数（当限值以EU／ml表示），为正式干扰试验提供依据。
4.2.1.1.1将内毒素检查阴性的供试品进行一系列倍数的稀释，但最大的稀释倍数不得超过MVD＝CL∕λ0.03（0.03EU／ml为现今我国市售鲎试剂的最高灵敏度）。
4.2.1.1.2使用鲎试剂对每一稀释倍数进行检验。
每一稀释倍数下做2支供试品管和2支供试品阳性对照（即用该浓度的供试品稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度）。
另取2支加入细菌内毒素检查用水作为阴性对照，2支加入2λ浓度的内毒素标准溶液作为阳性对照。
供试品阳性对照溶液制备举例：
制备稀释倍数为4的供试品阳性对照液方法：
取0.3ml浓度为4.0λEU／ml的内毒素标准液＋0.3ml稀释倍数为2的供试品稀释液，制得0.6ml含2λEU／ml内毒素标准液的稀释倍数为4的供试品稀释液。
保温（60士2）min后，观察并记录结果。
4.2.1.1.3当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验为有效。
当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰试验，此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。
即可选择该稀释倍数进行正式干扰试验。
当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照管不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MVD＝CL∕λ0.03），或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。
当供试品的内毒素限值单位为EU／mg或EU／U时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度），以mg／ml或U／ml表示。
4.2.1.1.4举例
例：
设某注射液限值为2.5EU／ml，按MVD＝CL∕λ计算出灵敏度为0.03EU／ml下的MVD为83倍，将供试品溶液稀释一系列进行检验，用灵敏度为0.25EU／ml的鲎试剂进行预实验。
结果如下：
稀释倍数
原液
5
10
20
40
80
供试品溶液
――
――
――
――
――
――
供试品阳性对照
――
――
――
＋＋
＋＋
＋＋
如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰试验。
4.2.1.2干扰试验
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。
4.2.1.2.1制备内毒素标准对照溶液
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、lλ、0.5λ、0.25λ（方法同4.1.1.1.）。
4.2.1.2.2制备含内毒素的供试品溶液
4.2.1.2.2.1将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将4.2.1.2.1中的同一支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素的供试品溶液。
以注射用头孢哌酮钠1g（瓶）为例：
取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mg／ml，用内毒素检查用水将其稀释20倍（即5mg／m1）后备用。
（注：
冻干品或无菌粉末检查用水溶解后体积有无变化，根据具体情况定。
）
取一支细菌内毒素标准品，加入1ml细菌内毒素检查用水溶解，混匀后使用5mg／ml头孢哌酮钠溶液作为溶剂将细菌内毒素标准品依次稀释至2λ、1λ、0.5λ和0.25λ4个浓度。
4.2.1.2.2.2简化法制备含内毒素的供试品溶液
0.5ml浓度为4.0λ的内毒素标准溶液＋0.5ml浓度为10mg／ml的供试品溶液，得到1ml的含2λ内毒素的浓度为5mg／ml的供试品溶液。
同理分别用0.5ml浓度为2λ、lλ和0.5λ的内毒素标准溶液制备含1λ、0.5λ和0.25λ内毒素的浓度为5mg／ml的供试品阳性对照溶液。
（其体积的大小视情况而定）。
4.2.1.2.3鲎试剂的准备
取规格为0.1ml／支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落人瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内。
每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml／支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1m1分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。
4.2.1.2.4加样
将准备好的鲎试剂取其中18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），l列2支（管）。
其中的4列4支每列每支分别加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。
其中的4列4支每列每支分别加入0.1ml含2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的供试品溶液，另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温（60±2）min后，观察并记录结果。
4.2.2实验结果计算
如两组最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）。
式中Xs、Xt分别为检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
4.2.3结果判断
当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，且Et在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。
当Et不在0.5Es～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，则认为供试品在该浓度下干扰试验。
应使用适宜方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数的稀释，是排除干扰因素的简单有效方法。
建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取3个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰试验。
4.2.4举例
设供试品为某注射液，预实验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，使用灵敏度为0.25EU／ml的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰。
内毒素浓度（EU／ml）
0.5
0.25
0.125
0.0625
Nc
反应终点浓度
内毒素标准溶液
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
－
－
－
－
－
0.125
0.125
0.125
0.125
含供试品的内毒素溶液
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
0.25
0.25
0.25
0.25
Et在0.5Es～2.0Es范围内，说明该供试品进行20倍稀释后确已排除干扰作用，在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌内毒素检查法。
4.3供试品细菌内毒素检查
在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验须做2支阳性对照和2支阴性对照。
4.3.1操作方法
4.3.1.1供试品溶液的制备
首先计算MVD＝C·L／λC、L的意义同1.3。
λ为所使用鲎试剂的标示灵敏度。
然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MVD。
4.3.1.2阳性对照溶液的制备
用检查用水将标准品稀释制成2入浓度的内毒素标准溶液。
（方法同4.1.1.1）。
4.3.1.3供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2入浓度的内毒素溶液。
（方法同4.2.1.1.2供试品阳性对照溶液的制备）。
4.3.1.4阴性对照液即细菌内毒素检查用水
4.3.1.5鲎试剂的准备
取规格为0.1ml／支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底．用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75％酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶内。
每支加入0.1ml检查用水溶解。
轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。
若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml／支时，取若干支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1m1分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装8管备用。
4.3.1.6加样取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释倍数不得超过MVD）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。
4.3.1.7将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃士1℃水浴或适宜恒温器中，保温（60土2）min。
保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
4.3.2结果判断
当阳性对照、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照为阴性时，实验方为有效。
若供试品2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，应认为不符合规定；如2管中一管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中，如有1管为阳性，即认为不符合规定。
若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MVD而结果出现2管均为阳性或2管中一管为阳性时，按同样方法重新进行实验，实验时要求将其稀释至MVD。
4.3.3举例
供试品为葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU／ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU／ml。
MVD＝C·L／λ＝0.5／0.125＝4
将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。
供试品
供试品阳性对照
阳性对照
阴性对照
――
＋＋
＋＋
――
结果是否有效
有效
结果判断
该批葡萄糖注射液内毒素含量小于0.5EU／ml，符合规定。
4.4凝胶半定量实验
半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。
系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。
4.4.1操作方法
4.4.1.1供试品系列的制备
用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释。
制备成2、4、8等n个浓度，但最大稀释倍数不得超过所使用鲎试剂的MVD。
n可根据实验设计不同确定。
4.4.1.2内毒素标准系列的制备
用检查用水将内毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2λ、1λ、0.5λ、0.25λ，（方法同4.1.1.1.）。
4.4.1.3供试品阳性对照溶液的制备
用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。
（方法同4.2.1.1.2供试品阳性对照溶液的制备）。
4.4.1.4阴性对照液即细菌内毒素检查用水。
4.4.1.5鲎试剂的准备
取规格为0.1ml／支或分装好的鲎试剂12＋2n支，其他准备按干扰试验项下的“鲎试剂准备”。
4.4.1.6加样
将准备好的鲎试剂取其中10支（管）放在试管架上，排成5列，每列2支。
其中4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外2n支（管）鲎试剂放在试管架上，排成N列，每列2支（管）。
每列每支分别加入0.1ml一个浓度的供试品溶液。
另2支（管）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为样品阳性对照。
4.4.1.7将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温（60±2）min。
保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。
4.4.2实验结果计算
如内毒素标准系列最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照均为阴性，供试品阳性对照为阳性时，按下式计算内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（λt）和供试品系列溶液反应终点浓度的几何平均值（CE）。
式中
Xt为内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（1g）。
XE为供试品溶液的反应终点浓度的对数值（1g）。
每个系列的反应终点浓度即每一系列平行管的终点稀释倍数D乘以鲎试剂标示灵敏度λ，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度。
4.4.3结果判断
当λt在0.5λ～2λ之间，试验方为有效。
供试品的内毒素含量即为供试品系列反应终点浓度的几何平均值。
如果试验检验的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘上稀释倍数。
如试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于λ乘以该供试品的最低稀释倍数）。
如果结果都为阳性，应记为内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。
若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。
4.4.4举例
设供试品为某注射液，干扰试验已确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，其内毒素限值为10EU／ml，现使用灵敏度为0.03EU／ml的鲎试剂检测供试品中的内毒素含量。
MVD＝C·L／λ＝10／0.03≈320倍
将供试品溶液先稀释至20倍后，再进行对倍稀释。
将20倍稀释液再稀释2、4、8、16倍，同时制备内毒素标准系列。
内毒素浓度
（EU／ml）
0.0625
0.03
0.015
0.0075
Nc
反应终点浓度
内毒素标准溶液
＋
＋
－
－
－
－
－
－
－
－
0.0625
0.0625
供试品稀释倍数
1
2
4
8
16
PPC
反应终点
稀释倍数D
反应终点浓度
D×λ
供试品系列
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
－
－
－
＋
＋
8
4
0.24
0.12
λt在0.5λ～2λ之间，试验为有效。
供试品20倍稀释液的内毒素含量为0.170EU／ml。
由于供试品先被稀释了20倍，因此供试品的内毒素含量为0.170×20＝3.40EU／ml，低于规定的内毒素限值，此批注射液内毒素检查项符合规定。
5光度法操作方法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中浊度变化而测定内毒素含量的方法。
根据检测原
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