细胞生物学实验教案 1.docx
《细胞生物学实验教案 1.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞生物学实验教案 1.docx（31页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
细胞生物学实验教案1
实验一特殊光学显微镜的结构与使用
【实验安排】3学时教师讲解演示，学生操作
【目的要求】
1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的特殊部件；
2、掌握暗视野、相差和荧光显微镜的工作原理和使用方法；
3、熟悉暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的基本结构。
【实验用品】特殊显微镜、酵母、牙垢微生物、菠菜、离心机、匀浆机
【实验内容】
1、特殊光学显微镜特殊部件的构造及调节
2、特殊光学显微镜的使用及注意事项
一、暗视野显微镜：
【实验原理及使用】
１、特殊部件：
暗视野聚光器——使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。
从而使光改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。
暗视野显微镜工作原理示意图
2、用途：
暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。
这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。
这种显微镜能见到小至4～200nm的微粒子，只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。
3、使用方法：
（1）从聚光器座架上卸下明视场聚光器，换装暗视场聚光器，安装到位并固紧。
（2）把被检样品的玻片标本置于载物台上，需用油浸的暗视场聚光器，要在聚光器上透镜与载片间滴加香柏油，使之密接。
（3）聚光器光轴的调中。
聚光器的光轴要与显微镜的光轴位于同一轴线上。
其方法是，用低倍物镜对样品聚焦，随之用聚光器升降螺旋上下调节聚光器位置，当在暗视场中清晰地窥见一光环或圆形光点时，停止升降聚光器，用聚光器调中杆推动聚光器，使视场中的光环或光点，调至视场中心位置。
（4）调节聚光器焦点，使之位于被校样品处，转动聚光器升降螺旋，使视场中光环调成一最小的圆形光点，此刻即为聚光器的焦点恰于样品处。
（5）更换需用的高倍物镜进行镜检观察。
4、注意事项：
（1）聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径；否则会因物镜孔径角大于暗视场聚光器所形成的照明光束中心暗区的角度，致使部分照明光线射入物镜，破坏或降低了暗视场的照明。
（2）使用高数值孔径的油浸暗视场聚光器时，在聚光器与载片之间要滴加香柏油进行油浸，使两者密接。
否则，照明光线于聚光器的上透镜表面进行全反射，照明光线照射不到被检样品，呈现不出暗视场照明的效果。
（3）载片厚度要适宜，照明光束经暗视场聚光器后，产生空心照明光锥，即中心为暗区，而反射光的焦点在聚光器上透镜表面之上很短的距离，因此，载玻片的适宜厚度应在0.8一1.2mm。
（4）载玻片和盖片应清洁无伤痕，否则照明光线会于其处发生漫反射而影响暗视场的照明。
（5）照明光源的照明强度要高。
因暗视场照明是通过反射光照亮被检样品，若照明强度过弱照明样品的反射光强度不够，会影响观察效果，目前多应用高功率的溴钨灯作为照明光源以提高其照明强度。
二、相差显微镜：
1、原理：
在显微镜下镜检时，视场内的样品只有在反射光的波长（颜色）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。
活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。
必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化．即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。
相差方法法应用于生物学的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。
染色给活体以有害的影响，甚于失真。
因此才使相差法显得异常重要。
相差是指同—光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。
相位是指在某—时间上光的波动所达到的位置。
一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨这种差别的。
只有当变相差为振幅差（明暗之差）之后，才能被分辨。
用肉眼看不到的相差．只要利用衍射和干涉现象．把相差变为明暗的振幅差，就可能看到。
相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。
相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件；在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。
因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板，在圆形相板的平面上．有一圈与周围（里外）相板厚度不同的或凸或凹的圆环。
相板分两部分；
（1）共轭面：
通常为环状，是通过直射光的部分。
其环是凸起的，也可能是凹陷的。
（2）补偿面（comPIemQtagyare3）：
共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。
在相板的共扼面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。
当光线通过时，使光波的相位或振幅改变．从而达到不同的目的与观察效果。
利用相板把光波相位推迟，振幅改变。
相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，从而使亮度改变的作用。
物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。
在后焦面上装有种类不同的相板的物镜称为相差物镜。
2、相差显微镜特殊附件：
相差物镜、带环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜、绿色滤色镜。
（1）相差物镜：
相差物镜是显微镜特有重要装置。
相位板涂有氟化镁，可将直射光或衍射光相位推迟1/4λ。
A+相板：
将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。
明反差或负反差：
是指在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。
在被检物体的折射率大于媒质时，直射光被相板的共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质）推迟1／4波长，同时吸收80％一90％，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。
通过补偿面的衍射光没有变化，由于直射光推迟l／4波长，两者（直射光与衍射光）有完全相同的相位，合成波P等于直射光s与衍射光D之合，即P＝s十D，故振幅加大。
物像是这两种波的合成波造成，即物像等于P。
所以比只有直射光照射的背景亮得多。
B+相板：
将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，结构比周围介质更加变暗，形成暗反差（或称正反差）。
暗反差或正反差是指在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物像亮度的现象。
与明反差相反，把通过补偿面（因为在相板的补偿面上涂有改变光波相位的物质）的衍射光推迟1／4波长，使衍射光与直射光的相位相差1／2波长，同时，直射光在共轭面（上涂吸光物质）被部分吸收。
由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波（P＝s—D）振幅变小，被检物像的影像比背景显著变暗。
根据上述原理所制成的显微镜便是相差显微镜，聚光镜下面设有环状光阑．物镜后焦面装有相板。
（2）带环状光阑的转盘聚光器：
位于镜台之下。
普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑构成。
环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用。
环状光阐的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。
转换前端朝向使用者一面有标示窗（孔），转盘上的不同部位标有0、l、2、3和4或0、10、20、40和100字样，通过标示窗显现。
“0”表示非相差的明视场的普通光阑。
1或10、2或20、3或40、4或l00，表示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。
通过手动转入标示窗内之数字．表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。
（3）合轴调中望远镜：
合轴调中望远镜简称CT，又名合铀调中目镜。
它是眼透镜，可行升降调节，具有较长焦距的一种望远目镜。
镜筒较长，其直径与观察目镜相同。
它的功用仅作为环状光阑的环孔（亮环）与相差物镜相板的共扼面环孔（暗环）的调中合轴与调焦之用。
相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差物镜必须匹配，且环状光阑的环孔与相差物镜相板共扼面的环孔在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠。
以保证直射光和衍射光各行其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。
但是，镜体的光路中前述两环的影像较小、一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，需借助合轴调中望远镜。
（4）绿色滤色镜：
相差物镜的种类，从色差消除情况来分，多属消色差物镜或PL物镜，消色差物镜最佳清晰范围的光谱区为510-630nm。
欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单色光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明。
所以，使用相差物镜时在光路上加用透射光线波长为500一600nm左右的绿色滤色镜．使照明光线中的红光和蓝光被吸收。
只放过绿光，可提高物镜的分辨能力。
该滤色镜兼有吸热的作用，以利活体观察。
3、使用方法：
（1）打开光源
（2）在明视野下对光、调焦。
观察透明标本时要缩小光阑。
（3）旋转转盘聚光器，使环状光阑直径和孔宽和所使用的相差物镜相匹配，并充分开大虹彩光圈。
（4）合轴调中：
拔出一目镜，换上合轴调中望远镜，用左手固定其外筒，一边看望远镜，一边用右手升降内筒调焦，准焦时即可看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可固定望远镜。
升降聚光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，再左右前后调节光阑的侧边，使亮环和暗环完全重合。
（5）取下望远镜，换上目镜，即可进行观察。
4、注意事项：
（1）载物片必须平整、均匀；标本不能太厚，否则相差显微镜成像效果不好。
（2）标本在有水的环境中，要用水封片等，成像效果明显。
（3）载物片表面要干净，否则观察的视野中显示许多小的圆斑，影响观察效果。
（4）光路上最好加单色滤光片，在此单色光下，相差显微镜的分辨力最高。
（6）注意当换不同倍率的物镜时，都要选用相一致的相板和相环，并重新调中。
否则，相差显微镜成像效果不佳。
三、荧光显微镜
1、实验原理：
荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光，再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。
某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活，吸收能量后呈激发态。
其能量部分转化为热能或用于光化学反应外．相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。
某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。
细胞内含有少数天然荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等．经紫外线照射后可自发荧光。
还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物质，如酸性品红、甲基绿、丫叮橙等结合，经紫外线照射后可诱发出荧光。
荧光显微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置，可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。
2、荧光显微镜的基本装置
（1）光源：
采用高压汞灯。
汞灯能以最小的表面发出最大数量的紫外光和蓝光，且光亮度大，光度稳定。
（2）滤色镜系统：
按用途或功能，主要分为下列两类；
激发滤色镜：
激发滤色镜的作用，在于为被检样品的荧光染料提供最佳波段的激发光。
荧光染料均有一定的吸收光谱（激发峰值），利用滤色镜对光线选择吸收的能力．选用其透射光谱。
恰为荧光染料的最大吸收光谱（激发高峰）的激发滤色镜，以便从汞灯发出的广谱光波中选择透过最宜波段的光线供使用。
激发滤色镜加放于汞灯和二向色镜之间，物镜之前。
阻断滤色镜：
阻断滤色镜位于物镜之上，二向色镜和目镜之间．用以阻断或吸收光路中的激发光或某些波长较短的光线．以防伤害眼睛，使荧光透过。
选用的原则，以能完全阻断或吸收波长长于所需荧光的光线，并透过样品发出的荧光。
所以，阻断滤色镜的选用，应视荧光染料的荧光光谱而定，以能最大限度地透过荧光和阻断短波光。
荧光显微镜中，除上述两类滤色镜外，尚有一重要的分色镜系统——二向色镜，位于汞灯和激发滤色镜构成的平行光轴与目镜和物镜构成的垂直光轴的两轴垂直相交处，斜向安装于光路之中。
由镀膜的光学玻璃制成，其镜面方位与上述两光轴交角均呈45o，兼有透射长波光线和反射短波光线的功能。
在荧光显微术中承当色光的“分流“作用。
3、荧光显微镜的光路：
荧光显微术按激发光对样品的激发方向或方式区分为透射式和反射（落射）式两类。
实际应用上多用反射式。
透射荧光显微术光路：
透射荧光显微术是激发光束通过聚光器自下而上的透射样品，诱发的荧光从物镜前方进入物镜。
其具体光路如下：
汞灯发出的强光经集光透镜、吸热滤色镜、镜臂反光镜、激发滤色镜、光路转换反光镜后光线转射向上，进入视场光阑，暗视场聚光器，进入样品，激发出的荧光射入物镜经阻断滤色镜进入目镜。
反射荧光显微术光路又称落射荧光显微术光路：
因激发光由物镜后部进入物镜，向下落射样品．激发出荧光，荧光反射向上再进入物镜。
其光路如图2—10。
4、使用方法：
1经荧光染料染色的样品放在载物台上，先用溴钨灯透射照明，用低倍物镜聚焦，待寻找到最佳影像后，熄灭溴钨灯，改用汞灯。
2点亮汞灯，观察。
5、注意事项：
使用汞灯严禁频繁开闭，点亮后欲暂停使用时，不可切断电源，可用光阀阻断光路。
当汞灯熄灭后．不能立刻点亮，经5一l0min待汞灯冷却后再通电点亮。
使用油浸物镜时，应用无荧光浸油。
6、作业：
（1）为什么暗视场照明的视场暗黑，样品影像明亮?
（2）使用暗视场照明时，为什么必领在聚光器与载玻片间进行油浸?
（3）相差显微镜有哪些特有的附件，其构造如何？
（4）相差显微镜镜检时．为什么要用绿色滤色镜?
（5）为什么相差显微镜可以直接观察活体样品？
（6）什么是荧光?
它是怎佯发生的?
（7）荧光显微术为什么要以汞灯当光源？
（8）激发滤色镜和阻断滤色镜的功能及其区别?
两者有何关系?
（9）二向色镜的作用原理?
如何选用?
实验二血涂片的制作和细胞形态观察及细胞计数
【实验安排】（共3学时）：
1、教师讲解实习内容，示范血涂片制作、染色（约30分钟）。
2、同学两人一组，相互采血，各自独立完成血涂片制作、染色、红细胞计数（约120分钟）。
3、书写实验报告
【目的要求】
1、掌握血涂片的制备染色方法
2、认识各种血细胞的典型形态，了解细胞形态的多样性
3、掌握细胞计数板的结构和细胞计数方法
一、血涂片的制备与血细胞形态观察
【实验原理】
1、血涂片的制备：
涂片是一种基本的临时制片技术。
血涂片是血液学研究中最基本的技术。
血涂片的制作就是将血液样品制成单层细胞的涂片标本的过程。
经过瑞氏染色，对各种血细胞形态进行观察。
2、瑞氏染色原理：
瑞氏染料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。
美蓝（又名亚甲蓝mehyleneblue），通常为氯盐,即氯化美蓝，美蓝容易氧化为天青.
伊红（又名曙红cosin）通常为钠盐即伊红钠。
美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红美蓝中性沉淀,即瑞氏染料。
瑞氏染料溶于甲醇后,又重新解离为带正电的美蓝（蓝色）和带负电的伊红离子（红色）。
细胞的染色即有物理的吸附作用又有化学的亲和作用.各种细胞和细胞的各种成份化学性质不同对各种染料的亲和力也不一样.因此用染色液染色后在同一血片上可以看到各种不同的色彩
嗜酸性颗粒与酸性染料伊红结合染粉红色;
嗜碱性物质与碱性染料美蓝或天青结合,染蓝色或紫色;
中性物质成等电状态与伊红和美蓝均可结合,染紫红色;
M+CL–+Na+E–ME+NaCL
【实验用品】
1、器材：
显微镜、医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、染色缸
2、试剂：
瑞氏染液、蒸馏水、pH6.4－6.8PBS缓冲液
【方法与步骤】
1、血涂片的制备与染色观察
（1）、采血：
先用75%酒精棉球消毒左手无名指局部皮肤。
等待干后，用消毒后的刺血针刺入皮肤，深约2毫米。
待血液从针孔流出，用干棉花擦去第一滴血。
（2）、涂片：
轻轻挤压，使血液流出形成绿豆大小的血滴。
将血滴置于玻片的一端,左手持载玻片,右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。
然后使推片与载片夹角保持30-45度平稳地向前移动,载片上保留下一薄层血膜。
（3）、待干：
血涂片制成后可手持玻片在空中挥动,使血膜迅速干燥,以免血细胞皱缩.
（4）、染色：
将血膜平放在染色架上.加瑞氏染液2-3滴,使覆盖整个血膜,固定1～3分钟.滴加等量缓冲液或新鲜蒸馏水,与染料混匀染色5-10（2～5）分钟.用清水冲去染液,待自然干燥后或用吸水纸吸干,即可置血涂片于显微镜下进行镜检。
（5）、观察：
分别在低倍镜、高倍镜、油镜下观察血细胞的形态。
二、红细胞计数
【实验原理】
1、血细胞计数板的结构血细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏（Improved-Neubauer）计数板，在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。
计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。
因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米（图8-1）。
在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格，每个大方格的容积为0.1ul。
四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。
中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格（图8－2称２５×１６，也有的计数板为１６×２５的，小方格面积一致）。
中央大方格的四角及中心５个中方格（１６×２５者则为四角上的中方格）为红细胞或血小板计数范围。
2、血细胞计数：
用相应的稀释液将血液稀释若干倍，置于计数室中，在显微镜下计数一定容积内的血细胞数。
稀释血液有血细胞吸管法和试管法，本实验采用后者。
计算公式：
5个中方格内红细胞数×5×10×106×200（稀释倍数）=红细胞数/L血液
【实验用品】
1、器材：
显微镜、血细胞计数板、移液管
2、试剂：
生理盐水、抗凝全血
【方法与步骤】
1、血液稀释：
用移液管量取0.1ml抗凝全血，加入19.9ml生理盐水中稀释，混匀。
2、
充液：
取干洁的计数板，置于水平的桌面上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。
摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜。
静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃，再重新充液。
3、计数：
找到计数室位置。
采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则（图8～4）。
依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。
4、计算：
按计数室构造及血液稀释倍数,将红细胞计数结果换算成每升血液中红细胞的个数。
【实验注意事项】
1、使用玻片时只能手持玻片边缘,切勿触及玻片表面;,以保持玻片清洁,干燥,中性、无油腻。
2、细胞染色对氢离子浓度十分敏感,配制瑞氏染液必须用优质甲醇,冲洗用水应近中性,否则各种细胞染色反应异常,致使细胞的识别困难,甚至造成错误。
3、推片时用力要均匀，否则容易形成波浪状，厚薄不匀。
4、一张良好的血片,要求厚薄适宜,头体尾分明,分布均匀,边缘整齐,两侧留有空隙。
5、血膜未干透,细胞尚未牢固附在玻片上,在染色过程中容易脱落,因此血膜必需充分干燥.血片制好后最好立即固定染色,以免细胞溶解和发生退行性变。
6、染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关.染液越淡,室温越低,细胞越多,所需染色时间越长，或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定.
7、染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.
8、冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上.
9、充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计数。
10、计数板、盖玻片、吸血管、血片等用过后必须立即按要求洗涤干净。
染色结果
在正常情况下血膜外观为粉红色,在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩,细胞核染紫红色,染色质清楚,粗细松紧可辨。
染色结果偏酸,则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红,白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱,则所有细胞染成灰蓝色,颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色,甚至紫黑色或蓝色。
嗜中性颗粒偏粗,偏碱（紫黑色）.血片原处呈绿色.
【实验报告】
1、记录血涂片中各种类型细胞形态及染色结果
2、计算每升血液中红细胞的数量
实验三叶绿体的分离与观察
【实验安排】（共3学时）：
1、教师讲解（约30分钟）
2、同学六人一组，分离叶绿体
3、书写实验报告
【目的要求】
1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。
2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．并熟悉荧光显微镜的使用方法
【实验原理】
将植物组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状、稠密度，也与离心力以及悬浮介质的粘度有关。
在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。
依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。
将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些末被破碎的完整细胞。
然后在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
【实验用品】
（一）材料新鲜菠菜
（二）器材普通离心机、研钵、天平、光学显微镜、250m1烧杯2个、250m1量筒1个、滴管10支、10m1离心管10支、纱布若干、载玻片和盖片等。
（三）试剂0.35mol/LNaCl溶液，0.01%丫啶橙
【方法与步骤】
1.游离叶绿体的制备与观察
（1）选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml的0.35mol/LNaCl溶液中，装入组织捣碎机。
（2）利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3～5min。
（3）将匀浆液用6层纱布过滤，收集于500m1烧杯中。
（4）取滤液4m1在1000r/min下离心2min。
弃去沉淀。
（5）将上清液在3000r/min下离心5min。
弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。
（6）将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。
（7）取叶绿体悬液1滴滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜下观察。
（8）取叶绿体悬液1滴滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察自发荧光。
（9）取叶绿体悬液1滴加0.01%丫啶橙1滴混合后，滴于无荧光载片上，加盖片后在荧光显微镜下观察次生荧光。
2、菠菜叶手切片观察
用剃须刀将新鲜的嫩菠菜叶切削一斜面置于载片上，滴加1滴0.35mol/L的NaCL,加盖片后轻压，置显微镜下观察。
（1）在普通光镜下观察。
（2）在荧光显微镜下观察。
（3）用同样方法制片，但滴加l一2滴0.01％丫啶橙染液染色染色1min，洗去余液，荧光显微镜下观察。
3.组织中叶绿体的观察
取新鲜植物嫩叶适量，放入研钵中，加入少量的0.35mol/LNaCl溶液碾碎，用滴管吸取上层浸出液，镜下观察叶肉细胞结构中的叶绿体和保卫细胞等形态。
【实验结果】
一、叶绿体的分离与观察
1.在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2.在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色自发荧光；
3.加入丫啶橙染色后，叶绿体发出桔红色次生荧光．而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
升级会员 