净电荷为正
pH=pI
净电荷=0
pH>pI
净电荷为负
当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点（isoelctricpoint）。
甘氨酸盐酸盐（A+）
等电点甘氨酸（A）
甘氨酸钠（A-）
甘氨酸滴定曲线
谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算
三．氨基酸光学活性和光谱性质
1、旋光性：
除甘氨酸外，所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。
2、紫外吸收光谱：
参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区显示特征的吸收谱带，最大光吸收（max）分别为280、275和257nm。
由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。
四，芳香族氨基酸
苯丙氨酸（Phe,F）
酪氨酸（Tyr,Y）
色氨酸（Try,W）
摩尔吸收系数
TryTyrPhe的紫外吸收光谱
波长
氨基酸与2,4一二硝基氟苯（DNFB）的反应（sanger反应）
2，4-二硝基氟苯（DNFB）（dinitrofiuorobenzene）
氨基酸+HF（2，4-二硝基苯氨基酸）
氨基酸与苯异硫氰酯（PITC）的反应（Edman反应）
+异硫氰酸苯酯（PITC）
五，氨基酸与茚三酮反应（定量）
△
弱酸
还原性茚三酮
茚三酮（无色）
茚三酮
还原性茚三酮
幻灯片12
多肽N、C-末端氨基酸的测定
N端Sanger法（二硝基氟苯反应）
DNS法（丹磺酰氯反应）
Edman法（苯异硫氰酸脂反应）
氨肽酶法
C端肼解法
还原法
羧肽酶法
幻灯片13
蛋白质顺序测定基本方法路线
幻灯片14
二硫键的断裂
幻灯片15
蛋白质一级结构测定
基本策略：
氨基酸顺序直测法＋片段重叠法
基本步骤：
（1）测定蛋白质分子中多肽链数目；
（2）拆分蛋白质的多肽链，断开多肽链内二硫键；
（3）分析每一条多肽链的氨基酸组成；
（4）鉴定多肽链N－末端、C－末端氨基酸残基；
（5）裂解多肽链成较小的片段；
（6）测定各肽段的氨基酸顺序；
（7）片段重叠法重建完整多肽链一级结构；
（8）确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。
幻灯片16
对角线电泳示意图
幻灯片17
第六节 蛋白质的重要性质
一、两性解离性质及等电点
二、蛋白质胶体性质
三、蛋白质的沉淀
四、蛋白质的变性与复性
五、蛋白质的紫外吸收特性
六、蛋白质呈色反应
幻灯片18
蛋白质两性解离性质和等电点
当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectricpoint，pI）
幻灯片19
蛋白质的胶体性质
蛋白质是相对分子质量较高的有机化合物，分子量在10kD-1000kD，其分子的直径可达1～100nm，属胶体颗粒。
具有胶体溶液的性质：
丁达尔现象、布朗运动、不能通过半透膜、扩散速度减慢、黏度大等。
*蛋白质胶体稳定的因素
颗粒表面的同种电荷
水化膜
幻灯片20
蛋白质的沉淀
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。
沉淀方法类别:
1、高浓度中性盐（盐析）
2、酸碱（等电点沉淀）
3、有机溶剂沉淀
4、重金属盐类沉淀
5、生物碱试剂和某些酸类沉淀
6、加热变性沉淀
幻灯片21
溶液中蛋白质的聚沉
水化膜
幻灯片22
使蛋白质沉淀的主要方法有：
1.中性盐沉淀蛋白质---盐析（保持活性）
蛋白质溶液中加入大量中性盐时，蛋白质便从溶液中沉淀出来，这个过程称为盐析。
作用机制：
中性盐夺取蛋白质的水化膜并中和电荷。
常用的中性盐有：
硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等
通常在蛋白质的等电点附近进行盐析。
幻灯片23
根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐析时需要盐的浓度也不一致。
因此，调节中性盐的浓度，可使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法称分段盐析法。
临床检验中常用此法来分离和纯化蛋白质。
幻灯片24
2.重金属盐沉淀蛋白质
蛋白质可以与重金属离子（如汞、铅、铜、锌等）结合生成不溶性重金属盐而沉淀。
此反应的条件是溶液的pH值应稍大于该蛋白质的等电点，使蛋白质带较多的负电荷，易与金属离子结合。
临床应用：
常用蛋清或牛乳解救误服重金属盐的病人，然后，用洗胃或催吐的方法，将重金属离子的蛋白质盐从胃内清除出去，也可用导泻药将毒物从肠管排出。
幻灯片25
3.某些酸类沉淀蛋白质
当溶液的pH值应小于该蛋白质的等电点，蛋白质将带正电荷，可以与酸根结合生成不溶盐而沉淀。
蛋白质可与钨酸、苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水杨酸等发生沉淀。
生化检验中常用钨酸或三氯醋酸作为蛋白沉淀剂，以制备无蛋白血滤液。
幻灯片26
4.有机溶剂沉淀蛋白质
乙醇、甲醇、丙酮等有机溶剂可破坏蛋白质的水化层，因此，可沉淀蛋白质。
若把溶液的pH调节到该蛋白质的pI时，则沉淀更完全。
此法优于盐析，因不需透析去盐，且有机溶剂易于通过蒸发去除。
应用：
临床上使用乙醇作为消毒剂。
幻灯片27
5.加热凝固
将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热，可使蛋白质发生凝固而沉淀。
加热使蛋白质变性，有规则的肽链结构被打开呈松散状不规则的结构，分子的不对称性增加，疏水基团暴露，进而凝聚成凝胶状的蛋白块。
如煮熟的鸡蛋，蛋黄和蛋清都凝固。
幻灯片28
6、等电点沉淀（选择性沉淀）
利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质。
注意：
调节溶液到蛋白质等电点时，可以使蛋白质溶解度最低，但是并不意味着蛋白质会沉淀出来，所以常和盐析法结合使用。
幻灯片29
几种主要沉淀方法比较
幻灯片30
蛋白质的透析
透析法:
利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。
这种方法称为透析（dialysis），分离纯化蛋白质的方法之一
幻灯片31
●蛋白质分子不能透过生物膜的特点，在生物学上有重要意义，它能使各种蛋白质分别存在于细胞内外不同的部位，对维持细胞内外水和电解质分布的平衡、物质代谢的调节都起着非常重要的作用。
幻灯片32
蛋白质的离心沉降
蛋白质大分子溶液在一定溶剂中超速离心时可发生沉降。
蛋白质分子愈大，沉降系数愈高，故可根据沉降系数来分离和检定蛋白质。
沉降速度与向心加速度之比值即为蛋白质的沉降系数S。
幻灯片33
（1）变性
●变性（denaturation）：
在某些理化因素作用下，蛋白质的空间结构被破坏，从而导致其理化性质改变、生物活性丧失的现象称为变性。
变性不涉及一级结构的变化。
理化性质的变化：
紫外吸收、化学活性及粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、结晶能力丧失。
幻灯片34
●造成变性的因素：
●物理因素（加热、加压、脱水、搅拌、振荡、紫外线照射、超声波作用等）
化学因素（强酸、强碱、尿素、重金属盐、有机溶剂、十二烷基磺酸钠等）
●变性的本质
破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结。
幻灯片35
（2）复性
蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性（renaturation）。
天然状态，
有催化活性
去除尿素、
β-巯基乙醇
尿素、
β-巯基乙醇
非折叠状态，无活性
实际上，大多数蛋白质在变性后，其空间构象遭到严重破坏而不能复性。
幻灯片36
●应用举例
●①利用变性：
●酒精消毒
●高压灭菌
●血滤液制备
●②防止变性：
低温保存生物制品
●③取代变性：
乳品解毒（用于急救重金属中毒）
幻灯片37
（3）蛋白质凝固
天然蛋白质变性后，所得的变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插结合在一起的现象称为蛋白质凝固。
蛋白质凝固后一般都不能再溶解。
蛋白质的变性并不一定发生沉淀，即有些变性蛋白质在溶液中不出现沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，凝固的蛋白质必定发生变性并出现变性和沉淀，而变性和沉淀的蛋白质不一定发生凝固。
幻灯片38
蛋白质的紫外吸收光谱
蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。
幻灯片39
蛋白质主要呈色反应
双缩脲反应
酚试剂反应→蛋白质定量、定性
茚三酮反应测定常用方法
幻灯片40
蛋白质的呈色反应
⒈茚三酮反应（ninhydrinreaction）
α-氨基酸与水化茚三酮作用时，产生蓝色反应。
由于蛋白质经水解后产生氨基酸，所以也发生此颜色反应。
⒉双缩脲反应（biuretreaction）
双缩脲由两分子尿素加热缩合而成，双缩脲在碱性条件下与硫酸铜发生紫红色反应。
蛋白质分子中含有和双缩脲结构相似的肽键，因此也能发生类似反应，对540nm波长的光有最大吸收峰。
幻灯片41
双缩脲反应
（碱性溶液）
Cu2+
蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，产生红紫色络合物
红紫色络合物
幻灯片42
3.Folin-酚试剂反应
蛋白质分子中含有一定量的酪氨酸残基，其中的酚基在碱性条件下与酚试剂的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物，根据颜色深浅可作为蛋白质的定量测定，其反应的灵敏度比双缩脲反应高100倍。
4.乙醛酸反应
含有色氨酸残基（吲哚基）的蛋白质溶液加入乙醛酸混合后，慢慢加入浓硫酸，在两液接触面呈现紫红色环。
由于其反应现象明显，常用于鉴定蛋白质中是否含色氨酸。
幻灯片43
5.米伦反应（定性）
蛋白质溶液中加入米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混和液），蛋白质首先产生白色沉淀，加热则变为红色，此为酪氨酸的所特有的反应，因此，含有酪氨酸的蛋白质均呈米伦反应。
6.考马斯亮蓝G-250
考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色。
此法已广泛用于蛋白质含量的测定。
幻灯片44
二、蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法：
凯式定氮法（Kjedahl法）
双缩脲法（Biuret法）
紫外吸收法
Folin-酚试剂法（Lorry法）
考马斯亮蓝法（Bradford法）
幻灯片45
（一）凯式定氮法
原理：
蛋白质是含一定量氮的有机化合物。
样品在凯氏烧瓶中经浓硫酸消化后，蛋白质分解，其中的氮与浓硫酸作用生成硫酸铵，再在强碱条件下蒸馏出氨，用硼酸吸收，以标准酸滴定，根据标准酸消耗的量，乘以一定系数，即可计算样品中蛋白质的含量。
幻灯片46
干扰物质：
非蛋白氮
缺点：
操作比较复杂、费时（8-10小时）
灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮测定。
优点：
测定结果准确、干扰少
常用于标准蛋白质含量的准确测定
事例：
三聚氰胺事件
幻灯片47
（二）双缩脲法（Biuret法）
原理：
双缩脲是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物在540nm处有最大吸收，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
幻灯片48
干扰物质：
硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等
缺点：
灵敏度低1-20mg
优点：
快速（20-30min）、干扰物质少
不同蛋白质产生颜色的深浅相近
此法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
幻灯片49
（三）紫外吸收法
原理：
蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定280nm处的吸光度值可用于蛋白质含量的测定。
幻灯片50
●许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。
下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。
文献值A1％1cm,λ称为百分吸收系数或比吸收系数。
蛋白质浓度=（A28010）/A1％1cm,280nm（mg/ml）
（1%浓度10mg/ml）
例：
牛血清清蛋白：
A1％1cm=6.3（280nm）
溶菌酶：
A1％1cm=22.8（280nm）
幻灯片51
若查不到待测蛋白质的A1％1cm值，则可选用一种与待测蛋白质的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。
标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0mg/ml。
常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白（BSA）。
幻灯片52
●核酸对紫外光有很强的吸收，在280nm处的吸收比蛋白质强10倍（每克），但核酸在260nm处的吸收更强，其吸收高峰在260nm附近。
核酸260nm处的消光系数是280nm处的2倍，而蛋白质则相反，280nm紫外吸收值大于260nm的吸收值。
通常：
●纯蛋白质的光吸收比值：
A280/A2601.8
●纯核酸的光吸收比值：
A280/A2600.5
蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260（mg/ml）
幻灯片53
干扰物质：
嘌呤、嘧啶、核酸等
（可适当校正核酸的干扰）
缺点：
准确度较低、干扰物质多
优点：
简便、灵敏、快速（5-10min）
不消耗样品，测定后仍能回收使用
此法适用于只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。
幻灯片54
（四）Folin-酚试剂法（Lowry法）
原理：
此法是双缩脲法的发展，在碱性溶液中铜-蛋白质复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin试剂），产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）。
在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。
幻灯片55
干扰物质：
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等；
干扰双缩脲的物质同样干扰Lorry反应，且对后者影响更大。
缺点：
费时（40-60min）、干扰物多
优点：
灵敏度高~5μg
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一，应用比较广泛。
幻灯片56
（五）考马斯亮蓝法（Bradford法）
原理：
考马斯亮蓝G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也有棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质的浓度成正比。
幻灯片57
干扰物质：
TritonX-100、SDS、强碱性缓冲液等
缺点：
仍有一定的偏差（各种蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同）
优点：
灵敏度高1~5μg
快速（5~15min）、简便、干扰物少
此法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法，得到广泛的应用。
幻灯片58
值得注意的是，除凯氏定氮法外，其余四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。
每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。
在选择方法时应考虑：
①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
幻灯片59
氨基酸与茚三酮反应
+
茚三酮（无色）
幻灯片60
问题
一个蛋白质，完全溶解于pH7.0的水中，溶液的pH变为了pH7.8，请问该蛋白质的pI在什么的pH范围？
请写出推导过程。
幻灯片61
Edman化学降解法
1、偶联反应
2、环化反应
少一个氨基酸残基的肽
ATZ（噻唑啉酮苯胺）
幻灯片62
蛋白质分子不能透过生物膜的特点，在生物学上有重要意义，它能使各种蛋白质分别存在于细胞内外不同的部位，对维持细胞内外水和电解质分布的平衡、物质代谢的调节都起着非常重要的作用。
利用蛋白质不能透过半透膜的特性，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入半透膜袋内，然后将袋浸于蒸馏水中，小分子物质由袋内移至袋外水中，蛋白质仍留在袋内，这种方法叫做透析。
透析是纯化蛋白质的方法之一。
幻灯片63
蛋白质胶体性质的应用
盐析法:
在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。
同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（saltingout）。
透析法:
利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。
这种方法称为透析（dialysis）。
幻灯片64
蛋白质的沉淀
沉淀出来的蛋白质，根据实验条件，可以是变性或不变性。
幻灯片65
●应用举例
●临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。
●防止蛋白质变性是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。
幻灯片66
问题
溶液中有分子量大小差异较大的两种蛋白质，当向溶液中逐渐加入硫酸铵，使其浓度逐步增加。
请问在这一过程中，那种蛋白质先沉淀下来？
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