喙荚云实枝叶提取物对肝癌细胞增殖的体外抑制作用研究概述.docx

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喙荚云实枝叶提取物对肝癌细胞增殖的体外抑制作用研究概述

编号：

20095111003

贵阳中医学院

GUIYANGCOLLEGEOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE

毕业论文

题目:

喙荚云实枝叶提取物对肝癌细

胞增殖的体外抑制作用研究

系（部）:

药学系

专业:

中药学

姓名:

林真欣

年级：

09级

指导教师:

黄勇其

完成时间:

2013年01月20日

贵阳中医学院本科毕业论文

诚信责任书

本人郑重声明：

本人所呈交的毕业论文，是在导师的指导下独立进行研究所完成。

毕业论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。

特此声明。

论文（设计）作者签名：

日期：

2013年01月20号

目录

摘要1

Abstract2

前言3

综述部分4

1植物基原4

1.1喙荚云实来源4

1.2喙荚云实形态4

2喙荚云实的化学成分5

2.1...................................................5

2.2………………………………………………………………...5

2.3………………………………………………………………….5

3喙荚云实的相关药理作用6

3.1抗病毒活性6

3.1.1抗Para3病毒6

3.1.2抗流感病毒活性6

3.2抗肿瘤（癌）活性6

3.3抑菌活性6

3.4保肝作用6

4小结6

实验部分7

第一部分：

实验样品的提取分离7

1．药用云实属植物喙荚云实的采集与鉴定…。

………………..7

1.1喙荚云实的采集7

1.2喙荚云实的鉴定7

2药材的提取分离实验仪器与试剂7

2.1仪器7

2.2试剂8

3提取分离技术路线9

4药材的提取10

4.1样品前处理10

4.2醇提物的制备10

4.3水提物的制备10

5分部位萃取11

5.1石油醚部位的萃取11

5.2乙酸乙酯部位的萃取11

5.3正丁醇部位的萃取11

5.4萃取后剩余部位的制备12

5.5回收率统计12

第二部分：

喙荚云实枝叶的肿瘤增殖抑制作用的体外试验13

1．实验材料13

1.1实验动物13

1.2实验瘤株13

1.3实验仪器13

1.4实验试剂13

2．实验方法14

2.1MTT法测定药物直接作用人肝癌细胞14

2.1.1实验样品14

2.1.2实验步骤14

2.1.3统计方法14

2.2MTT法测石油醚部位对人肝癌细胞作用强度..14

2.2.1实验样品14

2.2.2实验步骤15

2.3腹腔注射（ip）给药的含药血清作用（MTT法）15

2.3.1含药血清制备15

2.3.2实验步骤16

2.4灌胃（ig）给药的含药血清作用（MTT法）16

2.4.1含药血清制备16

2.4.2实验步骤16

3．实验结果18

4.讨论20

4.1实验样品的提取分离20

4.1.1样品的采集20

4.1.2样品的提取20

4.1.3萃取前处理21

4.2喙荚云实的肿瘤增殖抑制作用的体外试验21

4.2.1实验样品的制备21

4.2.2MTT法测定药物直接作用人肝癌细胞21

4.2.3MTT法测石油醚部位对人肝癌细胞（HuH-7）作用强度21

4.2.421

4.2.5腹腔注射（ip）给药的含药血清作用（MTT法）22

4.2.6灌胃（ig）给药的含药血清作用（MTT法）22

4.2.722

参考文献23

致谢24

附录25

喙荚云实枝叶提取物对肝癌细胞增殖的体外抑制作用研究

摘要

目的：

观察喙荚云实枝叶提取物对人肝癌细胞（HuH-7）和小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）的增殖抑制作用及IC50。

方法：

用溶剂法对喙荚云实枝叶进行不同极性部位提取，用MTT法筛选抑制肝癌细胞的活性部位及测定IC50。

ig、ip给药制作大白鼠含药血清并观察其对Hepa1-6细胞增殖作用的影响。

结果：

喙荚云实枝叶石油醚部位提取物在浓度为100μg/ml或20μg/ml时对HuH-7有明显抑制作用及IC50为58.90μg/ml。

以0.4g/kg对大白鼠ip给药，含药血清对Hepa1-6有明显的抑制作用但效果较弱（抑制率为32.0%）。

以2g/kg对大白鼠ig给药，含药血清对Hepa1-6无作用。

结论：

喙荚云实枝叶提取物的有效部位为石油醚部位，但作用较弱。

ig给药生物利用度较低。

[关键词]喙荚云实枝叶；提取物；含药血清；抑制作用；肝癌细胞；

BeakpodpharmacologicaleffectsofCaesalpinia

Abstract

Objective:

ObservedbeakpodCaesalpiniafoliageextractonhumanhepatomacell（HuH-7）andmousehepatomacells（Hepa1-6）inhibitedtheproliferationandIC50.Methods:

PodCaesalpiniabranchesandleavesbeakpolarfractionsusingsolventextraction,screeninginhibitionoftheactivesiteoflivercancercellsbyMTTassayanddeterminationofIC50of.ig、ipadministrationproducedratserumcontainingandobserveitsHepa1-6cellproliferation.Results:

BeakpodCaesalpiniafoliagepetroleumetherextractataconcentrationof100ug/mlor20μg/mlHuH-7therearetheobviousinhibitionandIC5058.90μg/ml.The0.4g/kgpairofratsadministeredip,containingserumonHepa1-6significantlyinhibitedbutweakereffect（inhibitionrateof32.0%）.igadministrationto2g/kgrats,serumcontainingnoroleHepa1-6.Conclusion:

BeakpodCaesalpiniafoliagepetroleumetherextracteffectiveparts,buttheeffectisweak.theigadministrationbioavailabilitycalledlow.

Keywords：

BeakedpodCaesalpiniafoliage;Extracts;Containingserum;Inhibition;Hepatomacells;

前言

喙荚云实为豆科云实属植物CaesalpiniaminaxHarce.。

现代研究表明，喙荚云实中含有萜类、黄酮类、脂肪酸类等多种化学成分。

具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、保肝等药理作用。

我们对喙荚云实枝叶进行提取，且用不同极性溶剂对提取液萃取，得到不同极性的化学部位，并进行体外抗癌活性筛选。

综述部分

喙荚云实的研究概况

1植物基原

1.1喙荚云实来源

喙荚云实C.minaxHarce.：

分布于华南及西南,生于海拔400~1500m的山沟、溪旁、灌丛及路边。

分布区的土壤类型多为黄壤、黄红壤、黄棕壤、红壤,主要分布区的植被类型为落叶-常绿阔叶混交林及常绿、落叶灌丛[3]。

种子、根人药；具清热解毒，散瘀止痛，风湿骨痛，跌打损伤等功效。

1.2喙荚云实形态

喙荚云实：

藤本；各部被短柔毛，有钩刺。

托叶锥状。

二回羽状复叶，长45厘米，叶轴具钩刺，被短柔毛，羽片5—8对，小叶6—12对，对生，长圆形或椭圆形，长2.5—4厘米，宽1—1.8厘米，先端圆钝或急尖，有细尖，基部圆形，微偏斜，两面沿中脉有短柔毛，小叶柄长约1毫米。

总状或圆锥花序顶生，长20—40厘米，花序轴有刺，被绒毛，多花；苞片卵状披针形，长1.5—2.5厘米，宽5—7毫米，先端短渐尖，早落；花梗长1.6—3.5厘米，先端具关节；被短柔毛；萼筒倒锥形，长7毫米，被黄色绒毛，萼片不等大，长圆形，长15—18毫米，宽约10毫米，两面有黄色绒毛，下方1片稍长，风帽状；花瓣5，白色，有紫色斑点，不等大，倒卵形，长约18毫米，宽12毫米，先端钝圆，外面及边缘有柔毛，上方1片较短；雄蕊10，较花瓣稍短，花丝下半部密被长柔毛；子房近无柄，密生细刺，花柱比雄蕊稍长，无毛。

荚果长圆形，长10—15厘米，宽4—5厘米，先端圆，有长5—25毫米的喙，稍扁，果瓣密生棕色针状刺。

种子4—8粒，椭圆形，似莲子，长18毫米，宽10毫米，铅灰色，一端稍凹，有环纹。

花期4—5月，果期7—9月。

2喙荚云实的化学成分

2.1吴兆华等[4]从体积分数为95%的乙醇溶液提取物中的化学成分进行了系统研究。

通过硅胶柱色谱、凝胶柱色谱和重结晶等方法从中分离得到了7个化合物,根据其波谱数据并结合文献,确定了这7个化合物的结构,分别鉴定为β-amyrin

（1）、Caffeine

（2）、CaesalminC（3）、CaesalminD（4）、CaesalpinF（5）、β-谷甾醇（β-sitosterol,6）、胡萝卜苷（Daucosterol,7）。

然后吴兆华等研究，从喙荚云实95%乙醇回流提取物中通过硅胶和凝胶等柱色谱以及重结晶等方法分离得到的1个化合物,根据其波谱数据并结合文献报道,确定了化合物的结构,为一新的呋喃二萜类化合物,命名为neocaesalpinL1

（1）[5]和另一个新的呋喃二萜类化合物，命名为喙荚云实星A（minaxinA）[6]。

2.2黄明堦等人通过喙荚云实种皮黄酮提取物溶解性试验、显色反应以及产品在不同诊断试剂中的紫外－可见吸收光谱等特征判断其基本构型，确定喙荚云实种皮中含有具有A-环邻位二羟基（6，7或7，8-）的二氢黄酮或二氢黄酮醇苷类化合物[7]。

2.3袁经权等[8]通过石油醚常温渗滤提取方法和甲酯衍生华技术，采用GC-MS联用分析手段对喙荚云实的脂肪酸甲酯化产物及挥发油成分进行了分离鉴定，共检出174个色谱峰，鉴定出其中的63个化合物。

结果显示不饱和脂肪酸类化合物是喙荚云实油脂的主要化学成分。

3喙荚云实的相关药理作用

3.1抗病毒活性

3.1.1抗Para3病毒：

有研究表明,喙荚云实的体积分数为95%的乙醇提取物有抗Para3病毒的活性,而其抗病毒作用的活性物质主要为二萜类化合物[9]。

3.1.2抗流感病毒活性：

苦石莲（喙荚云实种仁）的乙酸乙酯萃取物和caesalminC对流感甲型病毒活性的抑制作用最强[10]。

3.2抗肿瘤（癌）活性

余旭亚等[11－12]最早从喙荚云实中分离提纯出相对分子重量为19800的南蛇簕蛋白（CMP）。

当CMP浓度为22.0μg/ml时，CMP可抑制黑色素瘤细胞增殖60%（P<0.05），抑制率为96%（P<0.05），表明CMP对黑色素瘤细胞K17535M2的增殖具有抑制作用。

3.3抑菌活性

喙荚云实95%乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和镰刀菌有抑制作用，尤其对绿脓杆菌的抑菌效果较好，最低抑菌浓度（MIC）为0.25%，最低杀菌浓度（MBC）为0.5%[13]。

3.4保肝作用

刘明等[14]研究了喙荚云实60%乙醇提取物对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用。

结果表明，喙荚云实个剂量均能对抗四氯化碳引起的急性肝损伤小鼠血清ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）及肝脏系数升高，且这些作用均呈剂量依赖性，但具体护肝作用机理尚不清楚。

4.小结

综上所述，目前喙荚云实的开发利用尚处于起步阶段。

喙荚云实中含有萜类、黄酮类、脂肪酸类等多种化学成分。

具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、保肝等药理作用。

在抗癌方面，我认为有进一步的研究价值和较好的发展前景。

实验部分

第一部分：

实验样品的提取分离

1．药用云实属植物喙荚云实的采集与鉴定

1.1喙荚云实的采集

喙荚云实采自贵州省册亨县，采回的药材经由贵阳中医学院药学系何顺志教授鉴定为豆科云实属喙荚云实（C.minax）。

1.2喙荚云实的鉴定

喙荚云实C.minaxHanc荚果革质，长椭圆形，膨胀，不开裂，长10cm～14cm，宽4cm～4.5cm，顶端有喙，表面棕褐色，密生针状刺，味微苦甜，种子4～8颗，椭圆形，长1.7cm～1.8cm，宽0.9cm～1.1cm，黑褐色，表面有环状纹，味苦涩。

2．药材的提取分离实验仪器与试剂

2.1仪器：

BÜCHI旋转蒸发仪：

R-215瑞士步琪有限公司

BÜCHI水浴锅HeartingBath:

B-491瑞士步琪有限公司

循环水真空泵：

SHZ-D（Ⅲ）巩义市予华仪器责任有限公司

超声清洗仪：

SG8200HPT上海冠特超声仪器有限公司

电子调温电热套：

98-1-B10000ml天津泰斯特仪器有限公司

真空干燥箱：

DZ-2BCⅡ天津泰斯特仪器有限公司

长颈圆底烧瓶蜀牛GG-1710000ml1个；抽滤瓶10000ml1个；布氏漏斗1个；分液漏斗3000ml4个；圆底烧瓶2000ml2个；80cm冷凝管1个；蒸发皿若干

2.2试剂：

乙醇（EtOH）：

实用酒精

石油醚（Pe）：

AR分析纯，沸点60℃-90℃，批号：

20121019，成都市科龙化工试剂厂

乙酸乙酯（AcOET）：

AR分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：

20120312

正丁醇（n-BuOH）：

AR分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：

20110826

甲醇（MeOH）：

AR分析纯，天津市瑞金特化学品有限公司，批号：

20110613

3.提取分离技术路线

4.喙荚云实枝叶的提取

4.1样品前处理

将采集来的喙荚云实枝叶直接阴干；阴干后的药材分别粉碎，为方便实验中的热回流提取，粉碎时至粗粉即可，粒度过细有可能会导致回流提取时过滤的不便，甚至有可能在提取时出现糊化现象，然后保存，备用。

4.2醇提物的制备称取1000g喙荚云实的枝叶，用75%乙醇5000ml提取，沸腾后计时，提取时间2h，将药液滤出，药材残渣继续加乙醇提取，如此反复3次，将3次提取的的提取液合并后回收乙醇，残渣阴干后备用，得膏率见表1.1。

表1.1醇提物浸膏得膏率

名称代号药材用量（g）浸膏重量（g）得膏率（%）

喙荚云实枝叶醇提物CBL.E1000133.013.3

将3次回流提取得到的提取液合并后用旋转蒸发仪回收提取液中的乙醇，接收瓶内的乙醇可重复使用，回收瓶中的溶液转入至蒸发皿内，置于水浴锅上蒸干，蒸干后放入真空干燥箱真空干燥，得到的干浸膏用密封袋保存于玻璃干燥器中，备用。

4.3水提物的制备经过乙醇热回流提取后的药材残渣阴干后先用药材量12倍的蒸馏水浸泡2小时，然后用电热套加热2小时，过滤，滤渣继续加热提取1小时，蒸馏水用量为药材8倍，同样过滤后再次加热提取0.5小时，蒸馏水用量为药材的6倍；合并3次的滤液，浓缩至适量后转入蒸发皿中挥干，与醇提物一样挥干后放入真空干燥箱内真空干燥，密封袋保存置于玻璃干燥器内备用，所得浸膏得膏率见表1.2。

表1.2水提物浸膏得膏率

名称代号药材用量（g）浸膏重量（g）得膏率（%）

喙荚云实枝叶水提物CBL.W100042.64.26

5.分部位萃取同4.2方法另外称取适量喙荚云实枝叶的药材粗粉，用75%乙醇提取，药材量与乙醇用量认为1：

5，合并3次的提取液，用旋转蒸发仪回收提取液中的乙醇，回收瓶中的溶液转入蒸发皿内置于在水浴锅上挥发，待残存的乙醇挥干后加蒸馏水至3000ml，分成2份，各1500ml并转入3000ml分液漏斗中进行萃取，基于相似相容的萃取原理，萃取所用的试剂极性不同，本实验采用一般萃取规则由小极性到大极性依次萃取，从而可以将总提物中的各个极性部位分离出来。

5.1石油醚部位的萃取将已制备好的滤液转移至分液漏斗中，分液漏斗须得洗净后用适量真空油脂涂抹在活塞处，以防止漏液，按1:

1的比例量取石油醚进行萃取；加入石油醚萃取时要充分振摇，振摇3次后静置待其分层，极性较小的一些脂溶性成分通过振摇后会充分溶于石油醚中，而水溶液及水溶液中的大极性物质因为跟石油醚不相容而产生分层，且位于下层，故而从分液漏斗下面放出水溶液，再从上面倒出石油醚萃取液，多次萃取直至石油醚萃取层至无色时合并石油醚萃取层，通过用旋转蒸发仪回收石油醚后，将回收瓶中的萃取液转入蒸发皿中置于水浴锅上挥干，挥干后放入真空干燥箱内真空干燥，密封袋保存于玻璃干燥器中备用。

5.2乙酸乙酯部位的萃取石油醚部位萃取完全后将水溶液转置于大烧杯中水浴加热，挥发掉残余的石油醚，待挥发完全后按1:

1的比例量取乙酸乙酯进行萃取，分液漏斗同样要洗净并涂有真空油脂于活塞上，萃取步骤与石油醚萃取相同，多次重复直至萃取层溶液为无色，萃取液回收后合并挥干，挥干后放入真空干燥箱内真空干燥制成干浸膏，密封保存于干燥器内，备用。

5.3正丁醇部位的萃取乙酸乙酯萃取完全后同样水浴锅挥干残余的乙酸乙酯，转入分液漏斗中后按1:

1的比例量取正丁醇多次萃取直至萃取成无色，步骤与石油醚部位萃取相同，萃取完全后将萃取液回收并挥干放入真空干燥箱内真空干燥制成干浸膏，密闭保存备用。

5.4萃取后剩余部位的制备正丁醇萃取完成后的剩余部位转至蒸发皿中并置于水浴锅上浓缩，待全部水分蒸干后放进真空干燥箱内干燥制成干浸膏，最后密闭保存。

5.5回收率统计

整个萃取过程中所得到的浸膏须得称重后计算萃取率，并记录，见表1.3

表1.3分部位浸膏萃取率

名称代号生药材重量（g）萃取率（%）

喙荚云实枝叶石油醚部位CBL.P50016.04

喙荚云实枝叶乙酸乙酯部位CBL.A5008.52

喙荚云实枝叶正丁醇部位CBL.N50015.04

喙荚云实枝叶萃取后剩余部位CBL.S50019.05

第二部分：

喙荚云实枝叶的肿瘤增殖抑制作用的体外试验

1.实验材料

1.1实验动物：

大白鼠（Wistar），雌雄各半，体重180-200g，第三军医大学实验动物中心提供，动物合格证号：

SCXU（渝）2007-0005；自由进食与饮水。

1.2实验瘤株：

人肝癌细胞（HuH-7）及小鼠肝癌细胞（Hepa1-6）：

中科院上海细胞库提供。

1.3实验仪器

超净工作台：

型号：

BHC-1300ⅡA2，厂家：

苏州安泰

二氧化碳培养箱：

型号：

MCO-175，厂家：

日本三洋

倒置显微镜：

型号：

CKX-41，厂家：

OLYMPUS;

8联排移液器：

型号：

BRAND，厂家：

普立德

1000µl、200µl移液器：

型号：

EPPENDORF

96孔板：

厂家：

广州洁特

酶标仪：

型号：

2S-3型，厂家：

北京新风机电

1.4实验试剂

培养基（DMEM/HIGHGLUCOSE）：

厂家：

Hyclone，批号：

NXKO731

胎牛血清：

厂家：

Hyclone，批号：

NXCO582

胰蛋白酶：

厂家：

Hyclone，批号：

SH30042.01

MTT（噻唑蓝）：

厂家：

Amresco北京索莱宝公司分装，批号：

012013

二甲基亚砜（DMSO）：

厂家：

天津科密欧公司，批号：

2012062

一级食用菜籽油：

厂家：

道道全重庆粮油有限公司，批号：

2012.10.24

2.实验方法

2.1MTT法测定药物直接作用人肝癌细胞

2.1.1实验样品:

将CBL.P、CBL.A、CBL.N用二甲基亚砜（DMSO）溶解，配至浓度为1%，另外将CBL.S、CBL.W用生理盐水（NS）溶解，浓度为1%。

2.1.2实验步骤:

将人肝癌细胞（HuH-7）常规传代培养至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化处理，以含10%胎牛血清的新鲜培养基配制成浓度约为1×105的细胞悬浮液，紧接着将其接种在96孔培养板中，每孔接种200µl，于37℃下含5%CO2饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24小时，抽弃培养基。

设空白对照组，药物干预组及调零组；CBL.P、CBL.A、CBL.N样品的空白对照组加1%DMSO，CBL.S、CBL.W样品的空白对照组加生理盐水（NS）；药物干预组加入不同浓度的供试液；调零组则不加人肝癌细胞（HuH-7）；同样于37℃下二氧化碳培养箱中培养，48小时后，抽弃上清液，用培养液洗3次以去除药液，每孔加50µl浓度为5mg/ml的MTT无血清培养基，37℃培养4小时，小心抽弃上清液，加150µl二甲基亚砜（DMSO），摇床振荡10min，用酶标仪测570nm下光密度（OD）值，并按公式：

抑制率（％）＝（对照组OD值均值－样品组OD值均值）／对照组OD值均值×100％求其抑制率，设3个剂量，每个剂量平行3个复孔，实验重复2次。

用2.1.3统计方法处理2次实验数据，样品CBL.P、CBL.A、CBL.N与1％DMSO比较，样品CBL.S、CBL.W与NS比较。

实验结果见表2.1。

2.1.3统计方法

所有数据均采取统计学软件SPSSV16.0进行统计学处理分析，各项指标结果采用（X±S）表示。

组间数据比较：

若符合正态分布，采用完全随机设计资料单因素方差分析两两样本比较，其中方差齐性者采用LSD法检验，方差不齐者采用Dunnett's法检验。

本实验处理数据均用此统计方法。

2.2MTT法测石油醚部位对人肝癌细胞（HuH-7）作用强度

2.2.1实验样品:

根据初筛实验的结果可知，喙荚云实枝叶石油醚部位为有效活性部位，所以针对石油醚部位做作用强度试验，样品CBL.P用DMSO溶解，阳性对照药表柔比星用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解。

2.2.2实验步骤:

常规传代培养人肝癌细胞（HuH-7）至对数生长期，用0.25%胰蛋白酶消化处理，以含10%胎牛血清的新鲜培养基配制成浓度约为1×105的细胞悬浮液，紧接着将其接种在96孔培养板中，每孔接种200µl，于37℃下含5%CO2饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24小时，抽弃培养基。

设空白对照组（加1%DMSO），阳性对照组（加不同浓度的表柔比星），药物干预组（加入不同浓度的供试液）及调零组（不加人肝癌细胞（HuH-7））；同样于37℃下二氧化碳培养箱中培养，48小时后，抽弃上清液，用培养液洗3次以去除药液，每孔加50µl浓度为5mg/ml的MTT无血清培养基，37℃培养4小时，小心抽弃上清液，加150µl二甲基亚砜（DMSO），摇床振荡10min，用酶标仪测570nm下光密度（OD）值，并按公式：

抑