呼吸道病毒7项检测试剂.docx
《呼吸道病毒7项检测试剂.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《呼吸道病毒7项检测试剂.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
呼吸道病毒7项检测试剂
上海复星医学科技发展有限公司
呼吸道病毒7项检测试剂
2011-1-10
呼吸道病毒7项检测试剂
1．概述
日常生活中，几种常见的呼吸道病毒往往给人们的工作和生活带来极大的不便，有些甚至威胁到人们的健康和生命。
在医院和急诊室中，这些呼吸道病毒也常常是诊断和治疗的难题。
常见的呼吸道病毒包括：
A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，副流感病毒1型，副流感病毒2型和副流感病毒3型。
在病毒检测方法中，抗原检测有其无法比拟的优势：
1.可以用于病毒的早期诊断，这对治疗非常重要；2.快速、简便的诊断方法，短时间内得出结果，节省实验室的劳动力和成本。
DHI公司的D3UltraDFA试剂属于抗原检测中的直接免疫荧光法。
该试剂可以同时筛查和鉴定出常见的7种呼吸道病毒。
D3UltraDFA试剂主要的测试对象为婴幼儿和儿童，所以目标客户群体为：
儿童医院、妇幼保健院和有儿科的三甲医院。
2．D3UltraDFA试剂
2.1D3UltraDFA试剂规格
D3UltraDFA试剂分为7项呼吸道病毒筛查试剂和7项呼吸道病毒鉴定试剂。
检测病毒种类：
A型（甲型）流感病毒，B型（乙型）流感病毒，呼吸道合胞病毒（RSV），腺病毒，1、2、3型副流感病毒。
具体规格如下：
筛查试剂：
10mL，可用于400次测试
鉴定试剂：
每项鉴定试剂2mLX7，可用于80次测试
另外，每盒试剂中含有40x浓缩洗液25mL，固定液15mL，正常鼠丙种球蛋白试剂10mL（用于阴性质控），含有7种呼吸道病毒抗原的阳性质控板5块。
2.2D3UltraDFA试剂用途
D3UltraDFA试剂能对疑似呼吸道病毒感染的患者进行快速的病毒筛查和鉴定。
及时、准确地诊断对于病人的治疗非常重要，这主要体现在以下几点：
1、病毒治疗针对性强
金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）等是抗流感病毒的特效药。
RSV和副流感病毒可以使用利巴韦林和免疫球蛋白进行治疗。
目前没有专门的抗腺病毒药物，主要采取支持疗法。
2、病毒治疗有时效性
大部分呼吸道病毒越早治疗效果越好。
比如，奥司他韦在体内的活性形式是一种强效的高选择性的流感病毒NA抑制剂，它主要通过干扰病毒从被感染的宿主细胞中释放，从而减少甲型或乙型流感病毒的传播。
因此，在出现流感症状的48小时内使用奥司他韦才有用，过了这个时间段后疗效甚微。
3、避免抗生素的滥用
病毒不同于细菌、衣原体、支原体等原核生物，其对抗生素不敏感，不能使用抗生素进行治疗。
准确的诊断能帮助医生确定是否使用抗生素来治疗病人。
2.3D3UltraDFA试剂特点和优势
1、产品几乎覆盖了所有常见呼吸道病毒的诊断
2、采用直接免疫荧光法，较其他检测方法有较大优势（详见表一）
3、实验步骤较简便，在短时间内能得出结果，从而帮助医生更好地治疗病人
4、使用质量优异的抗体，染色步骤仅需15分钟，大大节省了实验室的劳动力和成本，同时提高了临床诊断的成功率，减少重复实验
5、可以监控感染的大规模流行
6、拥有强大的科研团队，不断研制和改进单克隆抗体
表1、几种常用检测方法的比较
检测方法
优点
缺点
病毒分离培养
特异性高
耗时耗力，灵敏度较低
抗原检测
酶联免疫吸附法
较快速、简便
有非特异性反应
间接免疫荧光法
较快速
有非特异性反应
直接免疫荧光法（D3UltraDFA试剂）
快速、简便，灵敏度和特异性均较高
需要使用荧光显微镜
血清学检测
快速、特异性较高
对疾病初期诊断没有太大帮助
分子生物学方法
较快速，灵敏度和特异性均较高
操作繁琐，价格昂贵
2.4D3UltraDFA试剂实验操作步骤
1、样品准备步骤：
①将样本充分震荡混匀约10-15秒。
②在400-600xg转速下离心5-10分钟。
③弃上清（如果预留上清可用于细胞培养）。
④在沉淀中加5mLPBS缓冲液（请使用普通PBS，不要使用试剂盒内配套的浓缩洗液），充分震荡混匀约10-15秒。
⑤在400-600xg转速下离心5-10分钟。
⑥吸走上清和黏液层，小心不要吸到沉淀。
⑦重复步骤4到6，直至黏液层被完全去除。
注意：
一定要将黏液去除干净，否则会造成非特异荧光从而影响实验结果。
⑧在沉淀中加0.5到1mL的PBS缓冲液。
⑨用移液器反复吹吸来重悬细胞沉淀，形成一个略混浊的悬液。
这个悬浊液可用于直接样本测试。
2、直接样本测试步骤：
①在2孔或8孔板上的每孔内滴加25µL的细胞悬浊液。
②样本完全风干。
③在20ºC到25ºC，用预冷的100%丙酮固定细胞约5到10分钟。
注意：
丙酮是易挥发、可燃性物质，使用时请远离明火。
④从丙酮中取出载玻片并风干。
⑤在固定并风干的细胞上滴加一滴DFA染色试剂（如图1），使其完全覆盖细胞（注意：
2孔或8孔板上有一孔是阴性对照孔，请勿滴加DFA染色试剂）。
⑥在呼吸道病毒抗原对照板的每孔内也要滴加DFA染色试剂。
抗原对照板包含了被病毒感染的细胞和未感染的细胞，只能一次性使用。
⑦在阴性对照孔内滴加正常鼠丙种球蛋白试剂，使其完全覆盖细胞。
⑧将载玻片放于35ºC到37ºC的恒温箱内孵育15到30分钟，为保持其湿润最好放置于带盖的盒子内。
⑨用事先稀释好的洗液漂洗染色细胞。
为了更有效地洗涤，请将玻片在洗液中反复浸蘸4次左右。
⑩使用新的1X洗液再洗一次。
⑪用去离子水再洗一遍。
图1、在玻璃板上滴加D3UltraDFA染色试剂
3、观察实验结果
滴加2到3滴固定液，并加盖盖玻片（20X50mm），要注意避免产生气泡。
在200倍放大荧光显微镜下观察结果。
2.5D3UltraDFA试剂实验结果判读
带FITC标记的抗体在荧光显微镜下会呈现明亮的绿色，如果细胞表面存在病毒抗原，染色后就会显绿色。
在荧光显微镜下，感染不同病毒的细胞会呈现独有的特征（如图2）。
图2、显微镜下观察染色细胞（注：
根据不同荧光显微镜，背景色不一定为红色）
3．D3UltraDFA试剂竞争优势
3.1检验的特异性和灵敏度
检验的特异性:
用D3UltraDFA呼吸道病毒筛查和鉴定试剂对多种细胞和微生物进行交叉反应测试。
对64种病毒、18种细胞、19种细菌均没有交叉反应。
检验的灵敏度：
荧光标记的单克隆抗体平均能检测出病毒的最低浓度约为1.0PFU。
3.2市场竞争
主要竞争对手为西班牙Vircell公司的9项呼吸道产品。
D3UltraDFA试剂与其主要有两点不同：
1.检测项目不同；2.检测原理不同
1、Vircell产品检测项目除了以上7种病毒外，还包含肺炎衣原体、支原体等原核生物检测项目。
但是，90%的感冒是由病毒引起的。
如果是细菌、衣原体、支原体等感染，一般白细胞和C-反应蛋白（CRP）都会显著升高，而病毒感染，这两项指标一般不会升高。
我们建议医生可以先做血常规或者CRP检测，这样就能区分是病毒还是细菌感染，而这两项测试不仅快速（一般20-30分钟），而且价格相对便宜。
2、D3UltraDFA试剂的检测原理是用荧光（FITC）标记的单克隆抗体检测病毒抗原，属于直接荧光免疫法。
Vircell产品的检测原理是用抗原检测抗体（IgM），使用的方法是间接免疫荧光法。
虽然检测IgM能区分出是既往感染还是急性感染，但是抗体产生的个体差异较大，特别是1岁以下的婴幼儿和有免疫缺陷的人群，其抗体往往产生较慢。
短时间内，在体内抗体不足的情况下，可能会出现假阴性，从而错过了治疗的最佳时期。
甲型流感病毒其表面抗原变异较快，而人体往往不能及时产生针对新毒株的抗体，这时也会造成假阴性。
间接免疫荧光法会增加非特异性反应的几率。
表2、Vircell与D3UltraDFA试剂对比
Vircell
D3UltraDFA
检测项目
9项呼吸道病原体，其中包含在我国发病率很低的Q热立克次氏体
只检测呼吸道病毒，降低患者的看病成本，患者更易接受
检测原理
需要体内产生抗体后才能检测出病原体，如果抗体产生较慢或者无抗体产生会有假阴性
只要有病原体存在即可检测，可在发病早期进行快速诊断
临床意义*
作为回顾性诊断，对病例的早期诊断意义不大
可用于疾病早期诊断，对患者的治疗有重大意义
检测灵敏度
不能很好地检测变异的病毒
将多种抗体进行组合，能更好地应对变异的病毒，在多项检测项目中灵敏度达到100%
检测方法
间接免疫荧光法，二抗的使用会增加非特异性反应
直接免疫荧光法，特异性提高
实验步骤
二抗的使用让实验步骤变得较为繁琐
一步染色，不易交叉污染
*备注：
引用自《流行性感冒诊断与治疗指南（2011年版）》
附录1七种病毒检测的临床意义
流感病毒侵入呼吸道，经1-2天的潜伏期，感染者即可出现流感症状。
病毒在上皮细胞内复制，很少入血，但可释放内毒素样物质入血，引起全身中毒症状：
发热、头痛、全身酸痛、疲乏无力、白细胞数下降等。
幼儿或年老体弱病人感染流感病毒易继发细菌感染，如合并肺炎等，病死率高。
婴幼儿特别是2-6个月的婴儿对RSV特别敏感，常引起较为严重的呼吸道疾病，如细支气管炎、肺炎等，患儿常出现呼吸暂停，气管或细支气管坏死物与粘液、纤维蛋白等结集在一起，极易阻塞患儿的呼吸道，严重者造成死亡。
在我国RSV还是引发流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起婴幼儿尤其是新生儿较高的死率。
腺病毒主要引起呼吸道感染，症状有急性发烧、咽炎、扁桃体炎等。
腺病毒肺炎约占儿童期肺炎的10%，多由腺病毒3、7型引起；婴幼儿腺病毒肺炎的病死率为8%-10%。
除呼吸道疾病外，腺病毒亦可引起其他疾病，如流行性角膜炎、出血性结膜炎、急性滤泡性结膜炎等。
腺病毒与婴幼儿胃肠道疾病也有可能相关，包括阑尾炎、急性胃肠炎，有时可引起脑炎和脑膜炎、出血性膀胱炎等。
副流感病毒是引起小儿急性呼吸道感染的常见病因，仅次于RSV。
副流感1、2型是哮喘的主要病因，以2-4岁儿童中最为严重。
副流感3型，亦可引起哮喘，但主要易引起婴幼儿支气管炎、肺炎，并以1岁以内的婴儿较为严重。
病毒及其对应抗病毒药
病毒种类
抗病毒药物
流感病毒
金刚烷乙胺、瑞乐沙、奥司他韦（达菲）
呼吸道合胞病毒
利巴韦林喷雾剂
副流感病毒
病情严重者可使用利巴韦林
腺病毒
没有专门的抗病毒药物，主要采取支持疗法
附录2实验室所需设备清单（试剂盒中不含）
此列表中的器材和试剂是实验所必需的，但是未包含在试剂盒中，需要单独购买。
器材和试剂
规格
1
鼻咽拭子
建议使用DHI配套鼻咽拭子
2
载玻片
约70mmX20mm
3
盖玻片
约50mmX20mm
4
生物安全柜
2级
5
恒温培养箱
35ºC-37ºC
6
离心机
管式
7
荧光显微镜
可以看FITC（490/520nm），总200倍光学变焦
8
烧杯
多种，用于洗玻片
9
量筒
1L（配置洗液）
10
带盖瓶
1L（储存稀释洗液）
11
加样枪和枪头
多种
12
丙酮
纯度100%
13
普通PBS溶液
0.01M（Na2HPO4,KH2PO4），pH7.4
14
去离子水
15
乳胶手套
16
镊子
附录3进口荧光显微镜参数
生产厂商
DigitalBio
产地
韩国
电源
AC100-240V，50-60Hz
CPU
AMDAU1250
放大倍数
约200倍
光源
白色/蓝色LED，寿命达40,000小时
激发波长488nm，发射波长520nm
摄像头
130万像素CMOS（1280X1024）
显示器
7寸TFT-LCD，分辨率800X480
重量
<5kg
体积
240X350X320mm
数据储存
8GSD卡
升级会员 