天然药物化学实验课程教案.docx
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天然药物化学实验课程教案
天然药物化学实验课程教案
武汉生物工程学院天然药物化学实验课程教案
课程基本信息
授课时间2015年3月8日-2015年7月3日教案编写时间2015年2月28日
课程名称
天然药物化学实验
课程代码
总学时32
讲课：
学时
实验：
32学时
实习：
周
学分
2
课程性质
必修课（√）选修课（）
理论课（）实验课（√）
任课教师
职称
授课对象
专业：
制药工程年级：
2012级
班级：
2012本科
教材及主要参考资料
教材：
自编
参考资料：
天然药物化学实验中国医药科技出版社杨月主编（2010）
天然药物化学实验与指导中国医药科技出版社梁敬钰主编（2011）
天然药物化学实验中国医药科技出版社 李嘉蓉主编（2010）
教学目的
和教学要求
1、重点掌握中药中各类成分的提取分离、化学鉴定和薄层检视的基本理论和基本方法。
2、熟悉中药所含有效成分的结构鉴定方法。
3、进一步掌握理论所学到的知识。
教学重点
和难点
1、各种有效成分结构类型、理化性质。
2、提取分离、鉴定的方法。
3、各类成分提取时的注意事项。
章节备课
实验内容不分先后
蒽醌类成分的提取分离与鉴别
一、教学目的和要求
学习羟基蒽醌类化合物的提取分离和检识，通过实验要求：
1．掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。
2．掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。
3．掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。
4．熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。
二、教学重点和难点
重点：
蒽醌类物质的基本性质
难点：
pH梯度萃取法的原理和适用性
三、实验方法和原理
本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH梯度萃取法将其分离。
其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。
大黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim.exReg.和药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根及根茎。
大黄中含有大黄酸、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚及其苷，总含量约3％～5％。
1．大黄酸（rhein）分子式C15H8O6，分子量284.21。
黄色针状结晶（升华法），mp.321～322℃，330℃分解。
能溶于碱水、吡啶，略溶于乙醇、苯、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。
2．大黄素（emodin）分子式C15H10O5，分子量270.23。
橙色针状结晶（乙醇），mp.256～257℃，能升华。
易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。
3．芦荟大黄素（aloe-emodin）分子式C16H10O5，分子量270.23。
橙色针状结晶（甲苯），mp.223～224℃。
易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。
4．大黄酚（chrysophanol）分子式C15H10O4，分子量254.23。
橙黄色六方形或单斜结晶（乙醇或苯），mp.196～197℃，能升华。
易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。
5．大黄素甲醚（physcion）分子式C16H12O5，分子量284.26。
砖红色单斜针状结晶，mp.203～207℃，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
四、实验仪器和材料
仪器：
烧杯，研钵，玻棒，滤纸，棉花，纱布，布氏漏斗，分液漏斗，烧瓶，冷凝管，铁架台，铁圈，双紧丝，烧瓶夹，显色剂喷瓶，薄层层析缸，硅胶GF254薄层板，电炉，水浴锅，循环水真空泵，紫外灯等。
。
材料：
大黄，硫酸，二氯甲烷，盐酸，缓冲液（pH8、pH10），碳酸氢钠，氢氧化钾，醋酸镁，石油醚，乙酸乙酯，硅胶GF254，CMC-Na，大黄酸标准品，大黄素标准品，芦荟大黄素标准品，大黄素甲醚标准品，大黄酚标准品等。
五、实验内容
（一）大黄中游离蒽醌的提取
（1）水解：
称取大黄粗粉50g，置于500mL圆底烧瓶中加20%硫酸溶液100ml直火回流40min，冷却后减压滤过，弃去滤液。
（2）萃取：
将滤渣于60℃低温干燥30min，置于干燥500mL圆底烧瓶中加入二氯甲烷200mL，40℃水浴回流40min，放冷，用干燥滤器减压滤过。
（二）PH梯度萃取法分离游离蒽醌
1．大黄酸的分离将氯仿提取液置500ml分液漏斗中，加pH8缓冲液200ml充分振摇，静置至彻底分层，分出碱水层置250ml锥形瓶中，在搅拌下加20%盐酸调pH2，放置沉淀完全，抽滤得大黄酸（A）沉淀。
2．大黄素的分离将分离出大黄酸的氯仿层用pH10缓冲液300ml振摇萃取两次，静置分层，分出碱水层，用20%盐酸调pH2，放置析出大黄素（B）沉淀。
3．芦荟大黄素的分离将分离出大黄素的氯仿层加5%碳酸钠-5%氢氧化钠（9：
1）碱水液200ml萃取两次，静置分层，分出碱水层，用20%盐酸调pH2~3，放置析出芦荟大黄素（C）。
4．大黄素甲醚和大黄酚的分离将分离出芦荟大黄素的氯仿层用1%的氢氧化钠200ml萃取两次，静置分层，分出碱水层，用20%盐酸调pH2~3，放置析出大黄素甲醚和大黄酚的混合物（D）。
（三）大黄中蒽醌类化合物的鉴定
1．化学检识：
分别取大黄素、大黄酚等少许，用乙醇溶解，做如下反应：
A．碱液试验：
取试液1ml，加20%NaOH数滴，观察颜色。
B．醋酸镁反应：
取试样1ml，加醋酸镁试剂数滴，观察现象。
2．薄层鉴定：
吸附剂：
硅胶G－CMC-Na板
展开剂：
石油醚（30~60℃）－乙酸乙酯=（15：
5）上层溶液。
显色剂：
5%KOH喷雾。
记录：
绘出薄层层析图谱，并计算Rf值。
六、实验结果与分析
1．绘制薄层色谱图
2．通过薄层色谱图判断大黄中游离蒽醌类物质极性的大小。
七、思考题
1．大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？
为什么？
2．pH梯度萃取法的原理是什么？
适用于哪些中药成分的分离？
3．蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？
黄酮类成分的提取分离与鉴别
一、教学目的和要求
学习黄酮类化合物的提取、分离和检识，通过实验要求：
1．通过芸香苷提取与精制，掌握碱溶酸沉法提取黄酮类化合物的原理和操作。
2．掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷、苷元和糖部分的检识方法。
3．掌握由芸香苷水解制取槲皮素的方法。
二、教学重点和难点
重点：
碱溶酸沉法原理和操作，黄酮类化合物的主要性质，结晶法的操作。
难点：
芸香苷和槲皮素上3，5羟基的鉴别。
三、实验方法和原理
由槐花米中提取芸香苷的方法很多，本实验是根据芸香苷在冷水和热水中的溶解度差异的特性进行提取和精制，或根据芸香苷分子中具有酚羟基，显弱酸性，能与碱成盐而增大溶解度，以碱水为溶剂煮沸提取，其提取液加酸酸化后则芸香苷游离析出。
槐花米为豆科植物槐SophorajaponicaL.的干燥花蕾，主要含芸香苷（芦丁），含量高达12％～20％，水解生成槲皮素、葡萄糖及鼠李糖；槐花亦含芸香苷，但含量较槐米为少。
芸香苷（rutoside）：
又称芦丁，分子式C27H30O16，分子量610.51。
淡黄色针状结晶，mp.177～178℃，难溶于冷水（1∶8000），略溶于热水（1∶200），溶于热甲醇（1∶7）、冷甲醇（1∶100）、热乙醇（1∶30）、冷乙醇（1∶650），难溶于醋酸乙酯、丙酮，不溶于苯、氯仿、乙醚、石油醚等，易溶于吡啶及稀碱液中。
槲皮素（quercetin）：
又称槲皮黄素，分子式C15H10O7，分子量302.23。
黄色结晶，mp.314℃（分解）。
溶于热乙醇（1∶23）、冷乙醇（1∶300），可溶于甲醇、丙酮、醋酸乙酯、冰醋酸、吡啶等溶剂，不溶于石油醚、苯、乙醚、氯仿中，几不溶于水。
芸香苷R=－葡萄糖－鼠李糖
槲皮素R=H
四、实验仪器和材料
仪器：
烧杯，研钵，玻棒，滤纸，棉花，纱布，布氏漏斗，搪瓷杯，烧瓶，冷凝管，铁架台，铁圈，双紧丝，烧瓶夹，显色剂喷瓶，薄层层析缸，硅胶GF254薄层板，电炉，水浴锅，循环水真空泵，紫外灯等。
材料：
槐花米，硼砂，氢氧化钙，盐酸，镁粉，二氯氧化锆，柠檬酸，α-萘酚，硫酸，正丁醇，醋酸，苯胺，邻苯二甲酸，葡萄糖标准品，鼠李糖标准品等。
五、实验内容
（一）槐花米中芸香苷的提取与精制
1．提取（煎煮法）
称取槐米30g，研碎，置1000mL的搪瓷杯中，加入硼砂2g和300mL饱和石灰水加热煮沸30分钟，趁热减压滤过（棉花），残渣再用200mL饱和石灰水煮沸30分钟。
趁热减压滤过，合并两次滤液．加浓盐酸（边加边搅拌）调PH3～4，放置过夜。
次日，倾出上清液，抽滤沉淀，蒸馏水洗至PH5～6，70℃干燥，得粗芸香苷。
注意事项：
（1）本实验用碱溶酸沉法提取，加入石灰乳可以达到碱性溶解的目的，又可除去槐花米中所含的大量粘液质，但应严格控制其碱性pH8～9，不可超过pH10。
如pH值过高，加热提取过程中芸香苷可被水解破坏，降低收得率。
加酸沉淀时，控制pH3～4,不宜过低，否则芸香苷可生成烊盐而溶于水，也降低收得率。
（2）在提取过程中，加入硼砂的目的是使其与芸香苷分子中的邻二酚羟基发生络合，既保护了邻二酚羟基不被氧化破坏，又避免了邻二酚羟基与钙离子络合（芸香苷的钙络合物不溶于水），使芸香苷不受损失，提高收得率。
2．精制—结晶法（热溶冷析）
取值得芸香苷粗品，加蒸馏水300mL，煮沸至芸香苷全部溶解（热溶），趁热立即减压滤过，冷却后即可析出结晶（冷析），减压滤过，60～80℃烘干，得芸香苷精制品。
取25%精制品作为芸香苷样品（A）。
注意事项：
热溶后进行趁热滤过时，速度要快，所有滤器必须先行预热，避免滤过过程中芸香苷析出。
（二）芸香苷水解（槲皮素的制备）
取取75%精制芸香苷置500ml圆底烧瓶中加2％H2SO4100ml直火回流30分钟，（加热约数分钟后，溶液完全澄清，20分钟后又逐渐析出黄色针状结晶）减压滤过，即得槲皮素（B）。
滤液作为糖鉴定样品（C）
（三）芸香苷及槲皮素鉴定
取芸香苷（A）、槲皮素（B）少许，分别用适量乙醇溶解，制成试样溶液，及样品C（葡萄糖，鼠李糖混合液）按下列方法进行实验，比较苷元、苷和糖的反应情况。
（1）Molish反应：
取各试样溶液各2ml，分置于两支试管中，加10％α-萘酚乙醇溶液1ml，振摇后倾斜试管45°，沿管壁滴加1ml浓硫酸，静置，观察并记录两液面交界处颜色变化。
（2）盐酸-镁粉反应：
取各试样溶液各2ml，分别置于两支试管中，各加入镁粉少许，再加入盐酸数滴，观察并记录颜色变化。
（3）锆盐-柠檬酸反应：
取试样A、B溶液各2ml，分别置于两支试管中，各加2％二氯氧锆甲醇溶液3～4滴，观察颜色，然后加入2％柠檬酸甲醇溶液3～4滴，观察并记录颜色变化。
（4）糖的纸色谱检识
取糖的供试液（C）和已知葡萄糖、鼠李糖标准液进行层析。
支持剂：
新华层析滤纸
试样：
糖的供试液
对照品：
1％葡萄糖对照品水溶液、1％鼠李糖对照品水溶液
展开剂：
正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5上层）
显色剂：
喷雾苯胺-邻苯二甲酸试剂，于105℃加热10分钟显棕色或棕红色斑点。
六、实验结果与分析
1．绘制纸层析结果图。
2．将鉴定1-3号实验结果填于标
实验项目
样品
Molish反应
盐酸-镁粉反应
锆盐-柠檬酸反应
A
B
C
七、思考题
1．本实验所采用的提取方法是什么，适用于哪些物质的提取。
2．如何确定芸香苷的苷键链接在3号位上
3．纸色谱的基本原理是什么，其固定相和流动线分别是什么。
4．结晶发的主要操作是什么，操作过程中可以除去的杂质有哪些（在操作步骤中指出）。
挥发性成分的提取分离与鉴别
一、教学目的和要求
学习挥发油的提取和各类组成成分的检识，通过实验要求：
1．掌握挥发油的水蒸气蒸馏提取法。
2．学习挥发油的一般检识方法。
3．掌握挥发油中化学成分的薄层点滴定性检识。
二、教学重点和难点
重点：
挥发油中化学成分的薄层点滴定性检识
难点：
水蒸气蒸馏提取法
三、实验方法和原理
本实验是水蒸气蒸馏法提取挥发油的通法。
挥发油的组成成分较复杂，常含有烷烃、烯烃、醇、酚、醛、酮、酸、醚等官能团。
因此可以用一些检出试剂在薄层板上进行点滴试验，从而了解组成挥发油的成分类型。
挥发油中各类成分的极性互不相同，一般不含氧的烃类和萜类化合物极性较小，在薄层色谱板上可被石油醚较好的展开；而含氧的烃类和萜类化合物极性较大，不易被石油醚展开，但可被石油醚与醋酸乙酯的混合溶剂较好的展开。
为了使挥发油中各成分能在一块薄层色谱板上进行分离，常采用单向二次色谱法展开。
四、实验仪器和材料
仪器：
烧杯，研钵，剪刀，玻棒，烧瓶，冷凝管，铁架台，铁圈，双紧丝，烧瓶夹，显色剂喷瓶，薄层层析缸，挥发油测定器，硅胶GF254薄层板，电炉，水浴锅，紫外灯等。
材料：
鲜活材料（薄荷、橙子、八角等），乙醇，石油醚，乙酸乙酯，香草醛，硫酸等。
五、实验内容（薄荷）
（一）薄荷挥发油的提取
取薄荷40g，装入1000ml圆底烧瓶内，加水350ml，摇匀，按图1（挥发油测定装置操作，直热提取1小时，放置30分钟读数，并记算提取率（V/W）。
附：
挥发油测定法
测定用的供试品，除另有规定外．须粉碎使能通过二至三号筛．并混合均匀。
仪器装置如图，A为1000ml的硬质圆底烧瓶，上接挥发油测定器B，B的上端连接冷疑管C。
以上各部均用玻璃磨口连接。
测定器B应具有0.1ml的刻度。
全部仪器应充分洗净，并检查接合部分是否严密，以防油分逸出。
（注：
装置中挥发油测定器的支管分岔处应与基准线平行）。
（二）薄荷挥发油分析
取薄荷油少许，以石油醚溶解（备用），取于105℃活化1小时的硅胶G-CMC板，取上述薄荷油石油醚溶液点样，以石油醚-乙酸乙醋（18：
2）展开，至前沿达12cm，取出挥干，喷5％香草醛溶液，120℃加热5分钟，观察显出斑点，记录并绘图。
六、实验结果与分析
绘制TLC色谱图。
七、思考题
1．简述挥发油的组成.
2．实验如何操作能得到更多斑点？
生物碱类成分的提取分离与鉴别
一、教学目的和要求
学习提取精制和检识黄连中的小檗碱，通过实验要求：
1．掌握生物碱的的结构特点和理化性质。
2．熟悉渗漉法、盐析法、结晶法的基本操作过程及注意事项。
3．解生物碱的的检识方法。
二、教学重点和难点
重点：
生物碱的基本性质
难点：
渗漉法、盐析法的基本操作
三、实验方法和原理
小檗碱（berberine）：
分子式（C20H18NO4）＋，分子量336.37。
系季铵生物碱。
游离小檗碱为黄色针状结晶（乙醚），mp.145℃，能缓缓溶于冷水（1∶20），可溶于冷乙醇（1∶100），易溶于热水或热乙醇，难溶于丙酮、氯仿、苯，几乎不溶于石油醚。
盐酸小檗碱（C20H17NO4·HCl·2H2O），为黄色结晶，微溶于冷水（1∶500），易溶于沸水，几乎不溶于冷乙醇、氯仿和乙醚。
硫酸小檗碱（（C20H18NO4）2·SO4·3H2O），溶于水（1∶30），溶于乙醇。
重硫酸小檗碱（C20H18NO4·HSO4）为黄色结晶或粉末，溶于水（1∶150），微溶于乙醚。
小檗碱木兰碱
根据上述性质，盐酸盐在水中溶解度小，而小檗碱的硫酸盐水中溶解度较大。
因此，从植物原料中提取小檗碱时常用稀硫酸水溶液浸泡或渗漉，然后向提取液中加入10％的食盐，在盐析的同时，也提供了氯离子，使其硫酸盐转变为氯化小檗碱（即盐酸小檗碱）而析出。
防己中主要含有粉防己碱和防己诺林碱。
粉防己碱又称粉防己甲素，在防己中的含量约为1％，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿，溶于乙醚、苯等有机溶剂，几乎不溶于水和石油醚。
防己诺林碱又称粉防己乙素，在防己中的含量约为0.5％。
溶解度与粉防己碱相似，因多一个酚羟基，故极性较粉防己碱稍大，可利用此性质相互分离。
四、实验仪器和材料
仪器：
烧杯，研钵，玻棒，滤纸，棉花，纱布，布氏漏斗，试管，搪瓷杯，渗漉筒，铁架台，铁圈，双紧丝，烧瓶夹，显色剂喷瓶，薄层层析缸，硅胶GF254薄层板，电炉，水浴锅，循环水真空泵，紫外灯等。
材料：
黄连，防己，氢氧化钙，盐酸，二氯甲烷，硫酸，碘化铋钾等。
五、实验内容
（一）季铵型生物碱的提取分离与精制
1．盐酸小檗碱的提取、精制。
取黄柏粗粉30g置于烧杯中，加入适量石灰乳湿润药粉15min，装入渗漉筒中（压紧），再加入8倍量水浸渍30min，以5ml/min流速渗漉。
收集渗漉液300ml，加浓盐酸调pH2~3，再加入渗漉液总体积10%（w/v）的氯化钠，搅拌溶解后放置过夜，抽滤，得盐酸小檗碱粗品。
取盐酸小檗碱粗品放入适宜烧杯中，加入50倍量蒸馏水，加热溶解，趁热抽滤，加浓盐酸调pH2~3，静置1个小时，过滤得盐酸小檗碱。
注意事项：
（1）浸泡黄连粗粉的硫酸水溶液，一般为0.2％～0.3％为宜。
若硫酸水溶液浓度过高，小檗碱可成为重硫酸小檗碱，其溶解度（1∶150）明显较硫酸小檗碱（1∶30）小，从而影响提取效果。
硫酸水溶液浸出效果与浸渍时间有关，有报道，浸渍12小时约可浸出小檗碱80％，浸渍24小时，可浸出92％。
常规提取应浸渍多次，使小檗碱提取完全，本实验中只收集第一次浸出液。
（2）进行盐析时，加入氯化钠的量，以提取液量的10％（g/v）计算，即可达到析出盐酸小檗碱的目的。
氯化钠的用量不可过多，否则溶液的相对密度增大，造成析出的盐酸小檗碱结晶呈悬浮状态难以下沉。
盐析用的氯化钠用市售的精制食盐，因粗制食盐混有较多泥沙等杂质，影响产品质量。
（3）在精制盐酸小檗碱过程中，因盐酸小檗碱放冷极易析出结晶，所以加热煮沸后，应迅速抽滤或保温滤过，防止溶液在滤过过程中冷却，析出盐酸小檗碱结晶阻塞滤材，造成滤过困难，减低提取率。
（4）本实验流程也适用于以三棵针、黄柏为原料提取小檗碱，但因其小檗碱含量较低，应加大药材量，以150g以上为宜。
2．盐酸小檗碱的检识（TLC）
薄层板：
硅胶GF254薄层板
试样：
自制盐酸小檗碱乙醇溶液
对照品：
盐酸小檗碱标准品乙醇溶液
展开剂：
氯仿-甲醇-氨水（9∶1∶4d）
显色：
自然光下观察黄色斑点，紫外灯下观察荧光或经改良碘化铋钾显色后观察。
（二）叔胺型生物碱的提取分离与精制（设计性实验）
1．试根据粉防己碱和防己诺林碱的溶解性采用连续回流提取法设计从防己中提取分离防己中总生物碱，并进行精制纯化。
2．根据香豆素类成分实验中所学习的柱色谱的基本操作并查阅相关文献选择适宜的洗脱剂初步设计分离粉防己碱和防己诺林碱的基本方案。
七、思考题
1．怎样从黄连中提取分离盐酸小檗碱？
原理是什么？
2．试述小檗碱的检识方法。
3．用薄层色谱法检识小檗碱时，加氨水的目的是什么，如不加氨水可以选取哪种物质作为吸附剂。
4．分离水溶性与脂溶性生物碱的常用方法有哪些？
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