单克隆抗体技术的应用.docx

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单克隆抗体技术的应用

第三节单克隆抗体技术的应用

几十年以来,人们一直尝试利用人免疫系统产生人源性单抗来制备特异性强的人源抗体药物,从而治疗肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等。

根据用途的不同，单抗大体上可分为三类，即诊断用单抗、治疗用单抗、“生物导弹”用单抗。

单抗为人类疾病的防治和诊断、肿瘤体定位、靶向药物的制备、防止移植物的排异反应、新型疫苗的研制提供了较为理想的手段。

3.1用于疾病的诊断

1、检测淋巴细胞表面分子，用于鉴别淋巴细胞。

它用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段的淋巴细胞。

例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。

细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。

组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。

人体的淋巴细胞分为T细胞、B细胞和包括NK细胞为代表的第三群细胞，下分若干亚群，各有其特异的表面标志和功能，据此建立许多相应的检测方法。

临床上各种类型的免疫缺陷症、自身免疫病以及肿瘤等均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化。

因此计数外周血和组织淋巴细胞及其亚群的数目或比例，以及它们所显示的功能强弱，可藉此判断机体的细胞免疫水平，对临床认识疾病，探讨其发病机制、观察病情、判断预后、考核疗效以及防治疾病等方面可提供极为有用的信息。

检测人T细胞的特异性抗原，曾采用抗人脑、抗人胸腺细胞和抗人T细胞等抗血清，通过细胞毒试验或免疫荧光染色加以鉴定。

自抗白细胞分化抗原的单克隆抗体问世以来，上述诸多方法均被新方法取而代之。

常用以鉴定和检测计数T细胞的表面分化抗原如下表所示。

表T胞表面主要CD抗原及其特异性

用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类，一类是用标记抗体着染，如免疫荧光法、酶免疫法、生物素－亲和素（或链霉亲和素）系统的ABC法以及免疫金银染色法；另一类是用抗体致敏的红细胞作花环试验。

两类方法各有优缺点。

以下叙述有代表性的方法。

（一）间接免疫荧光法

本法是将分离获得的外周血单个核细胞分别与抗相应CD的单克隆抗体（如CD2、CD4、CD8）结合后，洗去游离的抗体，继加荧光素标记的抗小鼠IgG抗血清，经温育结合后，洗去多余的标记抗体，取样制片，用荧光显微镜观察并计数约200个单个核细胞，以荧光阳性细胞与计数细胞总数之比，求得相应CD抗原阳性的T百分率。

如有条件，细胞经荧光标记抗体着染后，用流式细胞仪计数，快速而准确，但需要较多的投资，难以普及应用。

（二）免疫细胞化学法

通常用酶免疫检测法，如APAAP酶免疫桥联法。

为减少非特异性着染，可选用生物素－链霉亲和素系统试剂作ABC法染色。

该类方法可用普通显微镜观察，凡呈棕黄色的细胞为相应CD抗原阳性细胞，计其占总淋巴细胞的百分率。

本法简便易行，不需特殊仪器，一般试验室均可采用。

　　（三）抗体致敏细胞花环法

用相应的CD单克隆抗体致敏醛化的红细胞作为指示物，它与受检的细胞混匀后，置室温片刻，继经低速离心，移放室温作短期温育或4℃过夜后，重悬取样涂片染色镜检。

凡受检细胞周围粘附有3个或更多红细胞的判为花环形成细胞如下图所示，共计数100～200个细胞，以花环形成数与计数细胞总数之比为相应CD抗原阳性细胞的百分率。

本法需有相应的致敏红细胞试剂，受影响的因素较前两法多。

图显微镜下的花环

2、鉴定病原体，准确诊断感染性疾病。

将病原体的抗原分离,再同骨髓瘤细胞杂交建立相应的杂交瘤细胞株,分泌单克隆抗体,可以同病原体发生特异性的抗原-抗体反应,通过免疫荧光试验或ELISA试验对疾病进行诊断。

例如转铁蛋白、肾素、甲状腺素（T4）、三碘甲状腺素（T3）、干扰素、补体成分C3、cAMP、cGMP、生长素、绒毛膜促性腺激素（HCG）、促性腺激素（FSH）、胰岛素、IgG、IgE、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥、氨基糖甙类抗生素、维生素B12等单抗均可作为体激素或药物等微量成分的测定。

如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。

单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。

3、肿瘤的诊断和分型。

某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性，可用于肿瘤的诊断。

目前已批准使用的诊断剂有:

用于结肠癌的votomab和arcilumonab,用于探测感染部位的sulemab,用于卵巢癌的igovomab,用于黑色素瘤的tecnemabK-1。

例如：

瑞振等成功地制备了抗人DcR3McAb，未来对于肺癌、胃肠道肿瘤、脑恶性胶质瘤和胰腺癌的诊断具有很大的帮助。

目前，对肿瘤相关抗原（如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原）的单抗早就用于临床检验。

随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。

用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。

以放射性核素标记单抗可用于体诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。

4、机体微量成分的测定。

应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。

如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。

这种激素类单抗可用于测定体激素水平，判断分泌的功能状态。

除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。

这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。

3.2用于疾病的治疗

1、抗肿瘤单抗,可用于肿瘤的导向治疗。

抗肿瘤单抗利妥昔单抗（rituximab）（美罗华）是第一个被批准用于临床治疗的单抗;它是一种针对CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体,进入人体后可与CD20特异性结合导致B细胞溶解,从而抑制B细胞增殖,诱导成熟B细胞凋亡,但不影响原始B细胞。

随后上市的适用于乳腺癌治疗的曲妥珠单抗为一种针对HER22/neu的重组人源化IgG单克隆抗体,能特异性识Her22调控的细胞表面蛋白HER22,使其通过吞噬作用离开胞膜进入核体,抑制其介导的信号转导,从而起到治疗肿瘤的作用。

表抗体类药物及其靶分子

而阿伦珠单抗（Alemtuzumab）是人源化、非结合型单抗,作用靶点为正常与异常B淋巴细胞的CD52抗原,对源于B和T细胞的各种恶性肿瘤具有很好的治疗作用。

西妥昔单抗（Cetuximab）和贝伐单抗（如下表所示其独特的作用机理）是针对大肠癌的治疗。

曲妥珠单抗在乳腺癌的治疗中起着重要的作用;西妥昔单抗已被证实它对头颈部癌，非小细胞肺癌和结肠癌等多种肿瘤有效。

最新发表的EXTREME（爱必妥）一线治疗复发、转移性头颈部癌的研究表明，采用西妥昔单抗联合顺铂或卡铂+氟尿嘧啶作为一线治疗方案，患者的总生存期（OS）及无进展生存期（PFS）均显著延长如下图所示。

美国Genentech和BiogenIdec公司宣布2011年1月28日美国食品和药品监督管理局（FDA）批准美罗华（Rituxan，rituximab，利妥昔单抗）作为对初始治疗用美罗华加化疗（诱导治疗）有疗效的晚期滤泡淋巴瘤一种维持治疗如下图所示。

美罗华（Rituxan，rituximab），利妥昔单抗

图EXTREME研究单纯化疗组和化疗+西妥昔单抗组的OS

图EXTREME研究单纯化疗组和化疗+西妥昔单抗组的PFS

贝伐单抗独特的作用机制

2、抗细胞表面分子单抗,可抑制同种免疫反应

主要用于移植排斥反应的防治。

抗人T淋巴细胞单抗（McAb）作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。

其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。

注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。

此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。

如莫罗单抗（muromonab-CD3,CD3-单克隆抗体，Orthoclone，OKT3）是FDA批准用于肾移植患者防止异体排斥反应的第一个鼠源型McAb。

此外，人-鼠嵌合抗体Basiliximab、人源化McAbDaclizumab在器官移植排斥反应的治疗上也取得了良好的效果。

莫罗单抗（muromonab-CD3,CD3-单克隆抗体，Orthoclone，OKT3）

3、单克隆抗体在其它疾病中的应用

单克隆抗体药物不只在肿瘤的治疗中取得了很好疗效,在其他疾病的治疗中也取得了一些疗效,例如:

奥马珠单抗（omalizumab）通过与游离IgE结合而显著降低游离IgE的水平,阻断IgE与肥大细胞、嗜碱粒细胞结合,防止炎症介质的释放。

可显著改善哮喘病人的症状、肺功能及生活质量,减少哮喘恶化的发作次数,减少糖皮质激素的用量,使用安全,具有很好的耐受性。

Mab03.2C1C2在体外能抑制白念珠菌芽管的形成,从而抑制白念珠菌对上皮细胞、皮细胞的粘附,降低白念珠菌的侵袭力。

图奥马珠单抗治疗慢性荨麻疹

奥马珠单抗（Omalizumab）是人源化DNA单克隆抗体，具有：

①选择性与血液中游离IgE结合，阻断IgE与FcεRI或FcεRII结合，从而阻断肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放组胺；②当游离IgE浓度降到“0'时，能下调嗜碱性粒细胞或肥大细胞表面FcεRI的表达，降低效应细胞对过敏原的反应性；③IgE奥马珠单抗复合物在循环和组织中积聚，对新进入的过敏原分子具有清道夫的作用;④马珠单抗与表达IgE受体的B细胞结合，抑制抗原递呈。

近年来，奥马珠己被FDA批准用于治疗成人中重度持续性过敏性哮喘和12岁以上儿童患者，对过敏性关节炎和类似抗IgE复合物引起的疾病。

BluneJW等首先报告1例患有中等度持续性哮喘、结节病伴有复发性水肿8年的61岁高家索患者，经过奥马珠治疗后血管水肿很快意外消失。

SpeclDrSL等报告3例经传统方法不能控制的慢性荨麻疹患者，其中1例IgE水平低下，抗IgE受体的抗体水平升高；1例IgE水平升高但抗IgE受体的抗体水平正常；另1例IgE水平非常高，抗IgE受体的抗体水平也高。

3例均按推荐方案给药，结果：

2例在治疗1周后症状完全消失，另1例在6周消失，治疗后异常的抗IgE受体的抗体水平均恢复正常。

ShairoCA等报告6例严重性荨麻疹伴有或不伴有水肿病例，这些患者或者对免疫抑制剂无效或者拒绝，按照哮喘的方法和剂量给药，间隔时间依据荨麻疹或水肿的复发情况而定，5/6的患者在治疗1周所有症状被控制，逐渐停用其它药物，1例无效，绝大多数患者在6个月后停药无复发。

另有研究显示,输注英夫利昔单抗（Infliximab）可快速、显著缓解顽固性银屑病、关节炎病人的关节和皮损症状。

图幼年脊柱关节病使用英夫利昔单抗

又如单抗8H8一种抗登革热病毒核衣壳蛋白（C蛋白）的单抗对登革热病和登革热出血热/失血性休克综合征的早期诊断和治疗均有一定效果。

在艾滋病的治疗上，利用基因工程手段制备的中和抗体F425-B4e8（B4e8），可以中和艾滋病病毒1上的抗原表位，阻止艾滋病病毒1对人体正常组织的感染。

对自身免疫性疾病的治疗，单抗药物能够与黏附分子、激活标记、抗原或受体靶分子结合，能在分子水平上调节免疫病理反应，从而干扰炎性反应的发生。

还有治疗感染性休克和脓毒血症的单抗，个别也有治疗类风湿性关节炎、Ⅰ型糖尿病和肠炎的单抗。

此外，还有临床试用于预防器官移植抗排异反应、抗血小板凝集和艾滋病的单抗。

3.3抗肿瘤单抗偶联物（生物导弹）

抗肿瘤单抗耦联物免疫耦联物分子由单抗与两部分构成。

可用作“弹头”的物质主要有三类，即放射性核素、药物和毒素;与单抗连接分别构成放射免疫耦联物、化学免疫耦联物和免疫毒素。

此外,酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物也已进入肿瘤治疗的研究畴。

单抗靶向治疗作用方式

（一）、直接作用：

通过抗体依赖性细胞介导细胞毒（ADCC）、补体依赖细胞毒（CDC）的细胞溶解效应杀伤肿瘤细胞。

（二）、间接作用：

单抗作为靶向载体，偶联细胞毒药物（放射性核素、化疗药物、毒素等）。

靶向肿瘤后利用细胞毒杀伤肿瘤细胞。

放射免疫治疗的作用机理主要是间接作用。

1、免疫偶联物放射免疫治疗（RIT）

放射免疫耦联物放射性免疫耦联物是以单克隆抗体为载体,以放射性核素为弹头,通过抗体特异性结合肿瘤细胞相关抗原,将产生高能射线的放射性核素靶向到肿瘤细胞,借助放射性同位素的电离辐射效应杀伤肿瘤细胞或抑制其生长，同时又降低对正常组织的放射性损伤。

实现对肿瘤的近距离照射治疗。

RIT利用携带放射性核素的单克隆抗体特异地结合到病灶部位,减少了对正常组织的损伤。

如在前列腺癌治疗中应用最广泛的抗前列腺特异性膜

抗原的单抗,其CYT-356为最早制备的一种单抗。

图放射免疫治疗

图131I-肿瘤细胞核人鼠嵌合单抗脑胶质瘤免疫导向放疗

2、免疫毒素

免疫毒素是用化学方法或基因工程方法将肿瘤选择性单抗与经修饰的多肽毒素共价连接而成的肿瘤治疗药物。

免疫毒素可与肿瘤细胞表面受体或与细胞表面的靶抗原相结合后化,继而在胞抑制细胞蛋白质合成,导致肿瘤细胞死亡。

毒素有很多种,如植物毒素、细菌毒素、动物毒素。

国将肺癌单抗与蓖麻毒素、相思子毒素和抗癌药如阿霉素、丝裂霉素、氨甲喋呤等偶联成功。

图针对CD25的免疫毒素

3、化学免疫偶联物单抗

化学免疫耦联物单抗与药物耦联物对肿瘤靶细胞显示选择性杀伤作用，它是药物良好的靶向性载体,通过药物分子上特殊的功能基团如:

羟基、巯基、氨基等,将治疗药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物,避免了药物对其他正常组织的毒害作用,选择性地发挥治疗作用。

它对表达有关抗原的肿瘤细胞作用强，对抗原性无关细胞的作用弱或无作用。

单抗与药物耦联物对肿瘤细胞的杀伤活性比无关抗体与药物耦联物的活性强;药物与单抗耦联后对肿瘤靶细胞的活性比游离药物强。

常与单抗进行偶联的药物有阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。

生物制品研究所应用微分子右旋糖酐作联桥将柔红霉素偶联到单抗WT1上，组成单抗－柔红霉素偶联物。

3.4展望

单克隆抗体的这些特征使它成为未来治疗学上研究的热点。

在过去的几十年里,从鼠源性单抗到全人源性抗体,单抗在制备技术上取得了较大的进展。

鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生一系列的急性反应,使药物的功效降低。

全人单克隆抗体是制备单克隆抗体的一种新技术。

它减少了鼠基因序列及抗抗体反应,提高了单克隆抗体的功效和安全性。

虽然单抗药物还存在一些尚未解决的问题,最突出的问题是如何降低单抗的免疫原性,单抗的异源性所引起的抗体反应,不但降低了单抗的效价,而且会给患者带来严重的后果。

但是随着抗体疗效不断提高,生产工艺不断成熟,单抗类药物必将为全球疾病患者带来更大的希望。

因此,对异源性单抗进行改造以及人源性单抗的研制成为单抗研究的重要方向。

相信在未来的几年里,全人源性单抗将作为一种新的产物更多地用于疾病的诊断、治疗及研究。