纸色谱法实验报告doc.docx

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纸色谱法实验报告doc

纸色谱法实验报告

篇一：

实验六纸层析法观察转氨基作用实验报告

　　实验六纸层析法观察转氨基作用

　　【实验名称】：

纸层析法观察转氨基作用

　　09救援一班第三大组李岚宇XX222336

　　室温：

28°

（一）实验目的：

　　1、学习氨基酸纸层析的基本原理。

　　2、掌握氨基酸纸层析的操作原理。

（二）实验原理：

　　转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应，在转氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸与α-酮基的互换反应称为转氨基作用。

转氨基作用广泛地存在于机体各组织器官中，是体内氨基酸代谢的重要途径。

氨基酸反应时均由专一的转氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基转移到另一α－酮基酸上。

各种转氨酶的活性不同，其中肝脏的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化如下反应：

　　α—酮戊二酸+丙氨酸谷氨酸+丙酮酸

　　本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸为底物，加肝匀浆保温后，用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。

纸层析属于分配层析。

以滤纸为支持物，滤纸纤维与水亲合力强，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。

有机溶剂与水不相溶，把预分离物质加到滤纸的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续、动态的不断分配。

由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中，分配趋势较大的组分，随流动相移动的速度就慢，反之，在流动相分配趋势较大的成分，移动速度快，最终不同的组分彼此分离，物质在纸上移动的速率可以用比值Rf表示：

?

?

?

?

ALT

　　物质在一定的溶液中的分配系数是一定的，故比值Rf也相对稳定，因此在同一层析体系中可用Rf值来鉴定被分离的物质。

　　（三）实验材料与仪器：

　　试剂：

　　1、0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液。

　　2、0.2mol/LNa2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混匀,用蒸馏水稀释20倍。

　　3、0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中,以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至100ml。

　　4、0.1mol/Lα－酮戊二酸称取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后，加磷酸盐缓冲液至100ml。

　　5、0.1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液中，以1.0NNaOH仔细调至pH7.4后,加磷酸盐缓冲液至50ml。

　　6、0.5%茚三酮溶液称取茚三酮0.5克于100ml丙酮中溶解。

　　7、层析溶剂：

将重蒸过的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震荡，静置24小时后分层，将下部酚层转移到瓶中备用。

　　仪器：

玻璃匀浆器、10ml试管、培养皿、表面皿、沸水浴锅、37℃恒温水浴箱、9cm圆滤纸、烘箱、手术剪刀、分液漏斗。

　　（四）实验步骤:

　　1、肝匀浆制备：

取新鲜动物肝0.5克,剪碎后放入匀浆器,加入冷0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液1.0ml,迅速研成匀浆，用上述缓冲液4.5ml混匀备用。

　　2、酶促反应过程

（1）取离心管两支，编号：

1（测定管）、2（对照管），各加肝匀浆0.5ml。

把对照管放沸水浴中加热10分钟，取出冷却。

（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5ml,0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml,0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液

　　1.5ml,摇匀。

　　（3）37℃保温，30分钟后取出，保温完毕。

　　（4）把测定管放沸水浴中煮10分钟，取出后冷却，过滤。

　　3、层析

（1）取圆形滤纸一张（直径9cm）放洁白纸上，以圆点为中心，约1cm为半径,用铅笔划一圆线作为基线,在线上四等份处标清四点编号作为点样原点。

（2）点样：

用四根毛细玻璃管分别进行点样。

把丙氨酸液、谷氨酸液分别点在原点2、4处。

把测定液、对照液分别点在原点1、3处。

注意斑点不宜过大（应在直径0.5cm以下）。

在第一次点样点干后，再在原处同样点第2次。

　　（3）层析：

先在滤纸圆心处打一小孔（铅笔芯粗细），再取滤纸一条卷成捻如灯芯状,上端插入滤纸中心孔中，下端剪成须状。

　　（4）把滤纸平放在上述培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，盖上培养皿盖。

可见层析液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散。

当层析液前缘到离滤纸边缘约1cm时，约25分钟，取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，放入烘箱中烘干。

　　（5）显色：

将上述滤纸平放在培养皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部湿润，再放入烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置，及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。

　　（五）实验结果记录：

　　图

（1）

　　（六）实验讨论：

　　1、从表格

（1）中可以看出，测定管上清液点样出现了两个色斑，根据Rf值的计算也可以看出，测定管中氨基酸发生了转氨基作用，生成的未知物质b为谷氨酸，则未知溶质a为丙氨酸；对照管中因为酶的失活而没有发生转氨基反应，只有丙氨酸，所以色斑只有一个。

　　2、层析点样时手要洗净，操作中尽可能少量接触滤纸，以免污染。

　　3、层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。

　　4、点样点不宜过大，直径小于0.5cm.

　　XX年9月19日

篇二：

实验六氨基酸的纸层析法

　　氨基酸的纸层析法

　　一．目的

　　了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。

　　二、原理

　　以滤纸为支持物的层析法，称为纸层析法。

纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。

展层时，水为静止相，他与滤纸纤维亲和力强；有机溶剂为流动相，它与滤纸纤维亲和力弱。

有机溶剂在滤纸上又下向上移动的，称为上行法；有上向下移动的，称为下行法。

将样品在滤纸上确定的原点处展层，由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配，且他们的分离系数各不相同，所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同，于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来，形成距原点不等的层析点。

　　在一定条件下（室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变），不同的氨基酸有固定的移动速率（Rf值）Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

用混合氨基酸做样品时，如果只用一种溶剂展层，由于某些氨基酸的移动速率相同或相近，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，可将滤纸旋转90度，以第一次所的层析点为原点，在用另一溶剂展层，从而达到分离的目的。

这种方法称为双向层析法。

　　本试验主要介绍的是单向层析法。

其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。

　　三、实验仪器

　　1、新华滤纸

　　2、层析缸

　　3、细线

　　4、点样管

　　5、橡皮筋

　　6、电吹风

　　7、喷雾器

　　四、实验试剂

　　1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）

　　2、展层剂：

正丁醇：

12%氨水：

95%乙醇：

蒸馏水=13：

3：

3：

1（v:

v）

　　3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液：

0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮，贮于棕色瓶中

　　五、实验步骤

　　1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张，在一端打孔，系一根细线，在另一端2~3cm处用铅笔画一横线，中间画一圆点（原点）。

　　2、取毛细管一支（回收），吸取氨基酸混合液，在原点处点样，样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干，点2~3次为佳。

　　3、点样（原文来自：

wWw.xiaOcAofANweN.coM小草范文网:

纸色谱法实验报告）后将滤纸放入层析缸中展层，注意点样线要高于层析液面，滤纸不要贴在层析缸璧上，当展层至另一端1~2cm处时，停止展层（大约2~3小时）。

　　4、取出滤纸，用铅笔记下溶剂前沿，然后用热风吹干（或烘箱60℃）烘干。

　　5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液，注意使溶液不倒流，不间断。

　　6、用吹风机吹干，观察层析点，确定其几何中心。

　　7、量取数值，计算各自的Rf值，与表中标准氨基酸Rf值比较，确定样品氨基酸种类。

（书上图谱横着看）

　　六．实验结果

　　H1=1.0cmH2=4.4cmH3=5.0cmH4=0.99cmH=11.7cm

　　由此可得

　　Rf1=0.08547

　　Rf2=0.37607

　　Rf3=0.42735

　　Rf4=0.08461

　　据此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）组成。

　　七．实验分析

　　实验中出现了拖尾的现象。

　　拖尾现象是指展层，显色后在层析分配图上，所看到的某一种氨基酸的分子位移，不是如标准图谱所示的那样，完整地显示在某一位置上，而是形成象笤帚似的那样，前端粗圆而逐渐细小下来，宛如拖着一个尾巴。

其图所呈颜色也是由浓渐淡。

　　图象的出现，是在实验中对影响Rf值的主要因素要求，掌握不够所致。

诸如，物质结构与极性对Rf值的影响，层析溶剂对Rf值的影响，PH对Rf值的影响（溶剂、滤纸和样品的PH值），温度对Rf值的影响，滤纸的质地是否均匀，薄厚是否适当，纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响，展层的方式（上行、下行）对Rf值的影响。

然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出现拖尾现象。

此时，这就需要从具体操作规范方面，诸如样品的处理，点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索，经仔细分析，样品的处理是为除去杂质纯化样品，达到层析分

　　配某氨基酸的情晰显色图像；展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行，使样品达到一个适当的位移，便于在显色后从图象上，区分不同样品的氨基酸；显色是在用配制好的，与水不相混合，并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。

更何况显色剂又是含水量极低，不会影响洋品的斑点扩散，那么问题就集中在点样这个操作程序上了。

点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液，和为了对照实验结果，而分别配制的几种氨基酸的溶液，用微量点样管或毛细管，或血球计数器将5一j5微升的样品，点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。

点样后要自然风干，或冷风吹干。

最好不要用加热装置，如吹风机，灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。

因为加热装置在学生操作时，一但注意不够，掌握不好，则温度升高势必要使样品破坏，更会使佯品点干的太燥。

正是由于这样，样品点太干燥，使其样品物的分子，牢固地吸牢在层析纸的纤维上。

所以在展层过程中，样品点的每个物质分子，不能在层析纸上同时起步，而是形成了有先有后，鱼贯而上行或下行的状况，最终使洋品物质的分子，不能同时都集中到达一个位置。

致使在显色后，实验结果的图象上，观察到的不是一个完整的斑点，而是一个拖着尾巴的斑点。

这就是上述所说的拖尾现象。

　　纸上分配层析所出现的拖尾现象，究其原因很简单，就是在点样品后，样品点吹的太干燥所致。

样品点不要吹的太干燥，否则，样品物质的分子，会牢吸在层析纸的纤维上，出现拖尾现象”。

　　影响Rf值的主要因素

篇三：

柱色谱分离实验报告

　　柱色谱分离实验报告