实验一 脯氨酸含量的测定.docx

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实验一脯氨酸含量的测定

实验一脯氨酸含量的测定

实验一脯氨酸含量的测定

一、目的

了解脯氨酸与植物逆境、衰老的关系;掌握脯氨酸测定原理和常规测定方法。

二、原理

在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。

因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。

在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在515nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。

三、实验材料，主要仪器和试剂

1（实验材料

植物组织。

2（主要仪器

（1）分光光度计

（2）水浴锅

（3）大试管（18mm×200mm）

（4）具塞刻度试管（20mL）

3（试剂

（1）酸性茚三酮溶液:

称取1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸和20mL6M磷酸溶液中，搅拌加热（低于70?

）溶解，冷却后置棕色瓶中，4?

保存可使用2~3天。

（2）80%乙醇（分析纯）。

（3）脯氨酸标准溶液:

称取10mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸馏水定容至100mL（100μg/mL）。

再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL的系列溶液。

四、操作步骤

1（脯氨酸标准曲线制作

取7支具塞试管，分别加入各浓度的标准脯氨酸系列溶液2mL，冰乙酸2mL，茚三酮溶液2mL，混匀后沸水浴中加热20min，冷却后，以0号管为对照在515nm光波长下比色测定光密度。

以光密度OD为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

515nm

管号标准脯氨酸（μg）冰乙酸（mL）茚三酮溶液（mL）OD515nm

1022

2122

32.522

45.022

51022

61522

72022

2（样品制定

（1）称取0.2~0.5g植物样品放入研砵中，用总量为10mL80%的乙醇（少许）研磨成匀浆，将匀浆移入大试管并用剩余80%乙醇洗研砵，试管加盖，黑暗下浸提1h（样品为绿色叶片时，应加入少许活性炭）。

（2）过滤上述提取液，并加1g人造沸石振荡15min，室温下离心3000r/min、5min。

（3）取上清液2mL，加入2mL冰乙酸，2mL茚三酮溶液于大试管中，充分混匀，沸水浴加热20min，冷却后515nm波长下测定光密度。

从标准曲线上查出待测样品中脯氨酸含量（μg）。

五、结果计算

C×5脯氨酸含量（μg/g）=W

式中:

C——由标准曲线查得的待测样品脯氨酸含量（μg）

W——植物样品重量（g）

5——提取脯氨酸时80%乙醇体积（10mL）与测定时所取样品液体积（2mL）比。

六、思考题

1（植物组织内游离脯氨酸测定有何意义,

2（脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方法,测定时应作哪些改变,

参考答案

1（在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量明显增加。

测定植物体内游离脯氨酸的含量，可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。

2（脯氨酸提取除本实验方法外，还可以用磺基水杨酸处理样品，待酸性茚三酮反应之后，再用甲苯萃取，520nm比色。

当脯氨酸提取试剂或萃取剂改变时，测定光密度的波长应当改变，具体采用多少波长，还应根据实验而定。

实验二考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

一、目的

学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。

二、原理

50（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的考马斯亮蓝G-2

一种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合

后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。

其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。

该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0,1000μg,mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

二、二、材料、主要仪器和试剂

1（实验材料

新鲜绿豆芽

2（主要仪器

（1）分析天平、台式天平

（2）刻度吸管

（3）具塞试管、试管架

（4）研钵

（5）离心机、离心管

（6）烧杯、量筒

（7）微量取样器

（8）分光光度计

3（试剂

1）牛血清白蛋白标准溶液的配制:

准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸（

馏水中，即为1000μg,mL的原液。

（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:

称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90,乙醇中，加入85,（W,V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。

此溶液在常温下可放置一个月。

（3）乙醇

（4）磷酸（85,）

四、操作步骤

1（标准曲线制作

（1）0~100μg,mL标准曲线的制作:

取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。

盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD，并做标准曲线。

595nm

表1低浓度标准曲线制作

管号123456

1000μg,mL标准蛋白液（mL）00.020.040.060.080.10

蒸馏水（mL）1.000.980.960.940.920.90

考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555

蛋白质含量（μg）020406080100

OD595nm

（2）0~1000μg,mL标准曲线的制作:

另取6支10mL具塞试管，按表2取样。

其余步骤同

（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1000μg,mL的标准曲线。

表2高浓度标准曲线制作

管号789101112

1000μg,mL标准蛋白液（mL）00.20.40.60.81.0

蒸馏水（mL）1.000.80.60.40.20

考马斯亮蓝G-250试剂（mL）555555

蛋白质含量（μg）02004006008001000

OD595nm

2（样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备:

称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。

（2）测定:

另取2支10mL具塞试管，按下表取样。

吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD，并通过标准曲线查得待测样品提取595nm

液中蛋白质的含量X（μg）。

以标准曲线1号试管做空白。

表3待测液蛋白质浓度测定

管号1314

蛋白质待测样品提取液（mL）0.10.1

0.90.9蒸馏水（mL）

55考马斯亮蓝G-250试剂（mL）

OD595nm

蛋白质含量（μg）

五、结果计算

提取液总体积（mL）X×测定时取样体积（mL）样品蛋白质含量（μg/g鲜重）=样品鲜重（g）式中:

X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。

六、附注

1（Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

++2+2（有些阳离子，如K、Na、Mg、（NH）SO、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去424

污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。

3（蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡;其

结合物在室温下1h内保持稳定。

因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。

七、思考题

1（制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合,

参考答案

1（将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。

实验三茚三酮显色法测定氨基酸含量

一、一、目的

学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法

二、二、原理

OO

CCCOOHHOHOCONH2+RC3++CCHCNH+2HOHOHCCR

OO醛类还原型茚三酮氨基酸茚三酮

OOOO

CCCCHOHHO2+3CHNCCNH3++CHOCOHCCC

OOOO

蓝紫色产物

茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。

氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。

该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。

三、试剂与材料

（1）标准氨基酸溶液:

配制成0.3mmol/L溶液。

（2）pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液:

量取86mL2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL2mol/L乙酸混合而成。

用pH检查校正。

（3）茚三酮显色液:

称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。

茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶:

称取5g茚三酮溶于15,25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。

加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。

次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。

还原型茚三酮按下法制备:

称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。

将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中，

不断出现沉淀。

滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4?

，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。

乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物:

在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1,2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121,125?

的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。

（4）60,乙醇。

（5）样品液:

每毫升含0.5,50μg氨基酸。

（6）分光光度计。

（7）水浴锅。

四、操作步骤

1（标准曲线的制作

分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。

各加入1mLpH5.4，2mol/L醋酸缓冲液;再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100?

水浴中加热15min，用自来水冷却。

放置5min后，加入3mL60,乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD。

（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，570nm

应测定OD）。

440nm

以OD为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

570nm

2（氨基酸样品的测定

取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100?

沸水浴中加热15min，自来水冷却。

放置5min后，加3mL60,乙醇稀释，摇匀后测定OD（生成的颜色在60min内稳定）。

570nm

将样品测定的OD与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。

570nm

五、五、结果计算

OD对应标准曲线查得值570nm氨基酸含量（mmol/L）=1000

六、思考题

1（茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定,

参考答案

1（可以。

蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。

除α-氨基酸中的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其它氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。

因此在层析法可以用茚三酮对氨基酸进行定性鉴定。

实验四紫外吸收法测定蛋白质含量

一、目的

学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。

二、原理

由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性

质，最大吸收峰在280nm波长处。

在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD与其280nm

浓度呈正比关系，可作定量测定。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1（试验材料:

待测的蛋白质溶液。

（2（主要仪器2

（1）紫外分光光度计，

（2）试管与试管架，（3）刻度吸量管

3（试剂

（1）标准牛血清蛋白溶液:

准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。

（2）待测蛋白质溶液:

浓度为1mg/mL左右的溶液。

四、操作步骤

1（标准曲线制作

按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。

以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD。

以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘280nm

出标准曲线。

表1蛋白质标准曲线制作

管号标准蛋白质溶液（mL）蒸馏水（mL）蛋白质浓度（mg/mL）OD280nm

1040

20.53.50.125

31.03.00.25

41.52.50.375

52.02.00.50

62.51.50.625

73.01.00.75

84.001.0

2（样品测定

取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。

五、附注

1（在测定工作中，可以利用280nm及260nm的光密度值求出蛋白质的浓度:

蛋白质浓度（mg/mL）=1.45OD―0.74OD280nm260nm

式中的OD是蛋白质溶液在280nm下测得的光密度，OD是蛋白质溶液在260nm下280nm260nm

测得的光密度。

2（对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间，选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm及260nm处分别测出光密度OD/OD280nm260nm的比值，从表2中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将F值代入下述公式，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。

蛋白质浓度（mg/mL）=F×OD×D280nm

式中:

OD为被测溶液在280nm紫外波长下的光密度，D为溶液的稀释倍数。

280nm

表2紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子

OD/OD校正因子核酸%OD/OD校正因子核酸%280nm260nm280nm260nm

1.751.1160.000.8460.6565.50

1.631.0810.250.8220.6326.00

1.521.0540.500.8040.6076.50

1.401.0230.750.7840.5857.00

1.360.9941.000.7670.5657.5

1.300.9701.250.7530.5458.00

1.250.9441.500.7300.5089.00

1.160.8992.000.7050.47810.00

1.090.8522.500.6710.42212.00

1.030.8143.000.6440.37714.00

0.9790.7763.500.6150.32217.00

0.9390.7434.000.5950.27820.00

0.8740.6825.00注:

通常纯蛋白质的OD/OD约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。

280nm260nm

六、思考题

1（紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点,

2（若样品中含有核酸类杂质，应如何校正,

参考答案

1（蛋白质测定的Folin-酚比色法（即Lowry法）的定量范围为5,100μg蛋白质，灵敏度高;但操作要费较长时间，且Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用;不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度也稍有不同。

紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。

因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。

但该法的缺点是:

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。

故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。

例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正。

2（当样品中含有核酸类杂质，可以根据核酸在260nm波长处有最强的紫外光吸收，而蛋白质在280nm处有最大的紫外光吸收的性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。

详细内容见附注。

但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。

实验五还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法

一、目的

掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

COOHCOOH

OHOH加热+糖酸+还原糖碱性

ONNH22ONNO22

3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色）3,5-二硝基水杨酸（黄色）

三、实验材料、主要仪器和试剂

1（实验材料

小麦面粉;精密pH试纸。

2（主要仪器

（1）具塞玻璃刻度试管:

20mL×11

（2）大离心管:

50mL×2

（3）烧杯:

100mL×1

（4）三角瓶:

100mL×1

（5）容量瓶:

100mL×3

（6）刻度吸管:

1mL×1;2mL×2;10mL×1

（7）恒温水浴锅

（8）沸水浴

（9）离心机

（10）扭力天平

（11）分光光度计

3（试剂

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取80?

烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4?

冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色

瓶中备用。

（3）碘-碘化钾溶液:

称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂:

称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

（5）6MHCl和6MNaOH各100mL。

四、操作步骤

1（制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作

1mg/mL葡萄糖标准液蒸馏水DNS葡萄糖含量光密度值管号（mL）（mL）（mL）（mg）（OD）540nm

0021.50

10.21.81.50.2

20.41.61.50.4

30.61.41.50.6

40.81.21.50.8

51.01.01.51.0

61.20.81.51.2

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。

调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。

以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2（样品中还原糖和总糖的测定

（1）还原糖的提取

准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50?

恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。

将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

（2）总糖的水解和提取

准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。

待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。

将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。

（3）显色和比色

取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。

加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

表2样品还原糖测定

还原糖待测液总糖待测液蒸馏水DNS光密度值查曲线葡萄糖量管号（mL）（mL）（mL）（mL）（OD）（mg）540nm

70.51.51.5

80.51.51.5

9111.510111.5

五、结果与计算:

计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

提取液总体积查曲线所得葡萄糖毫克数×测定时取用体积还原糖（%）=×100样品毫克数

六查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数总糖（%）=×0.9×100、附样品毫克数注

1（离心时对称位置的离心管必须配平。

2（标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。

3（面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖